本申请要求于2019年2月25日提交的美国临时申请第62/810171号的权益，并且该美国临时申请通过引用以其整体并入本文。
发明背景
(1)发明领域
本申请总体上涉及良性前列腺增生(BPH)的治疗。更具体地，提供了用高度选择性polo样激酶1(PLK1)抑制剂进行的BPH的治疗。
(2)相关技术的描述
良性前列腺增生(BPH)通常与下尿路症状(LUTS)相关，其由于BPH中的前列腺肥大和增加的前列腺平滑肌张力导致的尿道压迫(Hennenberg等人，2014)。这种症状性BPH的状况，被称为膀胱出口梗阻(BOO)，通常需要药物治疗(Oelke等人，2013)。然而，这即使在轻度至中度LUTS中具有的有效性也有限，并且不适用于重度LUTS(Oelke等人，2013)。与改善的限制形成对比的是高病例数，2018年全世界约有6亿具有梗阻症状的患者(Irwin等人，2011)。由于患病率的年龄依赖性以及人口转变，提示BPH的LUTS的重要性将进一步增加，对具有更高有效性的新医学疗法提出了高的需求。
根据前列腺平滑肌张力和前列腺生长对提示BPH的LUTS的贡献，BPH中的医学治疗旨在抑制1)前列腺平滑肌收缩以快速改善症状，和2)前列腺生长以防止BPH进展和并发症(Oelke等人，2013)。前列腺平滑肌收缩部分地由在肾上腺素能神经传递期间释放的去甲肾上腺素激活α1-肾上腺素受体引起(Hennenberg等人，2014)。因此，α1-肾上腺素受体拮抗剂(“α1-阻断剂”)是提示BPH的LUTS的治疗的第一线选择，因为它们可以通过松弛前列腺平滑肌来减轻BOO(Caine等人，1975，1976；Oelke等人，2013)。然而，它们对症状的减轻(国际前列腺症状评分，IPSS)和对尿流(Q最大)的改善不超过50％，而甚至安慰剂也可以引起高达30％的改善(Hennenberg等人，2014，2017；Oelke等人，2013；Strand等人，2017)。磷酸二酯酶-5抑制剂他达拉非(tadalafil)最近已经被批准用于治疗梗阻性LUTS，但其有效性并不高于α1-阻断剂的有效性(Dahm等人，2017)。5α-还原酶抑制剂(5-ARI)被应用于阻止前列腺生长，目的是减小前列腺尺寸和防止BPH进展(Oelke等人，2013)。然而，症状进展的风险可以被单一疗法降低不超过35％-40％，并且被联合疗法降低66％(Strand等人，2017)。医学LUTS疗法的令人失望的结果导致了高停药率，数量高达70％的患者在首次开具处方之后12个月内停药(Cindolo等人，2015)。后果是BPH的疾病进展、住院和手术(Cindolo等人，2015)。α1-阻断剂的局限性可能源自非肾上腺素能介质对前列腺平滑肌张力的贡献(包括内皮素-1)，其与α1-肾上腺素受体并行地诱导前列腺平滑肌收缩(Hennenberg等人，2014，2017)。
polo样激酶(PLK)是丝氨酸-苏氨酸激酶，并且主要与促进不同细胞类型中的增殖相关，所述不同细胞类型包括气道平滑肌细胞、前列腺癌细胞以及其他(Jiang和Tang，2015；Lin等人，2019；Shao等人，2015)。此外，最近的发现表明了PLK1的促进气道、血管和人类前列腺平滑肌收缩的功能(de Carcer等人，2017；Hennenberg等人，2018；Li等人，2016)。然而，PLK抑制剂与α1-阻断剂在前列腺平滑肌收缩中的加性作用，以及它们对前列腺基质细胞生长的作用尚不清楚。
onvansertib
onvansertib(也被称为PCM-075，NMS-1286937，NMS-937，美国专利8,927,530中的“式(I)的化合物”；IUPAC名称1-(2-羟乙基)-8-{[5-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-4,5-二氢-1H-吡唑并[4,3-h]喹唑啉-3-甲酰胺)是第一个进入临床试验的通过口服途径施用的PLK1特异性ATP竞争性抑制剂，在不同的临床前模型中证明具有抗肿瘤活性。onvansertib具有有利的药理学参数和良好的口服生物利用度。onvansertib具有超过其他PLK1抑制剂的若干优点，包括对PLK1同工酶的非常高的选择性和非常高的口服生物利用度。onvansertib对于PLK1具有2nM的IC50，并且对于PLK2和PLK3为>10,000。
发明概述
提供了一种治疗患者的良性前列腺增生(BPH)的方法。该方法包括用(a)onvansertib和(b)α1-阻断剂、5-α-还原酶抑制剂、磷酸二酯酶-5酶抑制剂或其组合治疗患者。
还提供了抑制平滑肌的非肾上腺素能收缩的方法。该方法包括用onvansertib处理平滑肌。
