一种基于血清外泌体miRNA的PD诊断及分期试剂盒

一种基于血清外泌体mirna的pd诊断及分期试剂盒
技术领域
1.本发明涉及疾病诊断筛查试剂，具体涉及使用血清外泌体mirna进行pd诊断及分期。


背景技术：

2.帕金森病(pd)是一种发病隐匿、危害严重的神经退行性疾病(ndds)，至出现明显症状时da神经元已不可逆丢失达70％左右，所以对pd进行早期诊断至关重要。实时逆转录定量pcr(qrt-pcr)是一种主要用于检测各种样品中特定核酸相对表达量的方法，具有检测范围宽、敏感度和精度高，且避免交叉污染的特点，尤其适合在样品量少的情况下完成检测，在各种ndds的诊断方面均得到了广泛应用。
3.mirna是一类由18～25个核苷酸组成的非编码单链小分子rna。多项研究表明，外周血mirna在不同ndds中的水平变化已成为揭示其发展阶段的重要指标之一，但是循环mirna容易受到外周循环系统中丰富的rna酶(rnase)的降解作用的影响，不能准确反映中枢神经系统(cns)的状态，导致从循环mirna中筛选可用于临床诊断的标志物存在一定困难。
4.外泌体是一种几乎所有机体细胞都能分泌、直径大小为30～150nm的细胞外囊泡(evs)，在脑脊液、血液等体液中均可发现。mirna可从细胞中运送出来，并包裹进外泌体(即形成外泌体mirna)和argonaute 2蛋白等载体内，作为细胞间信息传递的信使。外泌体mirna(ex-mirna)可在多种ndds的诊断中发挥重要作用，相对循环mirna而言，ex-mirna主要具有以下优势：(1)mirna在外泌体中的平均含量(42％～48％)比在血浆中的平均含量(30％)高；(2)外泌体可以富集并稳定mirna，避免mirna被外周循环系统中存在的rnase降解；(3)外泌体可以自由穿越血脑屏障，直观反映中枢神经系统的状态变化；(4)外泌体rna的提取和测序、定量技术成熟。
5.中国专利cn110872628a公开了胞外囊泡的生物标记，例如hsa-mir-199a-3p等在癌症诊断中的用途，其同时指出胞外囊泡的生物标记，例如细胞因子、exodna的表达水平可以用于确定pd等退化性疾病处于老化状态。
6.目前根据序列相似性预测mirna的生物功能尚无实验依据，也未见到使用来源于血清外泌体的mirna进行pd早期诊断的报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种基于血清外泌体mirna的pd诊断及分期试剂盒，解决了现有技术中尚无法利用mirna对pd进行分期以实现早期诊断的难题。
8.为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
9.一种pd诊断试剂盒，包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量pcr引物(例如，seq.id.no.1、seq.id.no.2)，所述标志物为hsa-mir-374a-5p和/或hsa-mir-374b-5p。
10.一种pd患者分期(ⅱ期)试剂盒，包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量
pcr引物(例如，seq.id.no.4、seq.id.no.5)，所述标志物为hsa-mir-199a-3p和/或hsa-mir-195-5p。
11.一种pd患者分期(ⅲ期)试剂盒，包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量pcr引物(例如，seq.id.no.6)，所述标志物为hsa-mir-28-5p。
12.一种pd患者分期(ⅳ期)试剂盒，包括用于对标志物进行表达水平检测的实时定量pcr引物(例如，seq.id.no.3、seq.id.no.7)，所述标志物为hsa-mir-22-5p和/或hsa-mir-151a-5p。
13.一种pd诊断及分期试剂盒，包括用于对hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p中任意一种或两种标志物的表达水平进行检测的实时定量pcr引物，以及用于对hsa-mir-199a-3p、hsa-mir-195-5p、hsa-mir-28-5p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-151a-5p中任意一种或多种标志物的表达水平进行检测的实时定量pcr引物。
14.优选的，以上各标志物提取自外周血。
