BCMA基因人源化非人动物的构建方法及应用与流程

bcma基因人源化非人动物的构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种bcma基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。


背景技术：

2.bcma(b cell maturation antigen)，也称tnfrsf17，是肿瘤坏死因子受体超家族(tnfreceptor superfamily,tnfrsf)的一员，在浆细胞、浆母细胞及扁桃体生发中心的b细胞高表达，在大多数记忆b细胞、t细胞和髓系细胞中不表达，而且其表达量随着b细胞的发育成熟而逐渐增加，是一种b淋巴细胞成熟的标志蛋白，对于b细胞的生存和自身免疫反应发挥重要作用。在组织水平上，bcma主要表达在脾脏、胸腺、骨髓等组织，在心脏，肾和肺中检测到较低水平表达。 bcma与其主要配体baff或april结合后会引发信号的级联反应，激活mapk/jnk，nf-κb等途径，诱导抗凋亡相关蛋白，如bcl-2、bcl-xl的表达，促进细胞的增殖和存活。
3.近年来，已经在胶质瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病等患者中发现 bcma的表达，尤其是在所有多发性骨髓瘤细胞上特异性高表达，使其成为了多发性骨髓瘤临床诊断的重要标志物和热门治疗靶点。目前处于临床前与临床阶段的靶向bcma免疫疗法主要包括抗体药物偶联物(adc)、双特异性抗体和嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cells，car
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t)，例如gsk的blenrep、amgen的amg-224、pfizer的elranatamab、regeneron的regn-5459 等等，这些药物在临床前及临床研究中表现出显著的疗效，为多发性骨髓瘤患者提供了更多的治疗选择。但治疗过程中出现的细胞因子风暴(cytokine release syndrome,crs)、脱靶效应等不良反应仍是亟待解决的问题，更多安全有效的bcma靶向免疫正在研究中。除了血液系统肿瘤，研究还发现 bcma与april结合介导的肿瘤细胞增殖在肝癌、卵巢癌、神经系统胶质瘤等实体瘤中起重要作用。此外，bcma与多种自身免疫性疾病有密切的关系，研究人员在风湿性关节炎病人的血清检测中，发现bcma的配体april表达明显增高，风湿关节炎累及滑膜表面的bcma表达亦增加；在系统性红斑狼疮患者中，bcma的表达水平明显增高，可能还与系统红斑狼疮的疾病活动情况相关；bcma还可作为炎性肠病(ibd)发病的候选易感基因，其多态性的单倍型可能与溃疡性结肠炎和肠易激综合症的易感性有关。
4.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细
胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
5.鉴于bcma在肿瘤及自身免疫性疾病等治疗领域的巨大应用潜力，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发bcma相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

6.本发明的第一方面，提供了一种人源化bcma蛋白，所述的人源化bcma蛋白包含人bcma 蛋白的全部或部分。
7.优选的，所述的人源化bcma蛋白包含人bcma蛋白胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
8.进一步优选的，所述的人源化bcma蛋白还包含人bcma蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
9.优选的，所述的人源化bcma蛋白包含人bcma蛋白的胞外区的全部或部分。
10.优选的，所述的人源化bcma蛋白中来自人bcma蛋白的部分包含人bcma蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含人bcma蛋白胞外区至少20个连续氨基酸，例如包含至少20、 30、40、45、46、47、48、49、50、54个连续氨基酸；优选包含seq id no：2第1-47位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第1-47位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：2第1-47位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq idno：2第1-47位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
11.优选的，所述的人源化bcma蛋白中来自人bcma蛋白的部分还包含seq id no：2第48-54 位所示氨基酸序列；或者，还包含与seq id no：2第48-54位所示氨基酸序列同一性至少为 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no： 2第48-54位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，还包含与seq id no：2第48-54位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
12.在一个具体实施方式中，所述的人源化bcma蛋白来自人bcma蛋白的部分包含人bcma 蛋白的跨膜区；或者包含人bcma蛋白的胞外区；或者包含人bcma蛋白的胞外区和跨膜区；或者包含人bcma蛋白的胞外区和胞质区；或者包含人bcma蛋白的跨膜区和胞质区。
13.优选的，所述的人源化bcma蛋白包含人bcma基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化bcma蛋白包含人bcma基因的 1号至3号外显子中的一种、两种、三种或连续两种外显子的组合编码的氨基酸序列的全
部或部分。更优选的，所述的人源化bcma蛋白包含人bcma基因的1号外显子和/或2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，更进一步优选的，所述的人源化bcma蛋白包含人bcma基因的 1号外显子的部分、2号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含50bp 的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、131、132、133、134、135、150、200、 240、245bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含1号外显子中编码胞外区的核苷酸序列，2号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、 50、70、90、100、130、140、147bp的核苷酸序列。
14.优选的，所述的人源化bcma蛋白包含seq id no：5所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。
15.优选的，所述的人源化bcma蛋白还包含非人动物bcma蛋白的部分。
16.优选的，所述的非人动物bcma蛋白的部分为至少包含非人动物bcma蛋白的跨膜区和/ 或胞质区的全部或部分。
17.在一个具体实施方式中，所述的非人动物bcma蛋白的部分包含至少包含人bcma蛋白的部分胞外区、非人动物bcma蛋白跨膜区和胞质区的全部或部分。
18.优选的，所述的非人动物bcma蛋白的部分还包含非人动物bcma基因的2号至3号外显子编码的氨基酸序列的部分，进一步优选的，包含2号外显子编码的部分和3号外显子编码的全部氨基酸序列，更进一步优选的，包含从2号外显子编码的第5个氨基酸起到3号外显子编码的最后一个氨基酸为止的氨基酸序列。
19.优选的，所述的非人动物bcma蛋白的部分包含seq id no：1第43-185位、50-185或71
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185位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：1第43-185位、50-185或71-185位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：1第43-185位、50-185或71-185位所示氨基酸序列差异不超过10、9、 8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：1第43-185位、50-185 或71-185位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
