NOTUM与BMP9作为联合靶点在细胞成骨分化中的应用

notum与bmp9作为联合靶点在细胞成骨分化中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及notum与bmp9作为联合靶点在细胞成骨分化中的应用。


背景技术：

2.骨稳态是指骨组织中骨形成和骨吸收维持动态平衡。骨稳态的破坏可导致骨质疏松症。以往治疗骨质疏松症的研究多侧重于抑制骨吸收，但疗效有待提高。因此，研究和探索新的成骨药物是抗骨质疏松药物的研究方向之一，也是骨质疏松症患者的迫切需要。
3.成骨机制复杂，多种信号通路影响成骨，bmps(骨形态发生蛋白)是诱导成骨分化的重要蛋白家族，而bmp9则是bmp家族中成骨诱导能力最强的细胞因子之一。与早已用于临床的bmp2相比，bmp9拥有更强的成骨潜能：等量bmp9可比bmp2诱导产生更强的alp活性、更强的矿化效应等。bmp9主要通过bmps/smads经典信号通路诱导mscs的成骨分化，其成骨诱导可受其他因素调控，相关因子对bmp9诱导的mscs成骨分化的调控及机制已成为该领域的研究热点。同时，bmp9诱导干细胞成骨分化并不受noggin蛋白影响，这代表着bmp9可以从本质上诱导mscs成骨分化，令其与其他bmps相比具有极大的优势。
4.notum在如胃肠道、肝胆等许多系统中起着重要的作用。有研究报道，潘氏细胞产生的notum减弱了老化肠上皮细胞的再生；此外，notum对小鼠的药理抑制作用增强了老化干细胞的再生能力，并促进了化疗引起的损伤的恢复。notum蛋白是一种分泌蛋白，可与wnt蛋白在细胞外结合，调节细胞外wnt蛋白分布，以此调控wnt/β-catenin信号通路。wnt/β-catenin信号通路在成骨过程中发挥重要作用，可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，抑制破骨细胞形成。近年来也有文献报道notum在运动系统中发挥一定作用，但其内容多局限于动物实验及相应表型研究，同时，notum与bmp9的关系也尚无明确的研究。


技术实现要素：

5.本发明通过rt-pcr、wb等多种体外实验探究bmp9与notum的关系，同时采用rt-pcr、wb、异位成骨等多种体内外实验探究notum对bmp9的成骨潜能的影响，并分析探索其可能的机制。基于此，本发明保护如下技术方案：
6.notum蛋白与骨形态发生蛋白bmp9联用在制备调控细胞成骨分化的药物中的应用。
7.notum蛋白与骨形态发生蛋白bmp9联用在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。
8.notum基因与bmp9基因作为联合靶点在制备调控细胞成骨分化的药物中的应用。
9.notum基因与bmp9基因作为联合靶点在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。
10.在上述应用技术方案中，抑制notum促进bmp9诱导成骨分化效应，促进notum则抑制bmp9诱导成骨分化效应。
11.在上述应用技术方案中，notum通过wnt/β-catenin信号通路介导bmp9诱导细胞成骨分化。
12.在上述应用技术方案中，notum降低bmp9诱导的成骨过程中β-catenin蛋白的表达，抑制notum则增强bmp9诱导的成骨过程中β-catenin蛋白的表达。
13.在上述应用技术方案中，在bmp9诱导的成骨过程中，notum增强gsk-3β的表达并抑制gsk-3β的磷酸化，而抑制notum则抑制gsk-3β的表达并增强gsk-3β的磷酸化。
14.在上述应用技术方案中，抑制wnt/β-catenin信号通路从而抑制bmp9诱导的成骨分化，或者增强wnt/β-catenin信号通路从而促进bmp9诱导的成骨分化。