15.优选的，所述外周血采样量为5～15ml/个体(例如，9～11ml/个体)。
16.优选的，以上各标志物提取自外周血中的血清外泌体。
17.以上作为标志物的mirna(hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p、hsa-mir-199a-3p、hsa-mir-195-5p、hsa-mir-28-5p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-151a-5p)及其反转录本在制备pd早期诊断试剂盒、试剂中的应用。
18.以上作为标志物的mirna(hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p、hsa-mir-199a-3p、hsa-mir-195-5p、hsa-mir-28-5p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-151a-5p)及其反转录本在制备pd患者分期试剂盒、试剂中的应用。
19.以上实时定量pcr引物(序列如seq.id.no.1～seq.id.no.7所示的实时定量pcr扩增反应特异引物)在制备pd早期诊断试剂盒、试剂中的应用。
20.优选的，所述试剂盒还包括实时定量pcr扩增反应通用引物以及内参序列扩增引物(例如，seq.id.no.8和seq.id.no.9)。
21.以上实时定量pcr引物(序列如seq.id.no.1～seq.id.no.7所示的实时定量pcr扩增反应特异引物)在制备pd患者分期试剂盒、试剂中的应用。
22.优选的，所述试剂盒还包括实时定量pcr扩增反应通用引物以及内参序列扩增引物(例如，seq.id.no.8和seq.id.no.9)。
23.本发明的有益效果体现在：
24.本发明可通过检测pd患者特定序列的mirna的表达量水平，识别pd的不同发病阶段(例如，ⅱ期等早期阶段)，从而能够尽早采取治疗手段防止疾病进一步恶化。
25.进一步的，本发明采用的pd诊断及分期标志物的来源为外泌体mirna，与常用于检测的外周循环mirna相比，具有稳定性高、敏感性强，特异性好的优点。
附图说明
26.图1为不同个体外泌体mirna表达情况：a.hsa-mir-374a-5p；b.hsa-mir-374b-5p；*表示p《0.05，****表示p《0.0001；stage2\3\4对应表示ⅱ、ⅲ、ⅳ期。
27.图2为不同个体外泌体mirna表达情况：a.hsa-mir-199a-3p；b.hsa-mir-195-5p的表达情况；*表示p《0.05，**表示p《0.001，****表示p《0.0001；stage2\3\4对应表示ⅱ、ⅲ、
ⅳ
期。
28.图3为不同个体外泌体mirna(hsa-mir-28-5p)表达情况：****表示p《0.0001；stage2\3\4对应表示ⅱ、ⅲ、ⅳ期。
29.图4为不同个体外泌体mirna表达情况：a.hsa-mir-22-5p；b.hsa-mir-151a-5p；****表示p《0.0001；stage2\3\4对应表示ⅱ、ⅲ、ⅳ期。
30.图5a为运用roc曲线对hsa-mir-374a-5p的表达量水平的分析。
31.图5b为运用roc曲线对hsa-mir-374b-5p的表达量水平的分析。
32.图6a为运用roc曲线对hsa-mir-199a-3p的表达量水平的分析。
33.图6b为运用roc曲线对hsa-mir-195-5p的表达量水平的分析。
34.图7为运用roc曲线对hsa-mir-28-5p的表达量水平的分析。
35.图8a为运用roc曲线对hsa-mir-22-5p的表达量水平的分析。
36.图8b为运用roc曲线对hsa-mir-151a-5p的表达量水平的分析。
37.图9为不同分期pd患者的外周血外泌体mirna测序数据高斯核密度分布图。
具体实施方式
38.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
39.第一部分：pd诊断及分期流程试验
40.(一)收集个体外周血并提取血清外泌体，其中患者的纳入及排除标准如下：
41.1.1纳入标准
42.依据中华医学会《中国帕金森病的诊断标准(2016版)》：
43.1)原发性帕金森病患者。
44.2)h&y分期为ⅱ、ⅲ、ⅳ期的患者，具体分期标准如表1-0所示。
45.表1-0.h&y分期标准
[0046][0047]
3)年龄和性别不限。
[0048]
1.2排除标准
[0049]
1)不符合纳入标准的患者。
[0050]
