一种中药组合物在制备防治心衰药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种中药组合物在制备防治心衰药物中的应用。


背景技术：

2.心衰，是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的终末阶段。根据心力衰竭发生的缓急，临床可分为急性心力衰竭和慢性心力衰竭。目前，心衰是许多国家和地区唯一明显上升的主要心血管病症，其主要原因是人口老龄化和对其他主要心血管病治疗效果的改善，使冠心病、高血压以及其他患者生存时间延长，发生心衰的机会增加。
3.研究发现，包括心衰在内的心脑血管疾病的发病机理较为复杂，由于西药中的功效成分过于单一，同时西药在治病的同时还可能会带来不良反应，无法全方位消除心脑血管疾病的多种发病诱因。因此，仅依靠西药难以有效地发挥治疗作用。相比而言，中药组合物则具有较高的安全性，可以成为治疗心脑血管疾病的重要补充，广泛运用于冠心病、心绞痛和心衰等各种心脑血管疾病的治疗。
4.目前，对于治疗心脑血管疾病的中药的文献报道逐年增多。cn110123993a公开了一种预防和/或治疗心脑血管疾病的中药组合物，包括：肉桂、红景天、三七、西洋参、藏红花、桂枝、薤白、制附子、川芎、丹参、降香、赤芍、琥珀、珍珠母、冰片、毛冬青、郁金、五味子、红花、酸枣仁和麦冬。cn101020028a公开了一种治疗心脑血管疾病的中药，包括西洋参、黄芪、西归、鸡血藤、藏红花、三七、丹参、川芎、赤芍、桃仁、桂枝、水蛭、地龙、蕲蛇、全蝎、蜈蚣、山楂、勾藤、天麻、郁金、木香、泽泻、槐花、苦参、葛根、草决明、麝香、冰片。cn101129469a公开了一种防治心脑血管疾病的中药组合物，包括西洋参或人参、三七、五味子或南五味子、丹参、冰片。cn101264145a公开了一种治疗心脑血管疾病的中药胶囊，包括椿树籽、丹参、黄芪、甘草、三七、西洋参、红花、桃仁等等。但是，现有的用于治疗心脑血管疾病的中药组合物主要以活血化瘀、理气止痛等思路进行治疗，虽然具有一定的疗效，但由于制剂或处方组成等原因使其起效慢，还存在长期疗效不理想和无法根治的问题，并且对治疗机理并没有探究。另外，治疗心衰等心脑血管疾病的药物由于副作用等原因导致临床应用有限，患者预后差、病死率高仍然是临床研究的重点与难点。因此，寻找新的预防和/或治疗心衰的药物具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在解决上述现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出一种中药组合物在制备防治心衰药物中的应用，所述中药组合物对心衰有良好的治疗和/或预防作用。
6.根据本发明实施例的中药组合物在制备防治心衰药物中的应用，所述中药组合物
包括下列组分：
7.人参150～250份、灵芝120～150份、麝香30～50份、牛黄30～50份、熊胆30～50份、珍珠30～50份、附子100～150份、红花100～150份、蟾酥30～50份、冰片30～50份。
8.发明人经过动物药效学研究，确证了本发明的中药组合物可明显改善慢性心衰大鼠的各项心功能，抑制大鼠心脏形态改变，升高心衰大鼠的左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，lvef)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，lvfs)；降低心衰大鼠的左心室收缩末期内径(left ventricular internal dimension(systole)，lvids)、左室舒张末期内径(left ventricular internal dimension(diastole)，lvidd)，改善心室重构；降低心衰大鼠全心(hw/bw，hwi)及左心室质量指数(lvw/bw，lvwi)，改善心衰大鼠心肌肥厚。另外，本发明的中药组合物能显著改善心衰大鼠心肌病理变化，抑制心肌胶原沉积，减少心肌纤维化，减少炎性细胞浸润；调节抗氧化酶活力，提高抗氧化能力，改善慢性心衰大鼠的氧化应激状态；同时能够改善慢性心衰大鼠的心肌细胞超微结构；以及不经由caspase 3，而是通过上调bcl-2及下调bax、caspase 9蛋白表达量，抑制心肌细胞凋亡。因此，本发明的中药组合物对于治疗和/或预防心衰具有良好的效果。
9.在本发明的一些实施方式中，所述麝香为人工麝香，所述牛黄为体外培育牛黄。
10.在本发明的一些实施方式中，所述中药组合物的制备方法为：
11.取所述中药组合物中各组分，按比例混合。