15.本发明的有益效果是：本发明研究显示notum可调控bmp9诱导干细胞成骨分化过程，其机制可能与wnt/β-catenin信号通路有关；联用notum与bmp9可能促进bmp9临床应用的进程，从而使bmp9的商用化成为可能，而这也将成为治疗骨质疏松的新策略。未来进一步的研究探索notum在成骨分化过程中的确切机制，可将其作为靶点探索前沿药物，相关药物未来有望应用于临床。
附图说明
16.图1是notum内源性mrna在mscs中的表达情况。
17.图2是notum内源性蛋白在mscs中的表达情况。
18.图3是mefs细胞中bmp9对notum蛋白表达水平的影响。
19.图4是adnotum对mefs细胞中notum的影响，图a是adnotum感染mefs细胞镜下荧光，图b是adnotum对mefs细胞中notum mrna表达水平的影响，图4c是adnotum对mefs细胞中notum蛋白表达水平的影响(n＝3,x
±
s，*p＜0.05，与gfp组比较)。
20.图5是adsinotum对mefs细胞中notum的影响，图a是adsinotum感染mefs细胞镜下荧光，图b是adsinotum对mefs细胞中notum mrna表达水平的影响，图c是adsinotum对mefs细胞中notum蛋白表达水平的影响(n＝3,x
±
s，*p＜0.05，与gfp组比较)。
21.图6是notum和bmp9对mefs细胞中runx2mrna表达水平的影响(n＝3,x
±
s，*p＜0.05，与gfp组比较；^p＜0.05，两划线比较)。
22.图7是notum和bmp9对mefs细胞中runx2蛋白表达水平的影响。
23.图8是抑制notum和bmp9对mefs细胞中runx2 mrna表达水平的影响。
24.图9是抑制notum和bmp9对mefs细胞中runx2蛋白表达水平的影响。
25.图10是notum和bmp9对mefs细胞中opn mrna表达水平的影响。
26.图11是notum和bmp9对mefs细胞中opn蛋白表达水平的影响。
27.图12是抑制notum和bmp9对mefs细胞中opn mrna表达水平的影响。
28.图13是抑制notum和bmp9对mefs细胞中opn蛋白表达水平的影响。
29.图14是notum和bmp9对mefs细胞中alp活性的影响。
30.图15是抑制notum和bmp9对mefs细胞中alp活性的影响。
31.图16是notum和bmp9对mefs细胞形成钙盐沉积的影响。
32.图17是抑制notum和bmp9对mefs细胞形成钙盐沉积的影响。
33.图18是促进notum与抑制notum对bmp9诱导mefs细胞异位成骨的影响(标本)。
34.图19是促进notum与抑制notum对bmp9诱导mefs细胞异位成骨的影响(h&e染色)。
35.图20是促进notum与抑制notum对bmp9诱导mefs细胞异位成骨的影响(masson染色)。
36.图21是促进notum与抑制notum对bmp9诱导的mefs细胞中β-catenin mrna影响。
37.图22是notum和bmp9对mefs细胞中β-catenin蛋白影响。
38.图23是抑制notum和bmp9对mefs细胞中β-catenin蛋白影响。
39.图24是notum和bmp9对mefs细胞中gsk-3β和p-gsk-3β蛋白影响(图a)和p-gsk-3β蛋白定量分析(图b)。
40.图25是抑制notum和bmp9对mefs细胞中gsk-3β和p-gsk-3β蛋白影响(图a)和p-gsk-3β蛋白定量分析(图b)。
41.图26是notum和沉默dkk1对bmp9诱导mefs中runx2 mrna表达水平的影响。
42.图27是notum和沉默dkk1对bmp9诱导mefs中runx蛋白表达水平的影响(图a)和runx2蛋白定量分析(图b)。
43.图28是抑制notum和dkk1对bmp9诱导mefs中runx2 mrna表达水平的影响(n＝3,x
±
s，*p＜0.05，与gfp组比较；^p＜0.05，两划线比较)。
44.图29是抑制notum和dkk1对bmp9诱导mefs中runx蛋白表达水平影响(图a)和runx2蛋白定量分析(图b)(n＝3,x