2)alzheimer病、huntington舞蹈病、脑积水、脑囊虫、急性脑出血，及脑肿瘤患者等。
[0051]
3)有肝、肾、造血系统等严重原发疾病者。
[0052]
4)疑似或确有吸毒者，酗酒(每周》14单位，1单位＝8g纯酒精)或吸烟(每日》5根)者。
[0053]
5)依从性差，预计不能按照研究方案完成抽血及随访者。
[0054]
6)其他不适宜入选的情况。
[0055]
2.收集pd患者和正常对照(control)的外周血
[0056]
1)采用不含抗凝剂的血清管采集个体血液约10ml。
[0057]
2)室温静置30min，然后于4℃条件下静置3～5小时或过夜，以可见血块析出为准。
[0058]
3)4℃条件下3000g离心15min，小心将血清转移入新的15ml离心管中，最大程度保证血清质量。
[0059]
4)离心后获得的血清及时提取外泌体或保存于-80℃冰箱备用。
[0060]
3.提取外泌体
[0061]
1)超速离心机相关配件提前于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，超速离心管于紫外灯下照射过夜进行灭菌。
[0062]
2)于冰箱中取出血清，水浴融化，使用洁净pbs稀释至11ml，保持每管血清体积均相同。
[0063]
3)3000g、4℃离心10min，小心转移全部上清至新的15ml离心管。
[0064]
4)10000g、4℃离心30min；离心后转移上清至超速离心管，使用pbs配平。
[0065]
5)100000g、4℃离心70min，关闭离心机刹车；离心后留下约1.5ml上清，加入pbs重悬后配平。
[0066]
6)100000g、4℃离心70min，关闭离心机刹车；弃上清，至最底层剩余50～100μl；转移该底层剩余部分(主要含有血清外泌体)至无rna酶ep管，进行下一步实验或保存于-80℃冰箱备用。
[0067]
(二)高通量测序数据获得与预处理
[0068]
对来源于不同分期pd患者的外周血外泌体进行小rna高通量测序，共得到了103份mirna测序数据，使用tmm方法标准化后，绘制了高斯核密度分布图(图9)。结果显示，各样本表达量分布趋势基本一致，每百万碱基対对数值(log
2 counts per million,logcpm)多分布在-5到15之间，可以进行后续分析。按照样本对应的pd分期，将mirna测序数据分为正常对照(control)、ⅱ期(stage 2)、ⅲ期(stage 3)、ⅳ期(stage 4)，并运用edger和t检验两种方法对任意两组之间进行差异表达分析(即control与stage2相比，control与stage 3相比，control与stage 4相比，stage 2与stage 3相比，stage 2与stage4相比，stage 3与stage 4相比)，一共得到了185个差异表达的mirna。其中，通过egder方法得到的差异mirna有71个，通过t检验得到的差异mirna有158个，两种方法均显示出差异的mirna有44个。
[0069]
(三)通过wgcna筛选在pd的不同分期表达的mirna
[0070]
运用全部185个差异表达的mirna在pd各期构建聚类树，根据树之间的相异度建树，最后将聚类得到的模块进行融合。随后将所有生成的模块导出形成点-边文件，将其导入cytoscape并设置好对应的颜色即可得到可视化之后的共表达网络图。最终在正常对照组得到了9个有效模块，在ⅱ期得到了7个有效模块，在ⅲ期得到了7个有效模块，在ⅳ期得到了11个有效模块。
[0071]
在已经构建完成的各个不同分期的共表达网络中，为了进一步确定pd疾病进程中
各个分期之间的联系，筛选在整个pd发病过程中均发挥作用的mirna，将前一步建立的不同分期内部的mirna的节点关系转变为模块关系，寻找具有指征整个pd发病阶段特性的mirna。通过构建不同分期之间模块的连接，将在pd不同发病阶段都出现的mirna所在的模块连接起来。包含这些mirna的模块存在关联关系，模块中存在的相同mirna越多，则这两个模块之间的关联关系就越强，该模块在该疾病中起到的作用就越关键。据此，一共得到了21个模块和114个mirna。这些模块和mirna与pd的相关性较弱，为了对其进行进一步筛选，将前述得到的mirna与人类mirna疾病数据库(human mirna disease database,hmdd)中与pd相关的mirna做比对，删掉那些不能比对得上的mirna所在的模块，最终得到了11个pd相关性模块和30个pd相关性mirna。其中，在ⅱ期得到了2个模块，在ⅲ期得到了3个模块，在ⅳ期得到了6个模块；4个mirna(hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p、hsa-mir-19b-3p和hsa-mir-9-5p)与ⅱ、ⅲ、ⅳ期均相关，可能反映了pd不同分期共同的生物学特性。