12.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物为改善心室重构的药物。
13.优选的，所述心室重构为心室扩张。
14.更优选的，所述心室扩张为左心室扩张。
15.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物通过减缓心衰后lvef的降低改善心室重构。与未给药的心衰大鼠相比，施用本发明中药组合物减缓心衰后lvef降低的比率为15％～40％。
16.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物通过减缓心衰后lvfs的降低改善心室重构。与未给药的心衰大鼠相比，施用本发明中药组合物减缓心衰后lvfs降低的比率为20％～60％。
17.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物通过减缓心衰后lvids的升高改善心室重构。与未给药的心衰大鼠相比，施用本发明中药组合物减缓心衰后lvids升高的比率为10％～30％。
18.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物通过减缓心衰后lvidd的升高改善心室重构。与未给药的心衰大鼠相比，施用本发明中药组合物减缓心衰后lvidd升高的比率为5％～10％。
19.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物为改善心肌肥厚的药物。
20.在本发明的一些优选的实施方式中，所述防治心衰药物通过降低lvwi和/或hwi改善心肌肥厚。
21.当心脏受到损伤后，新的心肌细胞不会生成，而是会发生大小、形状、室壁厚度或组织结构等一系列变化，这一形式被称为心室重构。其包括心肌细胞发生炎症反应后导致的心室重构，左心室扩大和心肌收缩能力降低导致的心室重构等。而心肌肥厚的主要特征
是左室心肌肥厚。因此，心室重构与心肌肥厚二者实际具有不同的病理表现，一般来说，应采用不同的药物治疗措施。但本发明的中药组合物可以同时有效改善心室重构和心肌肥厚，具有良好的防治心衰的效果。
22.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物为改善心肌纤维化的药物。
23.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物为抑制炎性细胞浸润的药物。
24.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物为抗氧化药物。
25.具体的，所述防治心衰药物通过提高心衰后cat、gsh-px、sod的酶活力以及降低心衰后ldh、mda的酶活力抗氧化。
26.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物为减少心肌细胞凋亡的药物。
27.优选的，所述凋亡由bax、bcl-2、caspase 9凋亡蛋白介导，而与caspase 3凋亡蛋白无关。
28.更优选的，所述防治心衰药物通过上调bcl-2及下调bax、caspase 9凋亡蛋白表达减少心肌细胞凋亡。
29.在本发明的一些实施方式中，所述防治心衰药物为改善心肌细胞超微结构的药物。
30.在本发明的一些实施方式中，当应用对象为动物(例如大鼠)时，所述中药组合物的有效剂量为5～100mg/kg/d。优选的，所述有效剂量为5～80mg/kg/d、5～60mg/kg/d、5～50mg/kg/d、10～100mg/kg/d、10～80mg/kg/d、10～60mg/kg/d、10～50mg/kg/d。更优选的，所述有效剂量为10～50mg/kg/d。当应用对象为人时，可按照药学领域的相关给药标准，相应折算成人体的给药量。
31.在本发明的一些实施方式中，所述中药组合物还包括药学上可接受的辅料。
32.优选地，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、矫味剂、着色剂、掩味剂、ph调节剂、助悬剂、增稠剂、防腐剂、稳定剂、抗氧剂、润湿剂、表面活性剂、悬浮剂、吸收增强剂和包衣材料中的至少一种。
33.在本发明的一些实施方式中，所述中药组合物为口服制剂。所述口服制剂为口服常释制剂、口服缓释制剂、口服控释制剂中的任意一种。
34.优选的，所述口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、膏剂、粉剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂和口服乳剂中的任意一种。