另外提供了一种抑制人类前列腺细胞的增殖的方法。该方法包括用onvansertib以足以抑制人类前列腺细胞的增殖的方式处理人类前列腺细胞。
附图的若干个视图的简要描述
图1A、图1B和图1C是示出onvansertib对人类前列腺条(prostate strips)的肾上腺素能收缩的影响的图。在器官浴槽中，在添加100nM或1μM的浓度的onvansertib或DMSO(对照)之后，通过去甲肾上腺素(图1A)诱导，或通过α1-肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素和甲氧明(图1B)诱导，或在洗去DMSO和onvansertib(100nM)持续30min后通过去甲肾上腺素(图1C)诱导人类前列腺条的收缩。在每个实验中，DMSO和onvansertib被应用于从相同前列腺获得的单独的样品。为了消除由于个体差异、不同程度的BPH或其他不同的平滑肌含量(smooth muscle content)引起的异质性，张力被表示为通过高摩尔KCl产生的收缩的百分比，所述通过高摩尔KCl产生的收缩在应用onvansertib或DMSO之前进行评估。数据是来自n＝5(去甲肾上腺素与100nM onvansertib，不洗去)、n＝6(去甲肾上腺素与1μMonvansertib)、n＝5(苯肾上腺素)、n＝5(甲氧明)和n＝5(去甲肾上腺素，洗去之后)名患者的一系列组织的平均值±S.E.M.，其中来自每个患者的样品被分配给对照组和抑制剂组二者(#在指示浓度进行多变量分析之后P<0.05；双向ANOVA之后全部组的P值如插页所示)。
图2是示出onvansertib对人类前列腺条的非肾上腺素能收缩的影响的图。在器官浴槽中，在添加100nM的浓度的onvansertib或DMSO(对照)之后，通过内皮素-1、ATP或血栓素A2类似物U46619诱导人类前列腺条的收缩。在每个实验中，DMSO和onvansertib被应用于从相同前列腺获得的单独的样品。为了消除由于个体差异、不同程度的BPH或其他不同的平滑肌含量引起的异质性，张力被表示为通过高摩尔KCl产生的收缩的百分比，通过高摩尔KCl产生的收缩在应用onvansertib或DMSO之前进行评估。数据是来自n＝6(内皮素-1)、n＝5(ATP)和n＝5(U46619)名患者的一系列组织的平均值±S.E.M.，其中来自每个患者的样品被分配给对照组和抑制剂组二者(双向ANOVA之后全部组的P值如插页所示)。
图3A和图3B是示出onvansertib对EFS诱导的人类前列腺条收缩的影响的图。在器官浴槽中，在添加100nM或1μM的浓度的onvansertib或DMSO(对照)(图3A)之后，以及在洗去DMSO和onvansertib(100nM)持续30min后(图3B)，通过EFS诱导人类前列腺条的收缩。在每个实验中，DMSO和onvansertib被应用于从相同前列腺获得的单独的样品。为了消除由于个体差异、不同程度的BPH或其他不同的平滑肌含量引起的异质性，张力被表示为通过高摩尔KCl产生的收缩的百分比，通过高摩尔KCl产生的收缩在应用onvansertib或DMSO之前进行评估。数据是来自n＝6(DMSO对比100nM onvansertib，无洗去)、n＝7(DMSO对比1μMonvansertib)和n＝5(DMSO对比100nM onvansertib，洗去之后)名患者的一系列组织的平均值±S.E.M.，其中来自每个患者的样品被分配给对照组和抑制剂组二者(双向ANOVA之后全部组的P值如插页所示)。
图4A和图4B是示出α1-阻断剂对人类前列腺条的收缩的影响的图。在器官浴槽中，在添加坦索罗辛(300nM)、西洛多辛(100nM)或等体积的含1％DMSO的蒸馏水(对照)之后，通过EFS(图3A)或去甲肾上腺素(图4B)诱导人类前列腺条的收缩。在每个实验中，溶剂或α1-阻断剂被应用于从相同前列腺获得的单独的样品。为了消除由于个体差异、不同程度的BPH或其他不同的平滑肌含量引起的异质性，张力被表示为通过高摩尔KCl产生的收缩的百分比，通过高摩尔KCl产生的收缩在应用α1-阻断剂或溶剂之前进行评估。数据是来自n＝5(EFS/坦索罗辛)、n＝5(EFS/西洛多辛)、n＝5(去甲肾上腺素/坦索罗辛)和n＝6(去甲肾上腺素/西洛多辛)名患者的一系列组织的平均值±S.E.M.，其中来自每个患者的样品被分配给对照组和抑制剂组二者(#在指示浓度进行多变量分析之后P<0.05；双向ANOVA之后全部组的P值如插页所示)。