[0072]
在通过wgcna得到反映pd演化过程的mirna后，对反映pd不同分期特征的各期特异性mirna进行了分析。在185个mirna中选择了部分mirna，再次通过wgcna构建pd各期的聚类树。与之前不同的是，在构建该期聚类树时，仅使用了该期与其他分期之间的差异mirna，这样的mirna一共有145个。同样地，在确定了软阈值β后(ⅱ期β＝0.43，其余β＝0.05)，得到了不同分期的聚类树并进行了模块融合，随后再次导入cytoscape得到可视化后的共表达网络图，最终在正常对照组得到了9个有效模块，在ⅱ期得到了11个有效模块，在ⅲ期得到了8个有效模块，在ⅳ期得到了9个有效模块。
[0073]
在得到的各个分期的共表达网络之后，为了得到反映pd不同分期具体生物学特点的mirna以揭示pd的阶段性疾病特征，通过对pd的每个阶段内部进行mirna功能富集分析，从生物学角度确认与pd疾病进展的不同时期联系密切的模块和mirna。运用tam数据库(version 2.0,http://www.lirmed.com/tam2/)对得到的各期模块中的mirna进行功能富集，选取错误发现率(false discovery rate,fdr)《0.05的条目，并选择了其中15种与pd发生发展密切相关的生物学功能，它们是：神经毒性(neurotoxicity)、衰老(aging)、细胞死亡(cell death)、细胞分化(cell differentiation)、nf-κb信号调节通路(regulation of nf-κb pathway)、激素调节信号通路(hormone-mediated signaling pathway)、炎症(inflammation)、神经干细胞分化(neural stem cell differentiation)、凋亡(apoptosis)、akt信号调节通路(regulation of akt pathway)、dna损伤反应(dnadamage response)、免疫反应(immune response)、干细胞调节(regulation of stem cell)、神经元发育(neuron development)和细胞重编程(cell reprogramming)。再将拥有这些功能条目的mirna所在的模块保留下来，得到了18个模块和88个mirna。为了加强这些模块和mirna与pd的相关性，将这些mirna与hmdd中pd相关mirna作比对，保留那些能够比对得上的mirna所在的模块，最终得到了16个pd相关性模块和25个pd相关性mirna。其中，在ⅱ期得到了5个模块，在ⅲ期得到了4个模块，在ⅳ期得到了7个模块；仅与ⅱ期特异性相关的mirna有3个，分别是hsa-mir-199a-3p、hsa-mir-195-5p和hsa-mir-28-3p。仅与ⅲ期特异性相关的mirna有1个，是hsa-mir-28-5p，仅与ⅳ期特异性相关的mirna有9个，分别是hsa-mir-151a-3p、hsa-mir-183-3p、hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-151a-5p、hsa-mir-205-5p、hsa-mir-29b-3p、hsa-mir-29c-3p、hsa-mir-30b-5p和hsa-mir-22-5p。这13个mirna可能是pd各期的特异性mirna，反映了pd发生发展过程中不同阶段的生物学特性。
[0074]
(四)通过受试者工作特性(receiver operator characteristic，roc)曲线分析和qrt-pcr实验筛选在pd的不同分期表达的mirna
[0075]
通过wgcna构建共表达网络、roc曲线分析和qrt-pcr实验等手段，最终筛选出了6个仅在血清外泌体中表达、具有pd不同分期诊断价值的mirna。它们是：hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p、hsa-mir-199a-3p、hsa-mir-28-5p、hsa-mir-22-5p和hsa-mir-151a-5p。
[0076]
第二部分：不同分期pd病例的获取及对具有pd不同分期诊断价值的mirna的分析