20.优选的，所述人源化bcma蛋白中来源于人bcma蛋白的氨基酸序列与seq id no：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或至少99％。
21.优选的，所述人源化bcma蛋白中来源于非人动物bcma蛋白的氨基酸序列与seq id no：1 所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或至少99％。
22.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化bcma蛋白中包含的人bcma蛋白的部分氨基酸序列包含下列组中的一种：
23.a)为seq id no：2第1-47位氨基酸序列的全部或部分；
24.b)与seq id no：2的第1-47位氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
25.c)与seq id no：2的第1-47位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
26.d)与seq id no：2的第1-47位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
27.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化bcma蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
28.a)为seq id no：11氨基酸序列的全部或部分；
29.b)与seq id no：11氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
30.c)与seq id no：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
31.d)与seq id no：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
32.优选的，所述人源化bcma蛋白包含至少20个氨基酸序列与人bcma的相应氨基酸序列相同，进一步地，所述47个氨基酸序列是胞外区的氨基酸序列或者所述47个氨基酸序列是从n 端起第一个氨基酸开始的氨基酸序列。
33.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
34.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
35.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
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prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
36.本发明的第二方面，提供了一种编码如上所述的人源化bcma蛋白的核酸。
37.本发明的第三方面，提供了一种人源化bcma基因，所述的人源化bcma基因包含人bcma 基因的部分。
38.优选的，所述的人源化bcma基因包含编码人bcma蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化bcma基因包含编码人bcma蛋白的跨膜区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。更优选的，所述的人源化bcma基因包含编码人 bcma蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，其中，所述的人bcma蛋白的胞外区的部分包含人bcma蛋白胞外区至少20个连续氨基酸，例如包含至少20、30、40、45、46、47、48、49、50、 54个连续氨基酸；更进一步优选的，所述的人bcma基因的部分包含编码seq id no：2第1-54 位或者第1-47位的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：2第1-54位或者第1-47位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码seq id no：2第1-54位或者第1-47位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、 6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码seq id no：2第1-54位或者第1-47 位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
39.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化bcma基因编码如上所述的人源化bcma 蛋白。
40.优选的，所述的人源化bcma基因包含人bcma基因的1号至3号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化bcma基因包含人bcma基因的1号至3号外显子中的一种、两
no：6和 /或seq id no：7所示的核苷酸序列。
53.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化bcma基因转录的mrna选自下列组中的一种：
54.(a)为seq id no：10所示核苷酸序列的全部或部分；
55.(b)与seq id no：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
56.(c)与seq id no：10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
57.(d)与seq id no：10所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
58.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
59.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
60.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
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prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
61.优选的，所述的人源化bcma基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
62.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet-off system/tet
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on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
63.本发明的第四方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
64.a)编码人或人源化bcma蛋白的核苷酸序列的全部或部分；
65.b)编码人bcma蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人 bcma蛋白的全部或部分胞外区的核苷酸序列，优选编码人bcma蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，例如包含至少20、30、40、45、46、47、48、49、50、54个连续氨基酸，进一步优选的，编码seq id no：2第1-47位氨基酸的核苷酸序列；
66.c)人或人源化bcma基因的核苷酸序列；或，
67.d)人bcma基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选人bcma基因的1号外显子的部分和2号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、 90、100、110、130、131、132、133、134、135、150、200、240、245bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含1号外显子中编码胞外区的核苷酸序列，2号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、50、70、90、100、130、140、147bp的核苷酸序列；进一步优选包含seq id no：5所示核苷酸序列；或者，包含与seq id no：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、