图5A和图5B是示出与单独的α1-阻断剂相比，onvansertib与α1-阻断剂的组合对EFS诱导的人类前列腺条收缩的影响的图。在器官浴槽中，在添加坦索罗辛(300nM)、西洛多辛(100nM)、onvansertib(100nM)或者onvansertib(100nM)与坦索罗辛或西洛多辛的组合，以及等量的溶剂(DMSO作为单独缺乏onvansertib至α1-阻断剂的对照，或者水/DMSO作为单独缺乏α1-阻断剂至onvansertib的对照)之后，通过EFS诱导人类前列腺条收缩。在每个实验中，α1-阻断剂或onvansertib以及组合被应用于从相同前列腺获得的单独的样品。每幅图代表使用不同前列腺组织的独立系列的实验(但是在每幅图中将来自相同前列腺的样品分配给两个组)。为了消除由于个体差异、不同程度的BPH或其他不同的平滑肌含量引起的异质性，张力被表示为通过高摩尔KCl产生的收缩的百分比，通过高摩尔KCl产生的收缩在应用onvansertib、α1-阻断剂或DMSO之前进行评估。数据是来自n＝7(坦索罗辛对比坦索罗辛与onvansertib)、n＝5(西洛多辛对比西洛多辛与onvansertib)、n＝5(onvansertib对比坦索罗辛与onvansertib)和n＝5(onvansertib对比西洛多辛与onvansertib)名患者的一系列组织的平均值±S.E.M.，其中来自每个患者的样品被分配给对照组和抑制剂组二者(#在指示浓度进行多变量分析之后P<0.05；双向ANOVA之后全部组的P值如插页所示)。
图6A、图6B、图6C和图6D是示出人类前列腺组织和WPMY-1细胞中PLK1检测的照片(图6A)和图。图6A示出了使用针对PLK1产生的抗体对人类前列腺组织(n＝4名患者)和WPMY-1细胞(来自n＝4个独立实验的样品)进行的蛋白质印迹分析的结果。示出了PLK1的预期分子量(68kDa)的尺寸的条带。标志物条带的位置和尺寸在每个印迹的右侧指示(尺寸以kDa计)。图6B示出了推定的PLK1条带的相对强度。在(图6A)中68kDa条带的密度定量后，所有样品的任意单位被归一化至前列腺组织获得的值的平均值。示出了所有样品的值和两个组的中位数。图6C示出了人类前列腺组织(n＝6名患者)和WPMY-1细胞(来自n＝4个独立实验的样品)中的PLK1的相对mRNA表达。RT-PCR的Ct值表示为2-ΔCP，并且最终归一化至前列腺组织获得的平均值。示出了所有样品的值和两个组的中位数。图6D示出了通过RT-PCR在人类前列腺组织中检测PLK1和PSA得到的2-ΔCP值针对彼此进行作图，并且进行Spearman相关性分析。
图7A、图7B和图7C是示出onvansertib对WPMY-1细胞的活力和增殖的影响的图和显微照片。图7A是示出暴露于所指示的浓度的onvansertib或溶剂并且持续所指示的时间段后，通过CCK-8测定评估WPMY-1细胞的活力的图。数据是来自每个设置的n＝5个独立实验的平均值±S.E.M.(#P<0.05对比对应的对照)。图7B是示出通过集落形成测定评估的增殖的图和显微照片。WPMY-1细胞暴露于指定浓度的onvansertib。示出了代表性显微照片，以及来自n＝5个独立实验的平均值±S.E.M.(#P<0.05对比对照)。图7C是示出通过EdU测定评估的增殖的图和显微照片。WPMY-1细胞暴露于指定浓度的onvansertib持续24h。增殖细胞的核以粉色示出，而非增殖细胞的核以蓝色示出。示出了代表性图片，以及来自n＝5个独立实验的平均值±S.E.M.(#P<0.05对比对照)。
发明详述
如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。此外，“或”的使用意图包括“和/或”，除非上下文另外清楚地指示。
本发明部分地基于发现高度选择性polo样激酶1(PLK1)抑制剂onvansertib有效地抑制平滑肌诸如人类前列腺组织的肾上腺素能和非肾上腺素能收缩二者。这是令人惊讶的，因为其他PLK1抑制剂抑制平滑肌的肾上腺素能收缩，但不抑制平滑肌的非肾上腺素能收缩(Hennenberg等人，2018)。因为onvansertib抑制平滑肌的非肾上腺素能收缩，特别是内皮素-1诱导的和ATP(嘌呤能)诱导的平滑肌收缩(参见下文的实施例)，onvansertib可以有效地与肾上腺素能平滑肌收缩的抑制剂例如α1-阻断剂组合，以治疗良性前列腺增生(BPH)。
因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗患者的良性前列腺增生(BPH)的方法。方法包括用(a)onvansertib和(b)α1-阻断剂、5-α-还原酶抑制剂、磷酸二酯酶-5酶抑制剂或其组合治疗患者。因为onvansertib通过不同于α1-阻断剂、5-α-还原酶抑制剂或磷酸二酯酶-5酶抑制剂的机制来抑制平滑肌收缩，所以联合治疗优于任何单独的抑制剂。实际上，onvansertib和坦索罗辛或西洛多辛(两者都是α1-阻断剂)的联合治疗对前列腺平滑肌组织的抑制程度大于任何单独的化合物(参见下文的实施例)。
