一种血管紧张素转化酶抑制剂专用纸芯片及检测分析方法

技术特征：
1.一种专用于血管紧张素转化酶抑制剂筛选的纸芯片，其特征在于：纸芯片由两层色谱纸组成；第一层色谱纸上设计有平行的圆形反应区域；第二层色谱纸与第一层反应区域对应的位置上设计液体流动通道；所述的色谱纸为黑色，采用黑色蜡打印，圆形的样品加载区和液体流动通道为亲水区域，其余均为疏水区；所述圆形反应区域直径0.60cm～1.0cm；所述液体流动通道长0.8cm～1.2cm，宽0.25cm～0.45cm。2.一种用纸芯片进行血管紧张素转化酶抑制剂检测分析方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：用喷蜡打印机按照本发明设计打印出专用于血管紧张素转化酶抑制剂筛选的纸芯片，经磁性半自动热压印机加热，将固体石蜡融化并完全渗透纸张形成疏水阻断或堤坝；步骤2：检测前配制hgg母液、茚三酮溶液、hcl溶液、卡托普利母液、天麻素母液、乙酰天麻素母液和甘氨酸二肽母液；步骤3：考察上样量、反应时间、显色时间、底物浓度、显色剂浓度、底物终止剂对反应结果的影响，得到最佳反应条件；步骤4：制作标准工作曲线；步骤5：最低检测限测定；步骤6：重复性实验步骤7：卡托普利对ace活性抑制测定；步骤8：天麻素对ace活性抑制测定；步骤9：乙酰天麻素对ace活性抑制测定；步骤10：紫外分光光度法检测不同药物对ace的抑制。3.根据权利要求2所述的一种用该纸芯片进行血管紧张素转化酶抑制剂检测分析方法，其特征在于：结合步骤1、2、3：分别在反应底物上样量2～6μl、显色剂上样量30～50μl、反应时间10-50min、显色时间30-150s、底物浓度6～30mmol/l、显色剂浓度0.2％～1.0％和反应终止剂1～9μl条件下进行检测，得到最佳检测条件。4.根据权利要求2所述的一种用该纸芯片进行血管紧张素转化酶抑制剂检测分析方，其特征在于：步骤4中所述的“制作标准工作曲线”具体如下：取五支离心管，分别加入不同浓度的甘氨酸二肽溶液(5、9、13、17、21
×
10-3
mol/l)10μl，血清10μl，1
×
pbs缓冲溶液25μl，hcl(1mmol/l)5μl，混合后各吸取4μl混合液加至纸芯片1st layer显色区，2nd layer加载区加入50μl茚三酮(8mg/ml)溶液，折叠压紧，65℃加热2min显色，拍照分析不同浓度甘氨酸二肽rgb值，以rgb值对甘氨酸二肽浓度作图得标准工作曲线。5.根据权利要求2所述的一种用该纸芯片进行血管紧张素转化酶抑制剂检测分析方，其特征在于：步骤5中所述的“最低检测限试验”具体如下：不停稀释甘氨酸二肽溶液进行显色，直至rgb与空白值相差至10所对应的甘氨酸二肽浓度为甘氨酸二肽浓度检测限。6.根据权利要求2所述的一种用该纸芯片进行血管紧张素转化酶抑制剂检测分析方法，其特征在于：步骤6中所述所述的“重复性实验”具体如下：将10μl血清和5μl卡托普利溶液(100.46nmol/l)混合于20μl pbs缓冲溶液中，加入10μ
l底物溶液(24mmol/l)反应20min后，加入5μl hcl(1mmol/l)终止反应。吸取4μl反应液加至纸芯片1st layer显色区，2nd layer加载区加入50μl茚三酮(8mg/ml)溶液，折叠压紧，于65℃加热显色2min考察重复性。重复做五次，对天麻素(2.48mmol/l)和乙酰天麻素(2.56mmol/l)的活性抑制重复性进行考察。7.根据权利要求2所述的一种用该纸芯片进行血管紧张素转化酶抑制剂检测分析方法，其特征在于：步骤7中所述的“卡托普利对ace活性抑制测定”具体如下：将5μl不同浓度(1.0046
×
10-1
μmol/l，1.0046
×
10-2
μmol/l，1.0046
×
10-3
μmol/l，1.0046
×
10-4
μmol/l，1.0046
×
10-5