4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
68.优选的，所述的人源化bcma蛋白如上所述的人源化bcma蛋白。
69.优选的，所述的人源化bcma基因如上所述的人源化bcma基因。
70.优选的，所述的供体核苷酸序列还包含非人动物bcma基因的部分，进一步优选的，所述的人源化bcma基因还包括非人动物bcma基因2号外显子的部分。更优选的，所述的非人动物 bcma基因2号外显子的部分至少包含编码非人动物bcma跨膜区和/或胞质区的部分。更进一步优选的，所述的非人动物bcma基因2号外显子还包含编码部分胞外区的部分。
71.在一个具体实施方式中，所述的非人动物bcma基因2号外显子的部分包含编码seq idno：1的第43-91位的核苷酸序列。
72.优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的第一dna片段，即5’臂，其选自非人动物bcma基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：3或seq id no：14至少具有90％同源性，或者如seq id no：3或seqid no：14所示。
73.优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的第二dna片段，即3’臂，其选自非人动物bcma基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：4或seq id no：15至少具有90％同源性，或者如seq id no：4或seqid no：15所示。
74.所述的靶向载体还包含seq id no：6、7、8和/或9。
75.优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物bcma基因座。进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物bcma基因1号至3号外显子上，优选的，位于非人动物bcma基因 1号或2号外显子上。
76.优选的，所述的靶向载体还包含非人动物5’utr。
77.优选的，所述的靶向载体还包含非人动物3’utr。
78.优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
79.优选的，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
80.优选的，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
81.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
82.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
83.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫
缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
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prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
84.本发明的第五方面，提供了一种sgrna分子，所述的sgrna靶向非人动物bcma基因，同时所述sgrna的序列在待改变的bcma基因上的靶序列上是唯一的。
85.优选的，所述sgrna的靶位点位于bcma基因的1号外显子和/或2号外显子序列上。
86.进一步优选的，所述的sgrna的5’端靶位点序列如seq id no：16-20任一项所示，3’端靶位点序列如seq id no：21-26任一项所示。
87.在本发明的一个具体实施方式中，所述的sgrna靶向的5’端靶位点序列如seq id no：18 所示，3’端靶位点序列如seq id no：24所示。
88.本发明的第六方面，提供了一种编码上述sgrna的dna分子。
89.优选的，所述的dna分子的双链为sgrna的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。进一步优选为sgrna序列的5’端加上tagg，其互补链加上 aaac获得的。
90.在本发明的一个具体实施方式中，所述的dna分子可以为seq id no：27和seq id no： 29，seq id no：28和seq id no：30，seq id no：31和seq id no：33，或者，seq id no： 32和seq id no：34。
91.本发明的第七方面，提供了一种包含上述sgrna或者上述dna分子的sgrna载体。
92.本发明的第八方面，提供了一种sgrna载体的制备方法，其包括：
93.(i)提供上述sgrna，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述的sgrna靶向bcma基因，同时所述sgrna在待改变的bcma基因上的靶序列上是唯一的，所述的sgrna 的靶位点位于bcma基因的1号外显子和/或2号外显子上；
94.(ii)合成含有t7启动子及sgrna scaffold的片段dna，并将所述片段dna通过ecori 和bamhi酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pt7-sgrna载体；
95.(iii)将步骤(i)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(ii) 所述的pt7-sgrna载体的双链；
96.(iv)将步骤(iii)中退火的双链sgrna寡聚核苷酸分别与pt7-sgrna载体进行链接，筛选获得sgrna载体。
97.优选的，所述的步骤(ii)中所述t7启动子及sgrna scaffold的片段dna如seq id no： 35所示。
98.本发明的第九方面，提供了一种包含上述靶向载体、上述sgrna、dna分子或sgrna载体的细胞。
99.在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞包含上述的靶向载体和sgrna。
100.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
101.本发明的第十方面，提供了上述靶向载体、上述sgrna、dna分子或sgrna载体、上述制备方法获得的sgrna载体或者包含上述靶向载体或上述sgrna的细胞在bcma基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
102.本发明的第十一方面，提供了一种bcma基因人源化非人动物的构建方法，所述的
非人动物体内表达人或人源化bcma蛋白。
103.优选的，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化bcma基因。
104.优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的核酸。
105.优选的，所述的构建方法包括采用将供体核苷酸序列导入非人动物bcma基因座上。
106.优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
107.a)编码人或人源化bcma蛋白的核苷酸序列的全部或部分；
108.b)编码人bcma蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人 bcma蛋白的全部或部分胞外区的核苷酸序列，优选编码人bcma蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，例如包含至少20、30、40、45、46、47、48、49、50、54个连续氨基酸，进一步优选的，编码seq id no：2第1-47位氨基酸的核苷酸序列；
109.c)人或人源化bcma基因的核苷酸序列；或，
110.d)人bcma基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选人bcma基因的1号外显子的部分和2号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、 90、100、110、130、131、132、133、134、135、150、200、240、245bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分为1号外显子中编码胞外区的核苷酸序列，2号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、50、70、90、100、130、140、147bp的核苷酸序列；进一步优选包含seq id no：5所示核苷酸序列；或者，包含与seq id no：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