35.根据本发明实施方式的中药组合物，至少具备如下有益效果：
36.本发明的中药组合物具有改善心功能，抑制心脏形态改变，改善心肌病理变化，减少心肌细胞凋亡，改善心肌细胞超微结构的作用以及抗氧化能力；为治疗和/或预防心衰提供了新的思路和选择。
37.本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
38.本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非
旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
附图说明
39.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
40.图1为各组大鼠超声心动图指标对比图。
41.图2为各组大鼠超声心动图，其中，a～g分别为sham组、chf组、cap组、qlqx组、zy-h组、zy-m组、zy-l组。
42.图3为各组大鼠心脏形态图。
43.图4为各组大鼠全心质量指数及左心室质量指数的对比图。
44.图5为各组大鼠血清氧化应激指标的对比图。
45.图6为各组大鼠心肌组织he切片结果图(200
×
)，其中，a～g分别为sham组、chf组、cap组、qlqx组、zy-h组、zy-m组、zy-l组。
46.图7为各组大鼠masson切片结果图(100
×
)，其中，a～g分别为sham组、chf组、cap组、qlqx组、zy-h组、zy-m组、zy-l组。
47.图8为各组大鼠心肌组织阳性面积比率的对比图。
48.图9为tunel法检测各组大鼠心肌细胞凋亡图(400
×
)，其中，a～g分别为sham组、chf组、cap组、qlqx组、zy-h组、zy-m组、zy-l组。
49.图10为透射电镜下各组大鼠心肌细胞的超微结构改变图(7000
×
)，其中，a～g分别为sham组、chf组、cap组、qlqx组、zy-h组、zy-m组、zy-l组。
50.图11为各组大鼠心肌组织中bax、bcl-2、caspase 3、caspase 9蛋白的表达量结果图。
具体实施方式
51.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
52.另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
53.以下实施例及说明书附图中所用的术语的缩写定义如下：
54.cat：过氧化氢酶(catalase)；
55.gsh-px：谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)；
56.sod：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)；
57.ldh：乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)；
58.mda：丙二醛(malondialdehyde)。
59.实施例
60.实施例1中药组合物及其制备
61.本发明实施例中所使用的中药组合物各成分的用量配比为：人参150～250份、灵芝120～150份、麝香30～50份、牛黄30～50份、熊胆30～50份、珍珠30～50份、附子100～150份、红花100～150份、蟾酥30～50份、冰片30～50份。
62.中药组合物的制备方法为：取所述中药组合物中各组分，按比例混合。
63.实施例2中药组合物对心衰大鼠的治疗作用
64.1.实验材料及动物
65.1.1主要实验材料
66.卡托普利片，来自国药集团汕头金石制药有限公司，货号200104；芪苈强心胶囊，来自石家庄以岭药业股份有限公司，货号b2005001；sod、ldh、mda、gsh-px、cat试剂盒均来自南京建成生物工程研究所；bax、bcl-2、caspase 3、caspase 9抗体均来自affiniti bioscience。
67.1.2实验动物
68.spf级sd大鼠，雄性，体重160～200g，购自广东省医学实验动物中心，动物质量合格证明编号为：no.44007200077920，许可证号为：scxk(粤)2018-0002。动物饲养于广州中医药大学中药学院实验动物房屏障环境，实验单位使用许可证编号为：syxk(粤)2019-0202。大鼠饲养于专用ivc笼盒，饲养环境温度为24℃～26℃，湿度为40％～60％，照明时长为12h(8:00-20:00)，大鼠给予正常spf级饲料及无菌水，定期更换垫料、消毒笼具，适应性饲养7天后进行实验。
69.2.实验方法
