一种MALDI质谱成像信号校正的方法与流程

一种maldi质谱成像信号校正的方法
技术领域
1.本发明属于质谱检测技术领域，具体是一种maldi质谱成像信号校正的方法。


背景技术：

2.maldi质谱成像(msi)技术通过基质辅助激光解吸电离源(atmospheric pressure matrix assisted laser desorption ionization，maldi)与质谱串联，通过可视化的成像软件，使得被检测到的荷质比根据含量不同通过不同强度的色彩呈现，进而提供化合物的空间分布信息。质谱成像技术具有非靶向、无需标记和多成分同时检测的优势，与光学图像采集技术结合后，既可观察到高分辨率的形态图像，又可对特定的分子进行鉴定和可视化分布分析，在生命科学领域显示出巨大的应用前景。
3.maldi msi技术一般使用冰冻切片机对被测样品进行切片处理，获得极薄的组织切片，固定于氧化铟锡(ito)玻璃的导电面，添加基质覆盖，然后将干燥结晶后的切片置入质谱仪的靶板上进行扫描。但在应用过程中，因基质添加和质谱成像仪器状态存在波动，造成同一样品的切片在不同批次实验中信号差异较大，难以客观、准确地对其质谱成像结果进行评价。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，提供一种maldi质谱成像信号校正的方法，方法采用对照品溶液随行点样，可校正不同批次实验的信号差异，提高maldi质谱成像分析的重复性和准确性。
5.为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
6.一种maldi质谱成像信号校正的方法，所述方法包括以下步骤：
7.1)取对照品，配置信号校正溶液；
8.2)取待测药材，明胶包裹，切片；
9.3)取两片氧化铟锡玻璃，在每一片氧化铟锡玻璃的导电面上放置若干片待测药材切片以及随行点样若干个信号校正点，挥干溶剂；在待测药材切片和信号校正点添加基质；
10.4)分别对氧化铟锡玻璃上的待测药材切片和信号校正点进行质谱信号采集；
11.5)第一片氧化铟锡玻璃上的若干个信号校正点的对照品信号值进行平均值计算得到第一平均值，第二片氧化铟锡玻璃上的若干个信号校正点的对照品信号值进行平均值计算得到第二平均值；第二平均值与第一平均值的比值为信号校正系数；
12.6)根据信号校正点获得的信号校正系数，对两次测定的待测药材切片中对照品的离子信号进行校正，校正方法为：待测药材切片中各像素点的峰信号值乘以信号校正系数，获得校正后的信号强度，并根据各像素点校正后峰强度重新绘制质谱成像图。
13.优选地，所述对照品为黄芩苷，所述待测药材为黄芩；或对照品为直铁线莲宁b，待测药材为板蓝根；或对照品为胆碱，待测药材为冬虫夏草。
14.优选地，所述基质为2-硝基间苯三酚，基质溶液的配置方法为：取2-硝基间苯三酚
适量，加含1
‰
三氟乙酸的80％乙腈溶液制成浓度为10mg/ml的溶液。
15.优选地，每一片氧化铟锡玻璃上放置一片待测药材切片和随行点样六个信号校正点。
16.优选地，质谱信号采集参数：质荷比采集范围100-1000，空间分辨率为30-100μm，采集模式为正离子模式或负离子模式，激光照射次数为500，激光频率为1000hz，激光直径为20-40μm，激光强度为60-76.5。
17.本发明中，本领域技术人员根据不同的待测样品以及不同的对照品可以选择不同的添加基质以及不同的质谱信号采集参数，但其信号校正系数的得到均是采用相同的方法。
18.与现有技术相比，本发明具有如下显著的技术优点：
19.1、本发明的方法可以消除不同批次操作所引起的信号波动，提高相同样品质谱成像测定结果重现性。
20.2、本发明的方法可以有助于更加客观地比较不同样品质谱成像测定结果，校正后同样样品两次测定的质谱成像图更加一致，不同空间位置的信号强弱程度基本相同，说明可减小测定误差。
附图说明
21.图1为本发明实施例1中黄芩切片固定与氧化铟锡玻璃导电面的图；
22.图2为本发明实施例1中氧化铟锡玻璃导电面上信号校正点的图；
23.图3为本发明实施例1中氧化铟锡玻璃导电面上药材切片和信号校正点的图；
24.图4为本发明实施例1中信号校正前与信号校正后黄芩切片的质谱成像图；
25.图5为本发明实施例2中信号校正前与信号校正后板蓝根切片的质谱成像图；
26.图6为本发明实施例3中信号校正前与信号校正后冬虫夏草切片的质谱成像图。
具体实施方式
27.下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
28.实施例1：黄芩中黄芩苷的maldi msi信号校正
29.1.取黄芩苷对照品，加50％甲醇制成浓度为10μg/ml的信号校正溶液。
30.2.取黄芩药材，从中部切取1cm左右的小段，浸没于0.1g/ml的明胶水溶液，-80℃冻实。包裹样品的明胶块，用少量oct包埋剂小心固定于载物台(避免污染)，采用冰冻切片机制备冰冻切片。切片条件：箱体温度-20℃，刀台温度-18℃，切片厚度30μm，固定于氧化铟锡(ito)玻璃的导电面，如图1所示。
31.3.精密吸取信号校正溶液0.5ul，点于氧化铟锡(ito)玻璃的导电面，如图2所示(10倍放大)，点6个信号校正点，挥干溶剂。
32.4.采用升华或喷涂的方式给样品切片和信号校正点添加2-硝基间苯三酚基质(取2-硝基间苯三酚适量，加含1
‰
三氟乙酸的80％乙腈溶液制成浓度为10mg/ml的溶液)，如图3所示。
33.5.选择样品的采集区域，6个信号校正点沿每个水滴边缘画线，选择整个水滴为采集区域。按照下列仪器参数采用岛津imscope qt采集质谱信号：质荷比采集范围100-550。
空间分辨率为100μm，采集模式为正离子模式，激光照射次数为500，激光频率为1000hz，激光直径为25um，激光强度为76.5。
34.6.取同一样品，按上述方法切片、固定、添加信号校正点于另一氧化铟锡(ito)玻璃的导电面，采用岛津imscope qt采集质谱信号。
35.7.取两片氧化铟锡(ito)玻璃即两次实验随行的6个信号校正点质谱信号的平均值，计算其比例，作为信号校正系数。如第一次实验测得6个信号校正点中[黄芩苷 k]