111.优选的，所述的人源化bcma蛋白为如上所述的人源化bcma蛋白。
112.优选的，所述的人源化bcma基因如上所述的人源化bcma基因。
113.优选的，所述的供体核苷酸序列还包含非人动物bcma基因的部分，进一步优选的，所述的人源化bcma基因还包括非人动物bcma基因2号外显子的部分。更优选的，所述的非人动物 bcma基因2号外显子的部分至少包含编码非人动物bcma跨膜区和/或胞质区的部分。更进一步优选的，所述的非人动物bcma基因2号外显子还包含编码部分胞外区的部分。
114.在一个具体实施方式中，所述的非人动物bcma基因2号外显子的部分包含编码seq idno：1的第43-91位的核苷酸序列。
115.优选的，所述的人源化bcma基因在非人动物体内通过内源或外源调控元件进行调控，优选通过内源调控元件进行调控。优选的，所述的调控元件为启动子。
116.优选的，所述的构建方法包括修饰非人动物bcma基因的编码框，将包含所述的外源核苷酸序列的核苷酸序列插入非人动物bcma基因内源调控元件之后，其中，所述的修饰非人动物 bcma基因的编码框可以采用敲除非人动物bcma基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物bcma蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能，进一步优选的，所述的修饰非人动物bcma基因的编码框可以为敲除非人动物bcma基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列。
117.优选的，所述的构建方法包括将编码人或人源化bcma蛋白的核苷酸序列或者人源
化 bcma基因的核苷酸序列导入非人动物bcma基因内源调控元件之后。
118.优选的，本技术中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
119.优选的，所述的导入为替换或插入，在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物bcma 基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物bcma基因的1号外显子和/或2号外显子被替换，更优选的，非人动物的1-2号内含子也被替换。
120.优选的，非人动物基因组中编码内源bcma蛋白胞外区的核苷酸序列的全部或部分被替换，进一步优选的，非人动物基因组中编码seq id no:1的第1-42位的核苷酸序列被替换。
121.优选的，所述的构建方法包括用包含编码人bcma蛋白的全部或部分核苷酸序列插入或替换到非人动物bcma基因座上。
122.优选的，所述的构建方法包括用包含编码人bcma蛋白的cdna序列插入或替换到非人动物bcma基因座上。
123.优选的，所述的构建方法包括用包含所述人源化bcma基因的核苷酸序列插入或替换到非人动物bcma基因座上。
124.优选的，所述的构建方法包括用包含编码所述人源化bcma蛋白的核苷酸序列插入或替换到非人动物bcma基因座上。
125.优选的，所述的插入或替换位点为bcma基因的内源调控元件之后。
126.优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源bcma基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源bcma基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
127.优选的，所述的bcma基因人源化非人动物中人或人源化bcma基因对于被替换的内源 bcma基因座是纯合或杂合的。
128.优选的，所述bcma基因人源化非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人或人源化 bcma基因。
129.优选的，所述的bcma基因人源化非人动物中至少一个细胞表达人或人源化bcma蛋白。
130.优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
131.优选的，所述的构建方法包括使用本发明所述的靶向载体和/或sgrna进行非人动物的构建。
132.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向bcma基因的 sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得bcma基因人源化的非人动物。
133.在本发明的另一个具体实施方式中，所述构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物的胚胎干细胞中，短暂培养后导入事先分离好的囊胚中，得到的嵌合囊胚移植至受体母鼠的输卵管中，允许其发育，鉴定筛选获得bcma基因人源化的非人动物。
134.根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将bcma基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
135.优选的，所述的其他基因为pd-1、pd-l1、il4r、il6r、il17、cd3、cd28和cd38中的至少一种基因。
136.优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的pd-1、pd-l1、il4r、il6r、il17、cd3、cd28和 cd38蛋白中的至少一种。
137.本发明的第十二方面，提供了一种bcma基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化bcma蛋白。
138.优选的，所述的非人动物内源bcma蛋白表达降低或缺失。
139.优选的，所述的人源化bcma蛋白为如上所述的的人源化bcma蛋白。
140.优选的，所述的非人动物的基因组中包含人bcma基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化bcma基因。
141.优选的，所述的人源化bcma基因为如上所述的人源化bcma基因。
142.优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的核酸。
143.优选的，所述的人或人源化bcma基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。
144.优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自pd-1、pd-l1、il4r、 il6r、il17、cd3、cd28和cd38中的至少一种，所述bcma基因和所述其他基因对于被替换的内源基因座任选为纯合或杂合。
145.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
146.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
147.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑ꢀ
prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
148.优选的，所述的非人动物是使用基因编辑技术构建的，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
149.在一个具体实施方式中，所述的非人动物是使用所述的靶向载体和/或sgrna构建的。
150.优选的，所述的非人动物是用本发明所述的构建方法构建的。
151.本发明的第十二方面，提供了一种bcma基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失bcma 基因的全部或部分核苷酸序列。
152.优选的，所述的非人动物缺失内源bcma基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失1号至3号外显子中的一种、两种、三种或连续两种外显子的组合的核苷酸
序列的全部或部分，进一步优选的，所述的缺失1号至2号外显子的全部或部分，进一步优选的，缺失 1号外显子的全部、2号外显子的部分核苷酸序列。更进一步优选的，缺失1号外显子的部分、 2号外显子的部分核苷酸序列。更进一步优选的，所述的1号外显子的部分为编码区。在一个具体实施方式中，缺失1号外显子的部分、1-2内含子、2号外显子的部分核苷酸序列。
153.优选的，所述的非人动物缺失编码胞质区、跨膜区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的非人动物缺失编码胞外区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物缺失编码胞外区的部分核苷酸序列。
154.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