±
s，*p＜0.05，与gfp组比较；^p＜0.05，两划线比较)。
45.图30是notum和沉默dkk1对bmp9诱导mefs中alp活性的影响。
46.图31是抑制notum和dkk1对bmp9诱导mefs中alp活性的影响。
具体实施方式
47.下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
48.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
49.实施例1
50.1材料与方法
51.1.1材料
52.1.1.1重组腺病毒
53.adrfp、adgfp、addkk1和adsidkk1均由发明人所在实验室包装并保存。adnotum购自上海瀚恒盛材料科技有限公司。adbmp由芝加哥大学何通川教授捐赠。
54.1.1.2细胞株
55.mefs、c3h10t1/2、mc3t3-l1、c2c12和hek293细胞均购自atcc。
56.1.1.3 balb/c裸鼠
57.15只，购自北京华阜康公司。
58.1.1.4实验主要试剂
59.高糖型 dmem培养基(重庆 赛米克)，fbs(重庆 赛米克)，胰蛋白酶(重庆 赛米克)
60.bsa(重庆 赛米克)，茜素红试剂(重庆 赛米克)，trizol试剂(重庆 赛米克)
61.wb蛋白marker(重庆 赛米克)，ecl超敏显影液(重庆 赛米克)，pbs(上海 碧云天)
62.碱性磷酸酶染色试剂盒(上海 碧云天)，ripa组织细胞裂解液(上海 碧云天)
63.二抗抗体(上海 碧云天)，逆转录试剂盒(北京 宝日医)，page凝胶快速制备试剂盒(上海 雅酶)，实时荧光定量pcr试剂盒(美国 bimake)，syber(美国 bimake)，pvdf膜(美国 millipore)
64.dmso(美国 sigma)，吐温20(美国 sigma)，β-磷酸甘油(美国 sigma)，维生素c(美
i、0.5μl oligo dt primer、2μl random 6mers与5μl rna溶液混匀，放入pcr仪，逆转录反应程序为37℃(15min)、85℃(5s)；程序结束后取出ep管，稀释10倍，置于4℃备用。
80.1.2.4 rt-pcr
81.1)每孔取3μl逆转录稀释后的cdna溶液、3μl syber和3μl对应的10x引物加入pcr板中，封口膜封口，离心混匀，放入rt-pcr仪中反应；所有操作于冰盒上进行；
82.2)rt-pcr程序为：95℃5min；95℃20s，66℃20s，72℃20s，39个循环；95℃5min。
83.3)引物序列
[0084][0085]
1.2.5提取细胞总蛋白
[0086]
将mefs细胞消化接种于6孔板，待细胞贴壁后分别加入相应处理因素，于指定时间点取出，去除培养基，pbs洗涤2次，每孔加入300μlripa细胞裂解液，于冰上静置10分钟，吹打收集细胞悬液并将其转移至1.5mlep管中，每管加入75μlloadingbuffer及15μlβ-巯基乙醇混匀，沸水水浴15分钟。
[0087]
1.2.6 wb
[0088]
1)配胶：洗净玻璃板并待其晾干，将玻璃板与制胶架组装好并仔细检查以防漏胶，使用page凝胶快速制备试剂盒配置浓缩胶与分离胶；按照每块胶5ml混合液 60μl促凝剂的比例制下层胶，将下层胶溶液与下层胶缓冲液等量混匀，加入改良型促凝剂混匀注入两块玻璃板之间，用1ml无水乙醇压胶使其上缘平整；待下层胶凝固干燥后，去除无水乙醇，按照每块胶1.5ml混合液 15μl促凝剂的比例制上层胶，将上层胶溶液与上层胶缓冲液等量混匀，加入改良型促凝剂混匀注入玻璃板之间，并根据实验内容选择合适的梳子插入，待其凝固干燥后小心拔出梳子；
[0089]
2)电泳：组装好凝胶与电泳槽，将5
×
sds电泳液稀释成1xsds电泳液，倒入电泳槽内；涡旋蛋白样品使其混匀，按照实验设计向凝胶孔中加入相应蛋白，并在两端或组间加入3μl蛋白marker；开启电泳仪，调整恒压90v，使电流约为40-60ma；待样品进入分离胶后调整恒压为110v至停止电泳；