μmol/l)的卡托普利溶液分别和10μl血清混合于20μlpbs缓冲溶液中，加入10μl底物溶液(24mmol/l)反应20min后加入5μl hcl(1mmol/l)终止反应，各吸取4μl反应液加至纸芯片1st layer显色区，2nd layer加载区加入50μl茚三酮(8mg/ml)溶液，折叠压紧，65℃加热2min显色，拍照分析不同浓度卡托普利的rgb值，以抑制率对卡托普利浓度进行非线性拟合，得卡托普利对ace抑制的ic50值。8.根据权利要求2所述的一种用该纸芯片进行血管紧张素转化酶抑制剂检测分析方法，其特征在于：步骤8中所述的“天麻素对ace活性抑制测定”具体如下：配制2.48
×
10-2
mol/l，2.48
×
10-3
mol/l，2.48
×
10-4
mol/l，2.48
×
10-5
mol/l，2.48
×
10-6
mol/l的天麻素溶液，分别和10μl血清混合于20μl pbs缓冲溶液中，加入10μl底物溶液(24mmol/l)反应20min后加入5μl hcl(1mmol/l)终止反应，各吸取4μl反应液加至纸芯片1st layer显色区，2nd layer加载区加入50μl茚三酮(8mg/ml)溶液，折叠压紧，65℃加热2min显色，拍照分析不同浓度天麻素溶液的rgb值，以抑制率对天麻素浓度进行非线性拟合，得卡天麻素对ace抑制的ic50值。9.根据权利要求2所述的一种用该纸芯片进行血管紧张素转化酶抑制剂检测分析方法，其特征在于：步骤9中所述的“乙酰天麻素对ace活性抑制测定”具体如下：配制2.56
×
10-2
mol/l，2.56
×
10-3
mol/l，2.56
×
10-4
mol/l，2.56
×
10-5
mol/l，2.56
×
10-6
mol/l的乙酰天麻素溶液，分别和10μl血清混合于20μl pbs缓冲溶液中，加入10μl底物溶液(24mmol/l)反应20min后加入5μl hcl(1mmol/l)终止反应，各吸取4μl反应液加至纸芯片1st layer显色区，2nd layer加载区加入50μl茚三酮(8mg/ml)溶液，折叠压紧，65℃加热2min显色，拍照分析不同浓度乙酰天麻素溶液的rgb值，以抑制率对乙酰天麻素浓度进行非线性拟合，得乙酰天麻素对ace抑制的ic50值。10.根据权利要求2所述的一种用该纸芯片进行血管紧张素转化酶抑制剂检测分析方法，其特征在于：步骤10中所述的“紫外分光光度法检测不同药物对ace的抑制”具体如下：将25μl不同浓度(2.48
×
10
‑‑
2mol/l，2.48
×
10-3mol/l，2.48
×
10-4mol/l，2.48
×
10-5mol/l，2.48
×
10-6mol/l)的天麻素溶液和50μl血清混合于100μl pbs缓冲溶液中，加入50μl底物溶液(24mmol/l)反应20min后加入25μl hcl(1mmol/l)终止反应，加入200μl茚三酮溶液(8mg/ml)显色后稀释，在568nm下测量吸光度值。以抑制率对天麻素浓度进行拟合，得紫外法天麻素对ace抑制的ic50值；配制2.56
×
10-2mol/l，2.56
×
10-3mol/l，2.56
×
10-4mol/l，2.56
×
10-5mol/l，2.56
×
10-6mol/l的乙酰天麻素溶液，其余操作同天麻素；配制1.0046
×
10-1μmol/l，1.0046
×
10-2μmol/l，1.0046
×
10-3μmol/l，1.0046
×
10-4μmol/l，1.0046
×
10-5μmol/l的卡托普利溶液，其余操作同天麻素。

技术总结
本发明涉及一种检测分析专用纸芯片及检测方法，将血管紧张素转化酶抑制剂筛选过程在纸芯片上实现，基于血管紧张素转化酶可将底物马尿酰甘氨酰甘氨酸(HGG)分解为马尿酸和甘氨酸二肽，甘氨酸二肽可与茚三酮反应产生紫色配合物，显色强度与酶活性呈正比，包括10大步骤。本发明同现有技术相比，具有检测速度快、准确度高、样品用量少、能耗低、污染小、成本低等优点，且纸芯片携带方便、操作简单，制作的3DμPAD用于血管紧张素转化酶抑制剂筛选无需进行特殊的样品预处理，可直接进行定量分析，可用于酶抑制剂类药物的活性筛选，在临床诊断、食品质量控制和环境监测等领域有着广阔的应用前景。前景。前景。


技术研发人员：张剑 刘春叶 张博 成昭 李文静
受保护的技术使用者：西安医学院
技术研发日：2022.05.25
技术公布日：2022/9/6