155.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
156.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑ꢀ
prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
157.本发明的第十三方面，提供了一种bcma基因敲除的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括使用所述的sgrna分子进行非人动物的构建。其中，所述的sgrna靶向非人动物bcma 基因，同时所述sgrna的序列在待改变的bcma基因上的靶序列上是唯一的。
158.优选的，所述sgrna的靶位点位于bcma基因的1号外显子和/或2号外显子序列上。
159.进一步优选的，所述的sgrna靶向的5’端靶位点序列如seq id no：16-20任一项所示， 3’端靶位点序列如seq id no：21-26任一项所示。
160.优选的，所述的构建方法包括采用如上所述的靶向载体进行非人动物的构建。
161.本发明的第十四方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
162.i)提供上述的非人动物，或者采用上述构建方法获得的非人动物；
163.ii)将步骤i)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
164.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因pd-1、pd-l1、il4r、il6r、il17、cd3、cd28或cd38人源化的非人动物。
165.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
166.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
167.本发明的第十五方面，提供了一种上述构建方法获得的bcma基因人源化的非人动物、 bcma基因敲除的非人动物或者多基因修饰的非人动物或其子代。
168.本发明的第十六方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物，或者，上述的非人动物或其子代。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症疾病模型。
169.本发明的第十七方面，提供了一种动物模型的制备方法，所述的制备方法包括构建上述的bcma 基因人源化的非人动物、bcma基因敲除的非人动物或者多基因修饰的非人动物或其子代的步骤。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症模型。更优选的，所述构建方法还包括植入肿瘤细胞的步骤。
170.本发明的第十八方面，提供了上述的bcma基因人源化的非人动物、bcma基因敲除的非人动物、多基因修饰的非人动物或其子代、或者上述的构建方法获得的bcma基因人源化的非人动物、 bcma基因敲除的非人动物、多基因修饰的非人动物或其子代在制备动物模型中的应用。
171.本发明的第十九方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述动物模型。
172.优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育成动物个体。
173.本发明的第二十方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述动物模型。
174.优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育成动物个体。
175.本发明的第二十一方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述动物模型。
176.本发明的第二十二方面，提供了一种bcma基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化 bcma蛋白。
177.优选的，所述的人源化bcma蛋白为本发明第一方面所述的人源化bcma蛋白。
178.优选的，所述细胞中内源bcma蛋白表达降低或缺失。
179.优选的，所述的细胞的基因组中包含人bcma基因的全部或部分。进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化bcma基因。
180.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
181.本发明的第二十三方面，提供了一种bcma基因敲除的细胞，所述的细胞中缺失bcma基因的全部或部分核苷酸序列。
182.优选的，所述的细胞缺失bcma基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失1 号至3号外显子中的一种、两种、三种或连续两种外显子的组合的核苷酸序列的全部或部分。更进一步优选的，缺失1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分核苷酸序列。最为优选的，缺失1号外显子的部分、1-2内含子、2号外显子的部分核苷酸序列。
183.优选的，所述的细胞缺失编码胞质区、跨膜区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的细胞缺失编码胞外区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞缺失编码胞外区的部分核苷酸序列。
184.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
185.本发明的第二十四方面，提供了一种表达上述的人源化bcma蛋白的构建体。优选的，所述的构建体包含人源化bcma基因。
186.本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
187.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
188.本发明的第二十六方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
189.优选的，所述的组织不能发育成动物个体。
190.本发明的第二十七方面，提供了来源于上述的人源化bcma蛋白、上述的人源化bcma基因、上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物、上述的动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织或上述的构建体的应用，所述的应用包含：
191.(a)涉及人类细胞的与bcma相关的免疫过程的产品开发中的应用；
192.(b)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与bcma相关的模型系统中的应用；
193.(c)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与bcma相关的病原学研究和/或用于开发诊断策
194.略和/或用于开发治疗策略中的应用；
195.(d)在体内研究人bcma信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；
196.或者，
197.(e)研究bcma基因功能，研究针对人bcma靶位点的药物、药效，研究与bcma相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
198.优选的，所述应用为非疾病的治疗和诊断目的。
199.本发明的第二十八方面，提供了一种人bcma特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向动物模型的个体施加调节剂，检测调节剂对人bcma功能的影响。优选的，所述动物模型为荷瘤动物模型。所述筛选方法包括检测调节剂对肿瘤的影响。
200.优选的，所述的调节剂选自car-t、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。
201.优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
202.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
203.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
204.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
205.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