在一些实施方案中，方法对BPH的症状的减轻或对尿流(Q最大)的改善大于30％。在其他实施方案中，方法对尿流(Q最大)的改善大于50％。
在各种实施方案中，用onvansertib和α1-阻断剂治疗患者。α1-阻断剂的非限制性实例是西洛多辛、坦索罗辛、阿夫唑嗪(alfuzosin)、多沙唑嗪(doxazosin)、哌唑嗪(prazosin)和特拉唑嗪(terazosin)。5-α-还原酶抑制剂的非限制性实例是度他雄胺(dutasteride)和非那雄胺(finasteride)。磷酸二酯酶-5抑制剂的非限制性实例是阿伐那非(avanafil)、洛地那非(lodenafil)、米罗那非(mirodenafil)、西地那非(sildenafil)、他达拉非、伐地那非(vardenafil)、乌地那非(udenafil)、扎普司特(zaprinast)、benzamidenafil和达生他非(dasantafil)。
还提供了抑制平滑肌的非肾上腺素能收缩的方法。方法包括用onvansertib处理平滑肌。
这种方法可以用于抑制任何非肾上腺素能平滑肌收缩。在一些实施方案中，平滑肌收缩是内皮素-1诱导的或ATP诱导的(嘌呤能的)。
在该方法的各种实施方案中，平滑肌是前列腺组织，例如，人类前列腺组织，尽管该方法应有效地抑制任何哺乳动物的任何组织中的非肾上腺素能平滑肌收缩。在一些实施方案中，前列腺组织在患有良性前列腺增生(BPH)的患者中。
另外提供了一种抑制前列腺细胞的增殖的方法。方法包括用onvansertib以足以抑制人类前列腺细胞的生长的方式处理前列腺细胞。在各种实施方案中，前列腺细胞在患有BPH的人类患者中，尽管该方法应在任何哺乳动物中在体外或体内有效地抑制前列腺细胞增殖。
在这些方法的一些实施方案中，细胞还暴露于抑制人类前列腺细胞的增殖的第二药物。第二药物可以是已知至少部分地有效抑制人类前列腺细胞的生长的任何药物。这样的第二药物的非限制性实例是二甲双胍(Wang等人，2017)。
在本文提供的任何方法中，onvansertib可以通过本领域已知的任何手段施用。在一些实施方案中，onvansertib在药学上可接受的赋形剂中口服施用。可以通过本领域已知的方法确定有效抑制任何特定患者的平滑肌组织收缩或前列腺细胞增殖的onvansertib的剂量，而不进行过度实验。在一些实施方案中，施用的onvansertib的剂量大于6mg/m2/天、12mg/m2/天或24mg/m2/天。在这些实施方案中的一些中，onvansertib的剂量小于50mg/m2/天，例如24mg/m2/天或36mg/m2/天。
在onvansertib与另外的药物一起施用的实施方案中，onvansertib可以在另外的药物之前、同时或之后施用。此外，onvansertib和第二药物可以以不同或相同的时间表施用，例如，每日施用、5天施用 2天不施用，等等。
优选的实施方案在以下的实施例中被描述。通过考虑本文公开的说明书或本发明的实践，本文的权利要求书的范围内的其他实施方案对于本领域技术人员将是明显的。意图本说明书连同实施例仅被认为是示例性的，本发明的范围和精神由实施例之后的权利要求书来指示。
实施例.onvansertib在人类良性前列腺增生中对前列腺平滑肌功能的影响
实施例概要
前列腺平滑肌收缩和前列腺肥大对提示良性前列腺增生的下尿路症状有贡献。最近的证据展示出，polo样激酶(PLK)的抑制剂抑制人类前列腺组织的平滑肌收缩。然而，它们对α1-阻断剂的加性作用以及对前列腺生长的作用尚不清楚。在这里，我们检查了一种新颖且高度选择性的PLK1抑制剂onvansertib单独和与α1-阻断剂组合对前列腺平滑肌收缩的影响，以及对前列腺基质细胞(WPMY-1)的增殖和活力的影响。前列腺组织由根治性前列腺切除术获得。在器官浴槽中研究收缩。通过板集落(plate colony)、EdU和CCK-8测定评估增殖和活力。电场刺激(EFS)诱导的人类前列腺组织收缩在32Hz时被100nM和1μM onvansertib抑制到34％，并且被α1-阻断剂坦索罗辛和西洛多辛抑制到48％和47％。与单独的α1-阻断剂(分别为59％和61％)和单独的onvansertib(两者均为68％)相比，onvansertib与坦索罗辛或西洛多辛的组合进一步减少EFS诱导的收缩。去甲肾上腺素、苯肾上腺素、甲氧明、内皮素-1和ATP诱导的收缩被onvansertib(100nM)抑制到类似的程度。WPMY-1细胞的活力和增殖以浓度和时间依赖的方式(24h-72h，10nM-100nM)降低。onvansertib抑制神经源性、肾上腺素能、内皮素-1和ATP诱导的人类前列腺平滑肌收缩和基质细胞增殖。α1-阻断剂使收缩减少不超过50％。α1-阻断剂与onvansertib的组合提供了前列腺收缩的加性抑制。