[0090]
3)转膜：按照实验设计选择合适的pvdf膜并将其裁剪为合适大小，在左上角做标记，置于甲醇中活化30秒后转移至双蒸水中备用；取下分离胶，根据抗体说明书及蛋白marker位置切下相应分离胶；将分离胶转移到转膜器上平铺，覆盖pvdf膜，注意两者之间互相紧贴，不能有气泡；夹紧转膜器，组装转膜器与转印槽，在槽内放入冰袋，倒入转膜液，使其没过转膜器，将转印槽放于冰中；调整恒流210ma，转膜时间45-60分钟；
[0091]
4)封闭、孵育抗体：配制5％bsa溶液，转膜结束后将膜置于bsa中常温慢摇封闭1-3小时；使用1
×
tbst按照1:1000的比例配制可回收一抗溶液，待封闭完成后回收bsa并使用1
×
tbst快摇清洗条带5分钟，去除洗膜液，加入相应一抗置于4℃冰箱过夜或常温慢摇2小时；一抗孵育完毕后回收一抗溶液并使用1
×
tbst清洗三次，每次快摇5分钟；根据一抗种属使用1
×
tbst按1:3000比例配制相应二抗溶液，常温慢摇孵育30分钟后清洗三次，每次快摇5分钟；
[0092]
5)显影：1:1混匀a液与b液配制成工作液，用滤纸吸取条带表面液体，将其置于蜡板上，并将工作液均匀滴加于条带表面，放入显影仪中显影并保存图片，定量分析采用imagej软件分析。
[0093]
1.2.7 alp染色
[0094]
将mefs细胞消化后接种于24孔板上。待细胞贴壁后分别加入相应的处理因素，在指定时间点(腺病毒感染后第5、7天)取出孔板去除培养基，使用pbs洗涤3次，去除残余pbs；避光配制染色液，将16.5μlbcip与33μl nbt加入5ml缓冲液中混匀避光染色，24孔板每孔加入200μl混合液，注意加入工作液时应沿孔板壁轻柔加入；避光静置15分钟后查看染色程度，若颜色较浅可适当延长染色时间至达到预期；去除染料后pbs洗涤1-2次，镜下观察并拍照、扫描并拍照，记录。
[0095]
1.2.8茜素红染色
[0096]
将mefs细胞消化后接种于24孔板上。待细胞贴壁后分别加入相应的处理因素，待腺病毒感染48小时后，将培养基更换为成骨诱导培养基至14天和21天，期间注意补液、换液，换液时需提前预热并轻柔加入孔板。在指定时间点取出孔板，去除培养基用pbs轻柔润洗3次，吸去pbs残液并加入0.5％戊二醛固定10-20分钟，固定完毕后去除固定液，用ph4.2的pbs轻柔润洗3次；配制0.4％茜素红染液，吸去pbs残液加入染色液覆盖样品，室温染色10-30分钟，吸去染色液待其晾干，置于显微镜下观察并拍照、扫描并拍照记录。
[0097]
1.2.9异位成骨实验
[0098]
将买回的裸鼠随机分组并放在动物房以适应环境；同时向处于对数生长期的细胞加入相应处理因素，两天后取出培养皿去除培养基，加入适量胰酶消化后转移至离心管，1000rpm离心5分钟，去除上清液，加入适量4℃pbs重悬，使其浓度约为1.5
×
106/100μl，并将细胞悬液转移至ep管；将ep管置于冰上并运输至动物房，混匀细胞悬液，消毒表面皮肤后用1ml空针向皮下注射，每只裸鼠左右上肢背部各一注射点，每点注射100μl细胞悬液；观察裸鼠反应片刻，见裸鼠行动无异常、注射点无渗液可将裸鼠放回鼠笼，每5天观察一次裸鼠存活情况及皮下异位骨生长情况。四周后以断颈法处死裸鼠，取出皮下异位骨标本并拍照，用4％多聚甲醛固定1-3天后置于脱钙液中脱钙3-4周后制作切片并染色，于显微镜下拍照记录。
[0099]
1.2.10统计学分析
[0100]
采用graphpad prism8软件对数据进行分析，并用x
±
s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用标准t检验分析。p＜0.05认为有统计学意义。
[0101]
2结果
[0102]
2.1 notum的内源性表达
[0103]
我们采用rt-pcr和wb检测mefs、c3h10t1/2、mc3t3-l1和c2c12中notum的mrna和蛋