峰(m/z 485.0686)信号的平均值为251，第二次实验测得6个信号校正点中[黄芩苷 k]

峰(m/z 485.0686)信号的平均值为420，则两次实验之间的校正系数为1.67，如下表1所示。
[0036]
表1
[0037][0038]
8.根据随行信号校正点获得的校正系数，对两次实验中同一样品中[黄芩苷 k]

峰(m/z 485.0686)离子信号进行校正，即第一次实验样品中各像素点[黄芩苷 k]

峰(m/z 485.0686)峰信号值乘以1.67，获得校正后的信号强度，并根据各像素点校正后峰强度重新绘制质谱成像图，消除不同次实验造成的偏差(通过将信号校正系数输入质谱成像测试数据分析软件imagereveal，由质谱成像测试软件绘制校正后的成像图)，如图4所示，其中，左上图为校正前第一片氧化铟锡玻璃上的样品质谱成像图，左下图为校正后第一片氧化铟锡玻璃上的样品质谱成像图，右上和右下图为第二片氧化铟锡玻璃上的样品质谱成像图(其中，右上为校正前，右下为校正后)。从该图可以看出，在相同的热图(颜色白、红、橙、绿、蓝、黑，信号强度依次减弱)坐标下，同一黄芩样品，校正前横切面外周和中心的黄芩苷峰信号，第一次实验(各像素点颜色偏蓝)弱于第二次实验(各像素点颜色偏绿)。校正后，两次实验信号强度基本相当(各像素点颜色均偏绿)。说明本发明的方法可降低同一样品不同次操作的差异，准确反映化合物的空间分布特征。
[0039]
实施例2：板蓝根中直铁线莲宁b的maldi msi信号校正
[0040]
1.取直铁线莲宁b对照品，加50％甲醇制成浓度为20μg/ml的信号校正溶液。
[0041]
2.取板蓝根样品a，从中部切取1cm左右的小段，浸没于0.1g/ml的明胶水溶液，-40℃冻实。包裹样品的明胶块，用少量oct包埋剂小心固定于载物台(避免污染)，采用冰冻切片机制备冰冻切片。切片条件：箱体温度-18℃，刀台温度-17℃，切片厚度40μm，固定于氧化铟锡(ito)玻璃的导电面。
[0042]
3.精密吸取信号校正溶液0.5ul，点于氧化铟锡(ito)玻璃的导电面，点6个信号校正点，挥干溶剂。
[0043]
4.采用升华或喷涂的方式给样品切片和信号校正点添加1,5-dan基质(取1,5-dan，加适量乙醇-水(70:30)配制得饱和溶液)。
[0044]
5.选择样品的采集区域，6个信号校正点沿每个水滴边缘画线，选择整个水滴为采集区域。按照下列仪器参数采用岛津imscope qt采集质谱信号：质荷比采集范围500-1000。空间分辨率为80μm，采集模式为负离子模式，激光照射次数为500，激光频率为1000hz，激光
直径为40um，激光强度为70。
[0045]
6.半年后，取另一批板蓝根药材样品b，按上述方法切片、固定、添加信号校正点于另一氧化铟锡(ito)玻璃的导电面，同样的采样条件采集质谱信号。
[0046]
7.取两片氧化铟锡(ito)玻璃即两批样品随行的6个信号校正点质谱信号的平均值，计算其比例，作为信号校正系数。样品a随行测得6个信号校正点中[直铁线莲宁b-h]-峰(m/z 683.2489)信号的平均值为1321709，样品b随行测得6个信号校正点中[直铁线莲宁b-h]-峰(m/z 683.2489)信号的平均值为41364，则两次实验之间的校正系数为31.95。
[0047]