70.2.1心衰大鼠模型的制备及分组
71.大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉，取仰卧位，正常消毒并暴露腹腔，将内脏置于腹侧位，逐步暴露腹主动脉，轻缓钝性分离腹主动脉，在右肾动脉与腹腔动脉之间穿线，对右肾动脉上方约0.5cm处的腹主动脉进行结扎，缩窄程度达到40％～60％。术后常规抗感染3天并密切观察动物反应。
72.术后1周大鼠按体重随机分为7组：模型组(chf)、中药组合物高剂量组(zy-h)、中药组合物中剂量组(zy-m)、中药组合物低剂量组(zy-l)、中成药芪苈强心胶囊组(qlqx)、西药卡托普利组(cap)，假手术组(sham)，每组6只。除假手术组以外，其余各组为造模大鼠，假手术组仅在腹主动脉相同部位穿线但未结扎，其余处理同上。
73.给药组按人鼠剂量换算，按照中药组合物高、中、低剂量组浓度比为4:2:1，且最低浓度为等效剂量组的给药浓度，则中药组合物高、中、低剂量组每日灌胃剂量分别为48mg/kg、24mg/kg、12mg/kg。结合相关文献报道，阳性药每日给药剂量为：芪苈强心胶囊组剂量为0.5g/kg，卡托普利组剂量为10mg/kg。按10ml/kg灌胃体积给予相应药物，假手术组和模型组给予0.5％羧甲基纤维素钠溶液(0.5％cmc)，造模1周后开始灌胃给药，每天1次，连续给药20周。
74.2.2观察动物的一般情况
75.每周称量并记录大鼠体重，每日观察大鼠活动量、进食及饮水情况、毛发状态、精神状态、呼吸变化、肢体发绀、水肿等情况。
76.2.3超声心动图检测
77.于末次给药后第二天，所有大鼠以异氟烷吸入性麻醉。使用vevo 2100小动物超声
仪上配备的10s探头进行检测。取胸骨旁左室短轴切面，由二维超声引导m型曲线并进行测量。测量指标包括：lvidd、lvids、lvef以及lvfs。各指标均在连续3个心动周期上测量后取其平均值。
78.2.4心脏重量检测
79.大鼠腹主动脉采血安乐致死后，迅速打开大鼠胸腔，取出心脏，以4℃生理盐水清洗干净并剪掉筋膜、左右心房等组织，用滤纸吸干水分，于精密电子天平上称量并记录全心重量(hw)，然后采用相机对心脏进行规范拍照，按室间隔分离右心室并保留左心室，称量并记录左心室质量(lvw)。心脏质量(hw)/体质量(bw)比值(g/kg)作为心脏质量指数(hwi)，左心室质量(lvw)/体质量(bw)比值(g/kg)作为左心室质量指数(lvwi)。
80.2.5氧化应激指标检测
81.取血清，测定血清中ldh、sod、mda、cat以及gsh-px的含量。
82.2.6病理检测
83.沿室间隔分离左心室，置入冷冻管，并立即冻存于液氮罐中以备用；一部分组织置于4％多聚甲醛溶液中固定，常规制作石蜡切片，进行he、masson染色，观察心肌细胞和胶原形态变化。使用成像系统采集组织染色切片上的图像，利用分析软件自动读取组织测量区域，计算测量区域中的阳性面积以及组织面积，并计算出阳性面积占比。
84.2.7 tunel法检测
85.左心室组织经4％多聚甲醛固定，固定状态良好后，严格按照病理实验检查sop程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片最后镜检合格的样片。判断标准：正常心肌细胞细胞核染呈蓝色；凋亡心肌细胞核染呈棕黄色。
86.2.8透射电镜观察
87.取心尖组织1mm
×
1mm
×
1mm，迅速投入电镜固定液4℃固定2-4h。0.1m磷酸缓冲液pbs(ph7.4)漂洗3次，每次15min。1％的锇酸
·
0.1m磷酸缓冲液pbs(ph7.4)室温(20℃)固定2h。0.1m磷酸缓冲液pbs(ph7.4)漂洗3次，每次15min。组织依次入50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％酒精-100％丙酮-100％丙酮上行脱水，每次15min。丙酮:812包埋剂＝1:1处理2-4h，丙酮︰812包埋剂＝1︰2渗透过夜，纯812包埋剂5-8h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜。60℃烤箱聚合48h。超薄切片机切片60-80nm超薄切片。铀铅双染色(2％醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，各染色15min)，切片室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
88.2.9 western blot检测相关凋亡蛋白表达