[0077]
(一)从西京医院神经内科和体检中心再次纳入了40例病人的外周血样本，就诊时间为2020年6月至2020年10月。其中正常对照10例，ⅱ期7例，ш期12例，ⅳ期11例。病例纳入和排除标准同前。
[0078]
(二)qrt-pcr检测
[0079]
1.引物
[0080]
qrt-pcr引物由上海sangon生物工程股份有限公司合成，引物序列如表1-1及表1-2所示：
[0081]
表1-1.mirna实时定量pcr扩增反应特异引物
[0082][0083][0084]
以上各mirna的实时定量pcr扩增反应通用引物为miscriptⅱrt kit(cat#218161,qiagen)中的引物。
[0085]
表1-2.实时定量pcr的内参序列扩增引物
[0086][0087]
2.反转录合成cdna
[0088]
1)在无rna酶离心管中配制如表2所示的反应体系混合液，轻轻吹打混匀，避免振荡；其中模板rna是通过将血清外泌体所含有的rna(即血清外泌体rna)采用trizol法提取而得到的总rna。
[0089]
表2.反转录反应体系
[0090][0091]
2)按表3所示步骤设置pcr仪的程序，待反应结束后即可得到cdna，可进行后续实验或保存于-20℃冰箱备用。
[0092]
表3.反转录流程
[0093][0094]
3.实时定量pcr反应
[0095]
1)将cdna样品(指每个个体定量外周血血清外泌体rna反转录产物)稀释5倍。
[0096]
2)配制如表4所示的反应体系混合液，轻轻吹打混匀，3000rpm常温离心，注意避光。
[0097]
表4.实时定量pcr反应体系
[0098][0099]
3)使用实时定量pcr仪进行扩增，按照表5所示步骤进行反应。
[0100]
表5.实时定量pcr反应程序
[0101]
[0102]
得到各组样品(不同分期pd患者和正常对照)的ct值后，分别依据公式2-δδct
计算出最终定量结果。所有实验均进行了3次重复，取3次结果的平均值。通过graphpad prism8进行统计学分析，使用one-way anova分析结果，组间差异运用dunnett's multiple comparisons检验。而后进行了受试者工作特性(receiver operator characteristic，roc)曲线分析。
[0103]
第三部分：pd诊断及分期结果验证
[0104]
3.1验证与各期均相关的mirna表达情况
[0105]
在前期(第一部分)得到的结果中，发现有2个mirna与ⅱ、ⅲ、ⅳ期均相关，它们是hsa-mir-374a-5p和hsa-mir-374b-5p。经过在40例病人中验证后，发现相对正常对照组，hsa-mir-374a-5p(图1a)和hsa-mir-374b-5p(图1b)的表达量水平在ⅱ、ⅲ、ⅳ期均表现出了差异(明显高于正常对照组；hsa-mir-374a-5p：control 1.032，ⅱ期3.431，ⅲ期7.503，ⅳ期6.393；hsa-mir-374b-5p：control 1.081，ⅱ期3.176，ⅲ期6.640，ⅳ期7.502)。
[0106]
通过roc曲线分析发现，hsa-mir-374a-5p(图5a)和hsa-mir-374b-5p(图5b)可以鉴别出ⅱ、ⅲ、ⅳ期和正常对照组。其中，hsa-mir-374a-5p的曲线下面积(auc)值及对应的95％置信区间(95％ci)分别为0.758(95％ci：57.21-99.40，p＝0.026)、0.780(95％ci：67.33-88.58，p《0.0001)和0.763(95％ci：62.13-90.36，p＝0.0012)；hsa-mir-374b-5p的auc值及对应的95％ci分别为0.798(95％ci：60.84-98.84，p＝0.0101)、0.742(95％ci：62.40-85.98，p＝0.0004)和0.761(95％ci：61.82-90.38，p＝0.0013)。
[0107]
3.2验证与ⅱ、ⅲ、ⅳ期分别特异性相关的mirna表达情况
[0108]
在前期(第一部分)得到的结果中，发现有2个mirna，即hsa-mir-199a-3p和hsa-mir-195-5p仅与ⅱ期特异性相关；有1个mirna，即hsa-mir-28-5p仅与ⅲ期特异性相关；有2个mirna仅与ⅳ期特异性相关，分别是hsa-mir-151a-5p和hsa-mir-22-5p。
[0109]