8.根据随行信号校正点获得的校正系数，对两批样品中[直铁线莲宁b-h]-峰(m/z 683.2489)离子信号进行校正，即样品b中各像素点[直铁线莲宁b-h]-峰(m/z683.2489)信号值乘以31.95，获得校正后的信号强度，并根据各像素点校正后峰强度重新绘制质谱成像图，消除不同次实验造成的偏差(通过将信号校正系数输入质谱成像测试数据分析软件imagereveal，由质谱成像测试软件绘制校正后的成像图)，如图5所示，其中，左上和左下图为样品a质谱成像图(其中，左上为校正前，左下为校正后)。右上图为校正前样品b质谱成像图，右下图为校正后样品b质谱成像图。从该图可以看出，在相同的热图(颜色白、红、橙、绿、蓝、黑，信号强度依次减弱)坐标下，信号校正前样品a中直铁线莲宁b在韧皮部有强信号分布(外侧像素点红色)、样品b中直铁线莲宁b信号普遍较弱(像素点均为蓝色)，同一品种两批样品差异极大。而信号校正后，样品b中直铁线莲宁b在韧皮部也有强信号分布(外侧呈现红色、黄色和绿色像素点)，与样品a基本一致。说明本发明的方法可降低不同时间操作仪器状态等造成的信号偏差，更客观反映同一品种不同批次样品中化合物的相近空间分布特征。
[0048]
实施例3：冬虫夏草中胆碱的maldi msi信号校正
[0049]
1.取胆碱对照品，加50％甲醇制成浓度为5μg/ml的信号校正溶液。
[0050]
2.取冬虫夏草，浸没于0.1g/ml的明胶水溶液，-40℃冻实。包裹样品的明胶块，用少量oct包埋剂小心固定于载物台(避免污染)，采用冰冻切片机分别制备子座(即俗称的冬虫夏草的“草”部位)和虫体(即俗称的冬虫夏草的“虫”部位)冰冻切片。切片条件：箱体温度-19℃，刀台温度-18℃，切片厚度25μm，子座和虫体分别固定于不同的氧化铟锡(ito)玻璃的导电面。
[0051]
3.精密吸取信号校正溶液0.5ul，点于两个氧化铟锡(ito)玻璃的导电面，点6个信号校正点，挥干溶剂。
[0052]
4.采用升华或喷涂的方式给子座和虫体切片和各自的信号校正点添加2-硝基间苯三酚基质(取2-硝基间苯三酚适量，加含1
‰
三氟乙酸的80％乙腈溶液制成浓度为10mg/ml的溶液)。
[0053]
5.选择样品的采集区域，6个信号校正点沿每个水滴边缘画线，选择整个水滴为采集区域。按照下列仪器参数采用岛津imscope qt采集质谱信号：质荷比采集范围100-500。空间分辨率为30μm，采集模式为正离子模式，激光照射次数为500，激光频率为1000hz，激光直径为20um，激光强度为60。
[0054]
6.取子座和虫体随行的6个信号校正点质谱信号的平均值，计算其比例，作为信号校正系数。子座随行测得6个信号校正点中[胆碱]

峰(m/z 104.1077)信号的平均值为3843，虫体随行测得6个信号校正点中[胆碱]

峰(m/z 104.1077)信号的平均值为6096，则
两次实验之间的校正系数为1.59。
[0055]
7.根据随行信号校正点获得的校正系数，对子座和虫体中[胆碱]

峰(m/z104.1077)离子信号进行校正，即子座中各像素点[胆碱]

峰(m/z 104.1077)信号值乘以1.59，获得校正后的信号强度，并根据各像素点校正后峰强度重新绘制质谱成像图，消除不同次实验造成的偏差(通过将信号校正系数输入质谱成像测试数据分析软件imagereveal，由质谱成像测试软件绘制校正后的成像图)，如图6所示，其中，右上和右下图为虫体质谱成像图(其中，右上为校正前，右下为校正后)。左上图为校正前子座质谱成像图，左下图为校正后子座质谱成像图。从该图可以看出，在相同的热图(颜色白、红、橙、绿、蓝、黑，信号强度依次减弱)坐标下，信号校正前子座中胆碱信号强度(像素点呈现蓝色、绿色、红色)远低于虫体(像素点以红色和黄色为主)。而信号校正后，子座中胆碱在下方呈现强信号分布(像素点以红色和黄色为主)。说明本发明的方法可降低操作造成的信号偏差，更客观反映同一药材不同部位中化合物的空间分布特征。
[0056]
本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。
[0057]
本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。
[0058]
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。