206.优选的，所述人bcma特异性调节剂的筛选方法为非治疗方法。
207.在本技术的一个实施方案中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
208.本发明的第二十九方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向动物模型施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行对人bcma功能的影响的检测和评价。优选的，所述动物模型为荷瘤动物模型。
209.优选的，所述的干预方案选自car-t、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。
210.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
211.优选的，所述干预方案的评价方法为非治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
212.本发明的第三十方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备人bcma特异性调节剂中的用途。
213.本发明的第三十一方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或自身免疫疾病的药物中的用途。
214.本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
215.本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
216.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
217.本发明所述的bcma基因人源化的非人动物，其体内可以正常表达人或人源化bcma蛋白，可用于针对人bcma靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究bcma蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。
218.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
219.本发明所述的“人源化bcma蛋白”，包含来源于人bcma蛋白的部分和非人bcma蛋白的部分。其中，所述的“人bcma蛋白”同人bcma蛋白的全部，即其氨基酸序列与人bcma蛋白的
全长氨基酸序列一致。所述的“人bcma蛋白的部分”，为连续或间隔的5-184个氨基酸序列与人bcma蛋白的氨基酸序列一致。优选为连续或间隔10-47个，更优选为连续5、10、20、30、40、 47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、184个氨基酸序列与人bcma蛋白的氨基酸序列一致。
220.本发明所述的“人bcma蛋白的跨膜区的全部”、“人bcma蛋白的胞质区的全部”或“人 bcma蛋白的胞外区的全部”，代表其氨基酸序列分别与人bcma蛋白的跨膜区、胞质区或胞外区的全长氨基酸序列一致。
221.本发明所述的“人bcma蛋白的跨膜区的部分”，为连续或间隔的5-23个氨基酸序列与人 bcma蛋白的跨膜区氨基酸序列一致，优选为连续5、10、15、20、23个氨基酸序列与人bcma 蛋白的跨膜区氨基酸序列一致。
222.本发明所述的“人bcma蛋白的胞质区的部分”，为连续或间隔5-107个氨基酸序列与人 bcma蛋白的胞质区氨基酸序列一致，优选为连续5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或107个氨基酸序列与人bcma蛋白的胞质区氨基酸序列一致。
223.本发明所述的“人bcma蛋白的胞外区的部分”，为连续或间隔5-54个氨基酸序列与人 bcma蛋白的胞外区氨基酸序列一致，优选为连续5、10、20、30、40、47、54个氨基酸序列与人bcma蛋白的胞外区氨基酸序列一致。
224.本发明所述的“非人动物bcma蛋白的部分”，为连续或间隔5-185个氨基酸序列与非人动物 bcma蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔10-144个，更优选为连续5、10、20、30、40、 50、60、70、80、82、90、100、110、120、130、140、144、150、160、170、180、185个氨基酸序列与非人动物bcma蛋白的氨基酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的组成人源化 bcma蛋白的非人动物bcma蛋白的部分至少包含非人动物胞质区的氨基酸序列。
225.本发明所述的“人源化bcma基因”，包含来源于人bcma基因的部分和非人bcma基因的部分。其中，所述的“人bcma基因”同人bcma基因的全部，即其核苷酸序列与人bcma基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人bcma基因的部分”为连续或间隔的20-2859bp个核苷酸序列与人 bcma基因的核苷酸序列一致，优选为20-891、20-854、20-141、20-600或20-257bp个，更优选为 20、50、100、141、200、257、300、400、500、600、690、700、800、854、891、1000、1500、 2000、2500、2800、2859bp个核苷酸序列与人bcma基因的核苷酸序列一致。
226.本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人bcma基因的1号外显子的部分，包含连续或间隔的5-245bp个，优选10-130bp个核苷酸序列与人bcma基因的1号外显子核苷酸序列一致。例如人bcma基因的2号外显子的部分，包含连续或间隔的5-147bp个，优选5-11bp个核苷酸序列与人bcma 基因的2号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人bcma基因”中包含的“1号外显子的部分”至少包括从编码胞外区的第一个核苷酸序列开始至1号外显子的最后一个核苷酸序列为止。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化bcma基因”中包含的“2号外显子的部分”至少包括从2号外显子的第一个核苷酸序列开始的连续11个核苷酸序列。
227.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子
及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至3号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子和3号外显子的全部核苷酸序列。
228.本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
229.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“bcma基因座”表示bcma 基因1号至3号外显子上的任选一段的dna片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的bcma 基因座可以是bcma基因1号至3号外显子上的任选一段的dna片段。
230.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre-mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、 sgrna、trna。
231.本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
232.本发明所述的“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％， 11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％， 41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％， 56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％， 89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％， 99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
233.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