材料和方法
人类前列腺组织
人类前列腺组织从经历前列腺癌的根治性前列腺切除术的患者(n＝107)获得。先前经历经尿道前列腺切除术(TURP)的患者被排除。这项研究根据世界医学协会(World Medical Association)的赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)进行，并且已经得到了德国路德维希-马克西米利安-慕尼黑大学伦理委员会的批准(Ethikkommission bei der LMU München，批准文号19-737)。从所有患者获得了知情同意。根据伦理批准，样品和数据是匿名收集和分析的，因此没有存储关于患者特征的数据。前列腺切除术之后立即采集样品，随后由泌尿病理学家进行宏观检查。考虑到大多数前列腺癌发生在外周区(peripheral zone)，所有组织均取自尿道周区(periurethral zone)(Pradidarcheep等人，2011；Shaikhibrahim等人，2012)。根据病理学评价，仅收集没有呈现出肿瘤形成、癌症或炎症的组织学迹象的组织样品。BPH存在于80％-83％的前列腺癌患者中(Alcaraz等人，2009；Orsted和Bojesen，2013)。通常，这样的组织示出不同含量的前列腺特异性抗原(PSA)，以及不同含量的平滑肌和腺上皮细胞，反映出存在不同程度的BPH(Wang等人，2016a，2016c)。对于宏观检查和取样，通过从囊到尿道的单一纵向切口打开前列腺。随后，宏观地检查两个交叉(intersections)的任何明显的肿瘤浸润。因为肿瘤通常位于外周区，所以尿道周区(进行采样处)的肿瘤浸润非常罕见(在小于1％的前列腺中发现)。不对宏观检查中显示出尿道周区中的肿瘤的前列腺进行采样，并且不包括在本研究中。采样后立即进行器官浴槽研究，同时将用于分子分析的样品在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃。
张力测量
将前列腺条(6mm×3mm×3mm)安装在10ml充气(95％O2和5％CO2)组织浴槽(Danish Myotechnology,Aarhus,Denmark)中，该组织浴槽包含具有以下组成的Krebs-Henseleit溶液(37℃，pH 7.4)：118mM NaCl，4.7mM KCl，2.55mM CaCl2，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，25mM NaHCO3，7.5mM葡萄糖。在每个单一实验中，将从相同前列腺获得的四个条中的两个条分配给对照组(不含抑制剂或拮抗剂)，并且将另外两个条分配给抑制剂/拮抗剂组(导致在每个单一实验中对每个组进行一式两份确定)。一个实验的所有四个样品在相同器官浴槽的四个室中进行检查。因此，每个系列/图中的对照和抑制剂曲线从相同前列腺获得，但针对不同的系列/图检查不同的前列腺。由于不同的抑制剂浓度(100nM，1μM)和onvansertib与α1-阻断剂的组合，系列之间的溶剂的量不同，这排除了不同系列中收缩水平之间的任何比较。因此，并且考虑到来自根治性前列腺切除术的前列腺组织可能表现出相当大的异质性，统计学比较仅在相同系列内的组之间进行(即包含来自相同前列腺的组织用于抑制剂组和对照组)，而不在从不同前列腺获得的系列之间进行(即，不跨越不同系列的器官浴槽实验)。每个样品仅记录一条曲线，即对一种激动剂或电场刺激(EFS)进行记录。
安装在器官浴槽室之后，使制备物牵张至4.9mN，并且保持平衡45min。在平衡期的初始阶段，通常观察到张力的自发下降。因此，在平衡期期间张力被调整三次，直到达到4.9mN的稳定静息张力。在平衡期之后，评估由80mM KCl诱导的最大收缩。随后，用Krebs-Henseleit溶液洗涤室三次，总计30min。在添加onvansertib、坦索罗辛、西洛多辛和/或二甲基亚砜(DMSO)作为对照之后30min，产生对于去甲肾上腺素、苯肾上腺素、甲氧明、内皮素-1和对于U46619的累积浓度反应曲线，或EFS诱导的频率反应曲线。在单独的系列中评估onvansertib作用的可逆性，其中在应用DMSO或onvansertib之后30min开始，通过在30min内替换Krebs-Henselit溶液三次洗去DMSO和onvansertib，随后构建去甲肾上腺素的浓度反应曲线或通过EFS产生的频率反应曲线。