89.取适量组织处理后，取上清液采用bca法测定蛋白浓度计算上样体积，再加入loading buffer放入沸水中煮沸10min，冷却后即可进行样品电泳、电转、封闭、孵育一抗、二抗和显色等操作。检测组织中凋亡相关蛋白caspase 9、caspase 3、bcl-2、bax的表达水平。
90.2.10统计学分析
91.以上实施例采用spss 22.0分析软件进行实验数据分析，实验数据首先进行正态分布分析，不符合正态分布时使用m(p25，p75)描述；符合正态分布时，实验中所有数据以平均值
±
标准差表示，使用比较平均值中单因素分析(one-way anova)方法进行统计分析，若符合方差齐性，则采用lsd法统计分析，若不符合方差齐性，则采用dunett’s t3法
分析；不符合正态分布及方差齐性时，采用非参数mann-whitney检测；p《0.05、p《0.01表示有显著差异。使用graphpad prism 6.0软件制图。
92.3.实验结果
93.3.1一般情况
94.sham组大鼠活动正常，进食及饮水正常，毛发顺滑有光泽，未见肢体紫绀、水肿等现象。chf组大鼠毛发干燥无光泽，活动量明显降低，呼吸频率较快，进食量降低，四肢出现紫绀及轻度水肿现象。各给药组大鼠的进食量、活动量、毛发、肢体紫绀及水肿现象较chf组均有所改善。
95.3.2超声心动图检测结果
96.如表1和图1所示，chf组大鼠lvids、lvidd值较sham组明显升高(p《0.01)，而与chf组大鼠相比，给药组均能降低这两个值(除zy-l组lvidd值外，p《0.05，p《0.01)。与未给药的心衰大鼠相比，施用本发明中药组合物减缓心衰后lvidd升高的比率为6.2％～9.7％；与未给药的心衰大鼠相比，施用本发明中药组合物减缓心衰后lvids升高的比率为14.9％～26.8％；提示本发明的中药组合物可抑制心衰大鼠心室重构。与sham组对比，chf组的lvef及lvfs值显著降低(p《0.01)，且lvef值低于60％，说明本发明中的造模方法成功。此外，各给药组的lvef、lvfs值明显高于chf组(p《0.05，p《0.01)。与未给药的心衰大鼠相比，施用本发明中药组合物减缓心衰后lvef降低的比率为18.8％～36.8％；与未给药的心衰大鼠相比，施用本发明中药组合物减缓心衰后lvfs降低的比率为23.6％～50％。另外，值得注意的是，中药组合物对lvids、lvidd值的降低作用以及lvef、lvfs值的升高作用呈现明显的剂量依赖性。
97.表1各组大鼠超声心动图指标的对比(n＝6)
[0098][0099]
注：lvids：左室收缩末期内径；lvidd：左室舒张末期内径；lvef：左室射血分数；lvfs：左室短轴缩短率。与sham组比较，
**
p《0.01；与chf组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0100]
如图2所示，5个给药组均可以显著抑制心衰大鼠左心室腔扩张和减少心肌肥厚，心功能明显优于模型组大鼠，其中zy-h组的效果最为明显。
[0101]
综上结果，本发明的中药组合物可明显改善心衰大鼠的心功能水平。
[0102]
3.3心脏形态观察
[0103]
如图3所示，chf组大鼠心脏发生心室重构，左心室明显扩大，心肌组织肥厚明显。虽然，相较于sham组，中药组合物各剂量组大鼠心脏大小、心肌肥厚情况仍有不同程度的增大，但心脏形态改变情况较模型组有所改善。表明本发明的中药组合物可明显缓解心衰大鼠心室重构，减轻左心室扩大，抑制心肌组织肥厚。
[0104]
3.4心脏及左心室质量指数
[0105]
如表2和图4所示，chf组大鼠的hwi及lvwi较sham组明显增大(p《0.01)，而给药干预后，所有给药组大鼠的hwi和lvwi值均较chf组显著降低(p《0.01，p《0.05)。上述结果表明本发明的中药组合物可以有效降低心衰大鼠的全心和左心室质量指数，可以有效地缓解左心室向心性重构。
[0106]
表2各组大鼠全心质量指数及左心室质量指数的比较(n＝6)
[0107][0108]
注：hwi：心脏质量指数；lvwi：左心室质量指数。与sham组比较，
**
p《0.01；与chf组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0109]
3.5氧化应激指标
[0110]
如表3和图5所示，chf组大鼠cat、gsh-px、sod酶活力显著低于sham组(p《0.01)，而chf组大鼠的ldh及mda酶活力明显高于sham组(p《0.01)。给药20周后，给药组能明显提高心衰大鼠cat、gsh-px、sod酶活力及降低ldh、mda酶活力(除zy-l组的cat及sod，p《0.05，p《0.01)。并且，中药组合物对cat、gsh-px、sod酶活力的提高作用以及对ldh、mda酶活力的降低作用呈现剂量依赖性。结果提示本发明的中药组合物可提高心衰大鼠抗氧化能力，从而改善氧化应激状态。