234.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecularcloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschand maniatis(cold spring harborlaboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization (b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)； culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irlpress，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods inenzymology(j.abelson and m.simon，eds.inchief，academic press，inc.，new york)， specifically，vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel， ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold springharbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.， academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir andc.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratorypress，cold spring harbor，n.y.，1986)。
235.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。
236.在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
237.在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、 a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、 dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和 c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠及nod、 nod/scid、nod-prkdc
scid il-2rg
null
背景的小鼠。
238.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
239.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
240.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
241.图1：小鼠bcma基因和人bcma基因座对比示意图(非按比例)；
242.图2：小鼠bcma基因人源化改造示意图(非按比例)；
243.图3：bcma基因打靶策略及靶向载体v1设计示意图(非按比例)；
244.图4：f1代基因型鉴定结果，其中m为marker，wt为野生型对照，h2o为水对照；
245.图5：bcma基因打靶策略及靶向载体v2设计示意图(非按比例)；
246.图6：cas9/sgrna活性检测结果，其中con为空白对照，pc为阳性对照；
247.图7：f0代小鼠基因型鉴定结果，其中m为marker，wt为野生型对照，h2o为水对照；
248.图8：f1代小鼠基因型鉴定结果，其中wt为野生型对照，m为marker，h2o为水对照；
249.图9：southern blot检测结果，其中wt为野生型对照；
250.图10：rt-pcr检测结果，其中wt为野生型c57bl/6小鼠，h/h为bcma基因人源化纯合子小鼠，h2o为水对照；
251.图11：基因敲除小鼠鼠尾pcr鉴定结果，其中wt为野生型，h2o为水对照。
具体实施方式
252.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
253.在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
254.bbsi、ecori、bamhi、bglii、spei酶购自neb，货号分别为r0539l、r0101m、r0136m、r0144m、 r0133m；
255.c57bl/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
256.ambion体外转录试剂盒购自ambion，货号am1354；
257.cas9mrna来源sigma，货号cas9mrna-1ea；
258.uca试剂盒来源百奥赛图公司，货号bcg-dx-001。
259.实施例1bcma基因人源化小鼠
260.小鼠bcma基因(ncbi gene id：21935，primary source：mgi：1343050，uniprot：o88472，位于16号染色体nc_000082.7的第11131131至11137938位，基于转录本nm_011608.1及其编码蛋白np_035738.1(seq id no：1))和人bcma基因(ncbi gene id：608，primary source： hgnc：11913，uniprot id：q02223，位于16号染色体nc_000016.10的第11965210至11968068 位，基于转录本nm_001192.3及其编码蛋白np_001183.2(seq id no：2))对比示意图如图1所示。
261.为了达到本发明的目的，可在小鼠内源bcma基因座引入编码人bcma蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化bcma蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠bcma基因调节元件的控制下，用编码人bcma蛋白的核苷酸序列替换小鼠相应序列，得到人源化bcma基因座示意图如图2所示，实现对小鼠bcma基因的人源化改造。
262.进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体v1上含有小鼠bcma基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人bcma蛋白的核苷酸序列的a片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：3)与ncbi登录号为nc_000082.7的第11126899至11131816位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：4)与ncbi登录号为nc_000082.7的第 11133528至11138756位核苷酸序列相同；a片段上包含的人bcma序列(seq id no：5)与 ncbi登录号为nc_000016.10的第11965325至11966205位核苷酸序列相同；a片段中人bcma序列上游与小鼠的连接设计为5
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ctgtccactcttcccgtttctttcagtgatccagtccctcatgttgcagatggctgggcagtgctcccaaaatgaatatt-3’(seq id no：6)，其中序列“ccctc”的最后一个“c”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“atgtt”中的“a”是人的第一个核苷酸；人 bcma序列下游与小鼠的连接设计为5
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attatctgtctgatgttcttttcataaaggtgtgac
caattcagtgaaagggacgtacacggtgctctggatcttcttgg-3’(seq id no：7)，其中序列“ccaat”中的“t”是人的最后一个核苷酸，序列“tcagt”中的第一个“t”是小鼠的第一个核苷酸。
263.靶向载体v1上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neocassette)。其中neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为5
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caacaaatgaaacccaccaactattccccaaacaaaacaaagtactctcgaggtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattccgaag-3’(seq id no：8)，其中序列“aaacaa”中的最后一个“a”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“agtac”中的第一个“a”是neo盒的第一个核苷酸；neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为 5