EFS的应用模拟了动作电位，导致释放内源性神经递质，包括去甲肾上腺素。先前已经使用神经递质释放的抑制剂河豚毒素展示出，这占人类前列腺中EFS诱导的收缩的三分之二(Angulo等人，2012)。对于EFS，组织条被放置在连接至CS4刺激器(Danish Myotechnology)的两个平行铂电极之间。持续时间为1ms的矩形脉冲用50V的电压施加，持续10s的队列持续时间(train duration)，并且在单个脉冲之间使用1ms的延迟。在2Hz、4Hz、8Hz、16Hz和32Hz的频率研究EFS诱导的收缩反应，刺激之间有30s的队列间隔。
数据分析和计算基于收缩的最大峰高度。对于激动剂或EFS诱导的收缩的计算，张力被表示为KCl诱导的收缩的％，因为这可以校正不同的基质/上皮比率、不同的平滑肌含量、不同的BPH程度或者前列腺样品和患者之间的任何其他异质性。
蛋白印迹分析
冷冻的前列腺组织使用含有基质A的系统(MP Biomedicals，Illkirch，France)在含25mM Tris/HCl、10μM苯基甲磺酰氟、1mM苄脒和10μg/ml半硫酸亮抑蛋白酶肽的缓冲液中进行均浆。在离心(20,000g，4min)之后，使用Dc测定试剂盒(Biorad,Munich,Germany)测定上清液的蛋白质浓度，并且与十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液(Roth,Karlsruhe,Germany)一起煮沸10min。如下文描述地制备经培养的基质细胞的样品。样品(20μg/泳道)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并且将蛋白质印迹在硝酸纤维素膜(Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)上。膜用含5％奶粉(Roth，Karlsruhe，Germany)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭过夜，并且与兔抗PLK1(208G4)(#4513)(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)和小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体(sc-47778)(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)一起孵育。
一级抗体在含0.1％吐温20(PBS-T)和5％奶粉的PBS中稀释。随后，使用生物素化的二级山羊抗兔或马抗小鼠IgG(BA-1000，BA-2000)(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)，随后与来自“Vectastain ABC试剂盒”(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)的抗生物素蛋白和生物素化辣根过氧化物酶(HRP)(两者均在PBS中以1:200稀释)一起孵育来继续进行检测。在与一级或二级抗体或生物素-HRP一起孵育之后，膜用PBS-T进行洗涤。最后，用增强化学发光(ECL)使用ECL Hyperfilm(GE Healthcare，Freiburg，Germany)对印迹进行显影。使用“Image J”(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA)对所得的PLK1的条带的强度进行密度定量。
RT-PCR
来自冷冻的前列腺组织或细胞的RNA使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)进行分离。为了从组织中分离，使用含有基质A的系统(MP Biomedicals，Illkirch，France)对30mg的组织进行匀浆。RNA浓度用分光光度法进行测量。逆转录为cDNA使用逆转录系统(Promega，Madison，WI，USA)用1μg的经分离的RNA来进行。用Roche Light循环仪(Roche，Basel，Switzerland)，使用由Qiagen(Hilden，Germany)提供为可即用混合物的引物，基于用于PLK1的Ref-Seq登录号NM_005030、用于KLK3(同义的PSA)的NM_001030047和用于GAPDH的NM_002046来进行对PLK1、PSA和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的RT-PCR。PCR反应在25μl的体积中进行，该体积包含5μlFastStart DNA MasterPlus SYBR Green I(Roche，Basel，Switzerland)、1μl模板、1μl引物和18μl水。变性在95℃进行10min，并且用以下的45个循环进行扩增：在95℃15秒，随后在60℃60秒。引物和扩增的特异性通过随后的熔解点(melting point)分析来证明，熔解点分析揭示了每个靶的单峰。结果使用ΔΔCP方法表示，其中荧光信号超过已定义的GAPDH的阈值的循环数(Ct)从PLK的Ct值中减去(Ct靶-CtGAPDH＝ΔCP)，并且值被计算为2-ΔCP并且彼此进行归一化或归一化至前列腺组织的平均值。