[0111]
表3各组大鼠血清氧化应激指标的比较(n＝6)
[0112][0113]
注：cat：过氧化氢酶；gsh-px：谷胱甘肽过氧化物酶；sod：超氧化物歧化酶；ldh：乳酸脱氢酶；mda：丙二醛。与sham组比较，
**
p《0.01；与chf组比较，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0114]
3.6he切片和masson切片
[0115]
如图6所示，sham组大鼠心肌细胞排列规律整齐，细胞核明显可见，胞质染色均一，未见心肌细胞肥大、炎性细胞浸润及心肌细胞凋亡坏死等病变。chf组大鼠心肌细胞排列紊乱，大小不一，胞质染色深浅不一，心肌细胞数量减少，较多结缔组织增生，大量炎性细胞浸润并可见较大范围的损伤灶。给药组大鼠心肌病变程度较chf组显著改善，心肌细胞排列较整齐，胞质染色较均匀，较少量心肌细胞肥大，轻度炎性细胞浸润，且未见大面积损伤灶，其中cap组和zy-h组改善心肌组织病变更明显。
[0116]
如表4和图7、8所示，心肌细胞masson染色后，心肌细胞呈现红色，心肌胶原纤维呈现蓝色。sham组大鼠心肌未见或仅出现少量胶原纤维组织分布。chf组大鼠心肌组织出现大量胶原纤维沉积，心肌纤维化严重，阳性面积比率明显增大，与sham组比较具有统计学意义(p《0.01)。各给药组可明显改善心肌纤维化，阳性面积比率较chf组明显降低(p《0.01)，其中cap组和zy-h组减低心肌纤维化程度最为明显。结果表明，本发明的中药组合物可以明显改善心衰大鼠心肌组织病变和心肌纤维化程度。
[0117]
表4各组大鼠心肌组织阳性面积比率的比较(n＝6)
[0118][0119]
注：与sham组比较，
**
p《0.01；与chf组比较，
##
p《0.01。
[0120]
3.7tunel法检测心肌细胞凋亡结果
[0121]
如图9所示，400
×
光镜下，sham组心肌细胞核呈蓝色长梭形，排列规整。与sham组比较，chf组心肌细胞棕褐色坏死颗粒物质明显增多。与chf组比较，阳性药组及中药组合物高、中、低剂量组中心肌细胞棕褐色坏死颗粒物质明显减少。中药组合物高、中、低剂量组中，高剂量组心肌细胞棕褐色坏死颗粒物质与cap组相当，且少于qlqx组。结果表明本发明的中药组合物可明显减少心衰大鼠心肌细胞的凋亡。
[0122]
3.8心肌细胞超微结构观察结果
[0123]
如图10所示，电镜可见模型组心肌细胞内中度水肿，肌原纤维明显减少、稀疏，肌节非对称性排布，线粒体减少，增大，肿胀，结构紊乱，线粒体间可见脂滴，心肌肌浆网明显扩张，空泡化，z线结构不明显，局部断裂，长短不一，h带局部结构断裂、不连续。而中药组合物组心肌肌原纤维排列整齐，肌节、明暗带结构清晰，线粒体呈轻度肿胀，排列较整齐，结构较清楚，线粒体嵴存在、排列尚整齐，心肌肌浆网轻度扩张，z线及h带结构较清晰、连续，完整。
[0124]
3.9 western blot检测bax、bcl-2、caspase 3、caspase 9蛋白表达结果
[0125]
如表5及图11所示，与sham组比较，chf组中bax蛋白表达量显著升高(p《0.01)，各给药组能明显降低该蛋白表达量(p《0.01)。而chf组中bcl-2蛋白表达量较sham组降低(p《0.05)，qlqx组及中药组合物各剂量组相较于chf组bcl-2蛋白表达量增加(p《0.01)。值得注
意的是，chf组中caspase 3及caspase 9蛋白表达量虽高于sham组，但各给药组的caspase 3蛋白表达与chf组无明显差异。而在caspase 9蛋白表达上，仅中药组合物各剂量组较chf组明显下降(p《0.01)。上述结果提示，本发明的中药组合物可通过上调bcl-2及下调bax、caspase 9蛋白表达量调控心肌细胞凋亡。
[0126]
表5各组大鼠心肌组织凋亡蛋白表达量(n＝3)
[0127][0128]
注：与sham组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与chf组比较，
##
p《0.01。
[0129]
综上，实验结果表明，本发明的中药组合物具有显著的保护心肌细胞，改善心肌病理变化和心功能的作用，在治疗和/或预防心衰方面具有一定的潜力。
[0130]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。