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ctctagaaagtataggaacttcatcagtcaggtacataatggtggatccaccagagacattggacacctactttgcagtcgcctttctt-3’(seq id no：9)，其中序列“gatcc”中的最后一个“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列“accag”中的第一个“a”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。改造后的人源化小鼠bcma的 mrna序列如seq id no：10所示，表达的蛋白序列如seq id no：11所示。
264.靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到bcma基因人源化纯合子小鼠。可通过pcr方法鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物序列及目的片段长度见表1)，示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图4，其中，编号为f1-01、f1-04、f1-05的3 只小鼠为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代的bcma基因人源化小鼠。
265.表1 f1代基因型pcr检测引物序列及重组片段大小
[0266][0267]
此外，还可引入crispr/cas系统进行基因编辑，设计如图5所示的打靶策略，图中显示了靶向载体v2上含有小鼠bcma基因上游和下游的同源臂序列，以及人bcma核苷酸序列。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：14)与ncbi登录号为nc_000082.7的第11129848至 11131816位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：15)与ncbi登录号为nc_000082.7的第11133050至11133997位核苷酸序列相同，人bcma核苷酸序列如seq id no：5 所示。
[0268]
鉴于人bcma和鼠bcma具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
[0269]
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于
后续实验。
[0270]
靶序列决定了sgrna的靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgrna表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgrna序列，各sgrna在 bcma基因上的靶序列如下：
[0271]
sgrna1靶位点(seq id no：16)：5
’‑
ggaaacactgttgcgccatgagg-3’[0272]
sgrna2靶位点(seq id no：17)：5
’‑
gctgaggactcgcacttacttgg-3’[0273]
sgrna3靶位点(seq id no：18)：5
’‑
ttggaacatcgcaagtgacacgg-3’[0274]
sgrna4靶位点(seq id no：19)：5
’‑
cctcagctgtcgcttcttgt ggg-3’[0275]
sgrna5靶位点(seq id no：20)：5
’‑
cacttacttggatcacagtaagg-3’[0276]
sgrna6靶位点(seq id no：21)：5
’‑
tgaatgtgcgttaggggacctgg-3’[0277]
sgrna7靶位点(seq id no：22)：5
’‑
tgtcgggaagccgtcatgcctgg-3’[0278]
sgrna8靶位点(seq id no：23)：5
’‑
cgctcatgaatgtgcgttagggg-3’[0279]
sgrna9靶位点(seq id no：24)：5
’‑
attcatgagcgtcttactggggg-3’[0280]
sgrna10靶位点(seq id no：25)：5
’‑
acgctcatgaatgtgcgttaggg-3’[0281]
sgrna11靶位点(seq id no：26)：5
’‑
cacattcatgagcgtcttactgg-3’[0282]
利用uca试剂盒检测多个sgrna的活性，从结果可见sgrna具有不同活性，检测结果见表2 和图6。从中选择sgrna3和sgrna9进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表3)，退火后将退火产物连接至pt7-sgrna质粒(质粒先用bbsi 线性化)，获得表达载体pt7-bcma-3和pt7-bcma-9。
[0283]
表2 sgrna活性检测结果
[0284][0285]
表3 sgrna3和sgrna9序列列表
[0286][0287][0288]
pt7-sgrna载体由质粒合成公司合成含有t7启动子及sgrna scaffold的片段dna(seq idno：35)并依次通过酶切(ecori及bamhi)连接至骨架载体(来源takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
pcr。具体来说，分别选取13周龄野生型c57bl/6雌性小鼠和本实施例制备的bcma基因人源化纯合子雌性小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏组织，设计如表6所示引物序列对c57bl/6小鼠和bcma基因人源化纯合子小鼠脾脏细胞的mrna表达情况进行检测，结果如图10所示。从图中可以看出，在野生型c57bl/6小鼠体内仅能检测出鼠bcma mrna(图10a)；在bcma基因人源化纯合子小鼠体内仅检测到人源化bcma mrna(图10b)。
[0305]
表6 rt-pcr引物序列及重组片段大小
[0306][0307]
此外，由于cas9的切割造成基因组dna的双链断裂，通过染色体同源重组的修复方式会随机产生插入/缺失突变，可能得到bcma蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物用于检测基因敲除小鼠，检测结果如图11所示，经测序进一步验证编号ko-12、ko-13、ko-14、ko-15和ko-16 的小鼠为bcma基因敲除小鼠。引物分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，引物序列及重组片段大小如表7所示。
[0308]
表7：bcma基因敲除鼠基因型鉴定pcr引物序列及重组片段大小
[0309][0310]
实施例2双重人源化或多重双人源化小鼠的制备
[0311]
利用本方法或制得的bcma基因人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有pd-1、pd-l1、il4r、il6r、 il17、cd3、cd28、cd38等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化bcma小鼠的基础上，利用分离小鼠es胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得bcma与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的bcma小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化bcma与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人bcma和其它基因调节剂的体内药效验证等。
[0312]
实施例3药效验证
[0313]
利用本方法制得的bcma基因人源化小鼠或多基因修饰的小鼠可以用于评估靶向人bcma抗体、核酸药物或细胞疗法的药效。例如，取bcma基因人源化纯合子小鼠构建肿瘤动物模型，将小鼠分为对照组或治疗组，治疗组注射靶向人bcma的抗体药物、核酸药物或细胞治疗药物，对照组注射等体积的生理盐水。然后对各组小鼠的体重、肿瘤体积和肿瘤相关指
标进行监测，可有效评估抗体药物在人源化bcma小鼠体内的安全性和体内药效。
[0314]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0315]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0316]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。