细胞培养
WPMY-1细胞是从不具有前列腺癌的人类前列腺基质中获得的永生化细胞系(Webber等人，1999)。细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA，USA)获得，并且在37℃和5％CO2保持在补充有10％胎牛血清(FCS)和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640(Gibco，Carlsbad，CA，USA)中。在添加onvansertib或DMSO之前，将培养基更换为不含FCS的培养基。对于蛋白质印迹分析，使用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)裂解细胞，并且在冰上孵育15min之后从烧瓶中取出。通过离心(10,000g，10min，4℃)除去细胞碎片，并且上清液的不同等分试样进行蛋白质确定，或者与SDS样品缓冲液一起煮沸。
细胞毒性测定
使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)评估细胞的活力。使细胞在96孔板(5000个细胞/孔)中生长24h，然后添加指定浓度的onvansertib或溶剂。随后，使细胞生长不同的时间段(24h、48h、72h)。对每个时间段都进行单独的对照。在该时间段结束时，添加10μl的来自CCK-8的[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑鎓单钠盐(WST-8)，并且在37℃孵育2h之后在450nm处测量每个孔中的吸光度。
集落形成测定
将约100个细胞置于6孔培养板的每个孔中，并且用onvansertib(最终浓度10nM、50nM、100nM)或溶剂处理。将细胞在37℃孵育14天，然后用PBS洗涤两次，并且通过2ml的10％三氯乙酸固定过夜(4℃)。随后，将所有板用冷水洗涤五次，并且在室温用0.4％磺基罗丹明B溶液(在1％乙酸中稀释)染色30min。在拍照之前，所有的板都贴上标签，并且用1％乙酸洗涤五次。在显微镜下对含有50个或更多个细胞的集落的数目进行计数。
EdU增殖测定
将WPMY-1细胞以细胞系特异性密度(50,000个/孔)铺板在16孔分室盖玻片(chambered coverslips)(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)上。在24h之后，用onvansertib(最终浓度10nM、50nM、100nM)或溶剂处理细胞。在另外的24h之后，培养基被更换为在包含onvansertib或溶剂的不含FCS的培养基中的10mM 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)溶液。20h后，用3.7％甲醛固定细胞。EdU掺入使用“EdU-Click 555”细胞增殖测定(Baseclick，Tutzing，Germany)根据制造商的说明进行确定。在该测定中，EdU掺入到DNA通过用发荧光的5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)检测来评估。用DAPI进行所有核的对比染色。通过荧光显微镜术(激发：546nm；发射：479nm)分析细胞。
药物和命名
onvansertib(PCM-075)(1-(2-羟乙基)-8-[5-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(三氟甲氧基)苯胺基]-4,5-二氢吡唑并[4,3-h]喹唑啉-3-甲酰胺)是对PLK1具有高选择性的PLK抑制剂(Beria等人，2011)。苯肾上腺素((R)-3-[-1-羟基-2-(甲基氨基)乙基]苯酚)和甲氧明(α-(1-氨基乙基)-2,5-二甲氧基苄醇)是α1-肾上腺素受体的选择性激动剂。