白水平(图1和图2)。结果显示notum在不同间充质干细胞系中均有表达，且在mefs细胞中表达水平较高。
[0104]
2.2 bmp9在mefs细胞中对notum的表达水平的影响
[0105]
我们将mefs细胞选为工作细胞。为确定bmp9与notum的关系，我们使用不同滴度的adbmp9感染mefs细胞。wb结果提示在mefs细胞中，bmp9明显抑制notum蛋白表达(图3)。这一结果提示notum可能调节bmp9诱导mscs成骨分化。
[0106]
2.3 notum对bmp9诱导mefs细胞成骨分化的影响
[0107]
我们首先从mrna和蛋白水平对adnotum和adsinotum进行功能验证(图4和图5)。我们用adgfp、adbmp9和adnotum、adsinotum感染mefs细胞，通过rt-pcr和wb检测成骨标志物。结果提示，过表达notum在mrna和蛋白水平均明显抑制bmp9诱导的早期成骨标志物runx2(图6和图7)，而抑制notum则可促进bmp9诱导mefs细胞表达runx2(图8和图9)。同时，过表达notum在mrna和蛋白水平均明显抑制bmp9诱导的晚期成骨标志物opn(图10和图11)，而抑制notum则可促进bmp9诱导mefs细胞表达opn(图12和图13)。采用相同处理因素处理细胞，alp染色结果提示，过表达notum可以抑制mefs细胞中bmp9对alp活性的上调作用(图14)，而抑制notum可以促进bmp9上调mefs细胞中alp的活性(图15)。此外，钙盐沉积染色实验也提示，过表达notum可抑制bmp9诱导mefs细胞钙盐结节的形成(图16)，抑制notum则促进bmp9诱导mefs细胞钙盐结节的形成(图17)。
[0108]
以上结果提示bmp9与notum之间存在相关性，bmp9可抑制notum的表达水平；notum可以抑制bmp9诱导间充质干细胞成骨分化，而抑制notum可以促进bmp9成骨潜能，但相关机制通路尚不清楚。
[0109]
2.4 notum对bmp9诱导mefs细胞异位成骨的影响
[0110]
我们将裸鼠随机均分为三组，分别注射经过不同处理的mefs细胞，4周后采集异位成骨标本(图18)。与bmp9组相比，bmp9联合adnotum获得的异位成骨标本略小，而bmp9联合adsinotum获得的异位成骨标本略大。h&e染色结果提示，促进notum抑制bmp9诱导生成骨小梁，而抑制notum得到相反结果(图19)，masson染色结果提示相同内容(图20)。
[0111]
这说明notum在动物体内仍能调控bmp9的成骨潜能，并且其结果与体外实验相似，进一步验证了我们之前的实验结果。
[0112]
2.5 notum调节bmp9成骨潜能依赖于wnt/β-catenin信号通路
[0113]
pcr和wb结果提示，notum下调β-catenin mrna表达和蛋白水平，抑制notum则促进其mrna表达和蛋白水平(图21-图23)。我们进一步检测wnt/β-catenin信号通路标志蛋白，wb结果提示notum可促进gsk-3β的表达(图24)，而抑制其磷酸化；抑制notum则可以抑制gsk-3β的表达，激活其磷酸化(图25)。这些结果提示notum对bmp9诱导的成骨分化的调控可能与wnt/β-catenin信号通路有关。
[0114]
干扰抑制wnt/β-catenin信号通路后，我们发现notum对bmp9诱导成骨分化的调节作用被部分逆转，一定程度上降低了成骨早期标志物ruxn2mrna和蛋白的表达水平(图26和图27)。抑制notum后，bmp9诱导mefs细胞成骨分化中runx2的mrna和蛋白水平升高，但当此时我们抑制wnt/β-catenin信号通路后，我们发现mrna和蛋白水平的runx2表达都降低(图28和图29)。alp染色结果与pcr和wb结果一致(图30和图31)。我们由此得出干扰wnt/β-catenin信号通路可逆转notum对bmp9诱导成骨分化的影响。
[0115]