同样经过验证后，仅与ⅱ期特异性相关的2个mirna中，与control、ⅲ期和ⅳ期相比，hsa-mir-199a-3p(图2a)、hsa-mir-195-5p(图2b)的表达量水平仅在ⅱ期表现出了显著性差异(明显低于control、ⅲ期和ⅳ期；hsa-mir-199a-3p：control 1.018，ⅱ期0.2857，ⅲ期1.027，ⅳ期1.096；hsa-mir-195-5p：control 1.004，ⅱ期0.5966，ⅲ期1.069，ⅳ期1.522)；roc曲线的结果显示，hsa-mir-199a-3p可以将ⅱ期同ⅲ期、ⅳ期、正常对照组鉴别开来(图6a)，其auc值和对应的95％ci分别为0.738(95％ci：55.97-91.61，p＝0.0402)、0.729(95％ci：54.93-90.91，p＝0.0416)和0.756(95％ci：55.97-95.17，p＝0.0348)。而hsa-mir-195-5p不能将ⅱ期同ⅲ期、ⅳ期、正常对照组鉴别开来(图6b)。
[0110]
同样经过验证后，仅与ⅲ期特异性相关的1个mirna(hsa-mir-28-5p)，与control、ⅱ期和ⅳ期相比，表达量水平仅在ⅲ期表现出了显著性差异(明显高于control、ⅱ期和ⅳ期，图3；control 1.036，ⅱ期1.244，ⅲ期5.626，ⅳ期1.414)。roc曲线的结果显示，hsa-mir-28-5p可以将ⅲ期同ⅱ期、ⅳ期、正常对照组鉴别开来(图7)，其auc值和对应的95％ci分别为0.746(95％ci：63.47-85.68，p＝0.0004)、0.789(95％ci：64.07-93.67，p＝0.0103)和0.738(95％ci：61.69-85.93，p＝0.0019)。
[0111]
同样经过验证后，仅与ⅳ期特异性相关的2个mirna中，与control、ⅱ期和ⅲ期相比，hsa-mir-22-5p(图4a)、hsa-mir-151a-5p(图4b)的表达量水平仅在ⅳ期表现出了显著性差异(前者明显高于、后者明显低于control、ⅱ期和ⅲ期；hsa-mir-22-5p：
control1.063，ⅱ期1.115，ⅲ期1.454，ⅳ期4.945；hsa-mir-151a-5p：control 1.045，ⅱ期1.120，ⅲ期1.035，ⅳ期0.6633)。roc曲线的结果显示，hsa-mir-22-5p可以将ⅳ期同正常对照组、ⅱ期和ⅲ期鉴别开来(图8a)，其auc值和对应的95％ci分别为0.817(95％ci：70.23-93.12，p《0.0001)、0.773(95％ci：54.95-99.59，p＝0.0244)和0.700(95％ci：57.13-82.91，p＝0.0089)；hsa-mir-151a-5p可以将ⅳ期同正常对照组、ⅱ期和ⅲ期鉴别开来(图8b)，其auc值和对应的95％ci分别为0.741(95％ci：60.65-87.44，p＝0.0031)、0.796(95％ci：60.0-99.09，p＝0.0147)和0.708(95％ci：58.12-83.44，p＝0.0066)。
[0112]
3.3试剂盒判读
[0113]
根据验证结果，确定用于pd诊断的试剂盒所采用的标志物为hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-374b-5p，所依据的标志物相对表达量判定阈值为3，即高于该阈值(由于正常对照的相对表达水平约为1，故也可依据“有表达”)则判定个体为pd患者。
[0114]
根据验证结果，确定用于pd患者分期(ⅱ期)的试剂盒所采用的标志物为hsa-mir-199a-3p，所依据的标志物相对表达量判定阈值为0.3，即低于该阈值则判定pd患者分期为ⅱ期。根据验证结果，确定用于pd患者分期(ⅲ期)的试剂盒所采用的标志物为hsa-mir-28-5p，所依据的标志物相对表达量判定阈值为5，即高于该阈值则判定pd患者分期为ⅲ期。
[0115]
根据验证结果，确定用于pd患者分期(ⅳ期)的试剂盒所采用的标志物可以为hsa-mir-22-5p，所依据的标志物相对表达量判定阈值为5，即高于该阈值则判定pd患者分期为ⅳ期。确定用于pd患者分期(ⅳ期)的试剂盒所采用的标志物还可以为hsa-mir-151a-5p，所依据的标志物相对表达量判定阈值为0.7，即低于该阈值则判定pd患者分期为ⅳ期。
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结合临床症状验证，结果表明利用以上标志物进行试剂盒检测，可以精准地定位pd分期，从而能够有效帮助临床医生根据pd患者所处不同的疾病发展阶段开展不同治疗手段，可以为pd早期诊断和治疗提供了可靠的临床检验依据。