上述实验结果表明，notum通过wnt/β-catenin信号通路调控bmp9的成骨潜能。notum可调控bmp9诱导的成骨过程，且bmp9与notum蛋白表达水平呈负相关，因此，我们推测notum是bmp9的下游调控因子，notum通过wnt/β-catenin信号通路调控bmp9的成骨潜能，其具体机制仍有待进一步探讨研究。
[0116]
3分析与结论
[0117]
在全球范围内，骨质疏松已成为一种常见疾病并带来巨大经济损失。根据骨质疏松发生机制不同，抗骨质疏松药物通常分为促骨形成药、抑骨吸收药和兼具两种疗效的双重作用药物。以往的研究更多关注抑制骨吸收过程，但其疗效已趋于平缓。近年来，文献显示单独使用促骨形成药或将其与抑骨吸收药联合使用的临床疗效优于单独使用抑骨吸收药。然而，可以单独使用的促骨形成药种类较少，因此，我们迫切需要探究新型促骨形成药。
[0118]
bmp即骨形态发生蛋白，自上世纪六十年代被发现以来，已被证实具有极强的诱导成骨作用。如今，bmp2和bmp7均已被批准临床使用，用于治疗骨折、骨不连等疾病。bmp9作为bmp家族中成骨诱导能力最强的细胞因子之一，具有广阔的应用前景。与其他bmp相比，bmp9具有不依赖noggin蛋白即可调控成骨分化的优势，这使得bmp9可从本质上促进各类干细胞成骨分化，因此，有关bmp9对成骨分化影响的研究也成了本领域的热点。但正因为bmp9强效的促成骨作用，有些学者担心它是否与某些恶性肿瘤的发生有关，例如有文献报道bmp9已被证明能促进肝癌和卵巢癌细胞的增殖，这也成为bmp9投入临床应用的障碍之一。
[0119]
notum作为一种细胞外蛋白，文献报道它能通过影响wnt蛋白与膜蛋白结合来影响wnt/β-catenin信号通路。notum在肝脏系统、消化系统、呼吸系统、神经系统等许多系统中的作用已被报道。在骨组织中，notum也有一定作用。但是目前有关notum在bmp9诱导影响骨代谢的具体机制尚无报道。
[0120]
本发明的发明人所在课题组前期通过rna-seq测序发现notum与bmp9存在相关性并由此展开实验以探究notum对bmp9成骨能力的影响。结果提示，notum可以抑制bmp9的成骨潜能，其机制可能与wnt/β-catenin信号通路有关。bmp9有望被制成新药的基础与其无法实际用于临床的隐患原因为同一个，即其强大的成骨潜能，而notum恰好抑制bmp9的成骨潜能，即两者联合使用也许可以消除研究者们对bmp9使用隐患的担忧，使bmp9的临床使用可能性显著增加。
[0121]
wnt/β-catenin信号通路是一条在多种生理过程中发挥维持稳态作用的信号通路。作为骨代谢的重要信号通路，抑制该通路会减弱骨形成。β-catenin蛋白是wnt/β-catenin信号通路中的重要蛋白，成骨细胞中缺乏β-catenin蛋白的小鼠在出生后即表现出明显的骨量降低，其传导异常也会引起如骨质疏松等多种人类骨骼相关疾病。因此，对wnt/β-catenin信号通路的研究是研究骨骼发育和疾病的深入研究焦点。wnt蛋白、frizzled家族跨膜受体蛋白dishevelled(dsh)、apc、gsk3、β-catenin、axin和tcf/lef家族转录调节因子构成wnt/β-catenin经典信号通路，其中notum与wnt蛋白结合并使其去棕榈酰化，从而影响wnt蛋白与膜蛋白的结合。notum通过修饰细胞表面的硫酸肝素蛋白多糖以调控细胞外wnt蛋白的梯度，从而实现对wnt信号通路的调控。多个研究表明notum在wnt/β-catenin信号通路中起重要的负调控作用。我们由此推测，notum通过wnt/β-catenin信号通路来介导bmp9诱导成骨分化效应。本实验结果表明抑制wnt/β-catenin信号通路可以逆转notum对bmp9诱导成骨的抑制作用，但其具体机制有待进一步研究。
[0122]
综上所述，本发明显示notum可调控bmp9诱导干细胞成骨分化过程，其机制可能与wnt/β-catenin信号通路有关；联用notum与bmp9可能促进bmp9临床应用的进程，从而使bmp9的商用化成为可能，而这也将成为治疗骨质疏松的新策略。