U46619((Z)-7-[(1S,4R,5R,6S)-5-[(E,3S)-3-羟基辛-1-烯基]-3-氧杂双环[2.2.1]庚-6-基]庚-5-烯酸)是血栓素A2(TXA2)的类似物，其特异性地激活血栓素A2受体，并且经常用作血栓素A2受体的激动剂(Malmsten，1976；Shen和Tai，1998)。坦索罗辛(5-[(2R)-2-[2-(2-乙氧基苯氧基)乙基氨基]丙基]-2-甲氧基苯磺酰胺)和西洛多辛(1-(3-羟丙基)-5-[(2R)-2-[2-[2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯氧基]乙基氨基]丙基]-2,3-二氢吲哚-7-甲酰胺)是α1-肾上腺素受体拮抗剂，对α1A亚型具有高选择性。两者均可获得，并且常规地用于治疗提示BPH的LUTS(Oelke等人，2013)。在DMSO中制备onvansertib(10mM)的储备溶液和适当的稀释物，并且在-20℃储存直至使用。在每个实验之前，新鲜制备去甲肾上腺素、苯肾上腺素、甲氧明(均为10mM)和腺苷5’-三磷酸(ATP)(500mM悬浮液)的含水储备溶液。在乙醇中制备U46619(10mM)的储备溶液，并且在-80℃储存直至使用。内皮素-1(0.4mM)的含水储备溶液在-20℃储存直至使用。在DMSO中制备坦索罗辛和西洛多辛(10mM)的储备溶液，并且用蒸馏水进一步稀释(1:100稀释，至100μM)，并且在-20℃储存直至使用。onvansertib由Trovagene Inc.(San Diego，CA，USA)提供。去甲肾上腺素、苯肾上腺素、甲氧明和ATP从Sigma(Munich，Germany)获得，U46619、坦索罗辛和西洛多辛从Tocris(Bristol，UK)获得，并且内皮素-1从Enzo Life Sciences(Germany)获得。
统计学分析
数据呈现为指示的实验次数(n)的平均值±平均值的标准误差(S.E.M.)。多变量方差分析(ANOVA)和双向ANOVA被用于不成对的观察，并且使用版本20(IBM SPSS Statistics，IBM Corporation，Armonk，New York，USA)进行。P值<0.05被认为是统计学上显著的。纳入统计学分析中的所有组都基于五个或更多个独立实验，并且在用人类组织进行实验的情况下，包括来自每个组中五名或更多名患者的组织。因此，进行统计学检验的最小的组尺寸为n＝5。此外，通过统计学检验彼此进行比较的所有组示出相同的组尺寸；因此，不进行不同样本尺寸的组之间的任何统计学比较或者包含来自不同患者的组织的组之间的任何统计学比较。使用GraphPadPrism6(Statcon，Witzenhausen，Germany)进行Spearman相关性分析和通过曲线拟合进行的pEC50值的计算。
结果
onvansertib对肾上腺素能收缩的影响
在器官浴槽中诱导人类前列腺组织的收缩，以评估onvansertib和α1-阻断剂对前列腺平滑肌收缩的影响。使用两种不同浓度的onvansertib，测试了onvansertib对于去甲肾上腺素诱导的人类前列腺组织收缩的影响。两种浓度，即100nM和1μM，都引起去甲肾上腺素诱导的收缩的显著抑制(图1A)。两种浓度的抑制程度是类似的，因此将onvansertib浓度从100nM增加到1μM不增加抑制程度(100nM onvansertib产生了对100μM去甲肾上腺素诱导的收缩的45±9.7％抑制，1μM onvansertib产生了对100μM去甲肾上腺素诱导的收缩的41±6.2％抑制)。与收缩力相反，onvansertib不改变去甲肾上腺素的pEC50值(在100nM onvansertib后为5.9±0.2M，并且在对应的对照中为5.5±0.2M；在1μM onvansertib后为5.7±0.3M，并且在对应的对照中为6±0.3M)。
使用两种α1-肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素和甲氧明，确认了onvansertib对α1-肾上腺素能前列腺平滑肌收缩的影响。onvansertib(100nM)引起苯肾上腺素和甲氧明诱导的收缩的显著抑制(图1B)。两种激动剂的抑制程度是类似的，并且类似于onvansertib对于去甲肾上腺素诱导的收缩的抑制(100nM onvansertib产生了对30μM苯肾上腺素诱导的收缩的47±16.2％抑制，100nM onvansertib产生了对100μM甲氧明诱导的收缩的43±19.4％抑制)。与收缩力相反，onvansertib不改变苯肾上腺素或甲氧明的pEC50值(在100nM onvansertib后，苯肾上腺素为7.8±1.3M，并且在对应的对照中为6.7±0.8M；在100nM onvansertib后，甲氧明为5.2±0.2M，并且在对应的对照中为5±0.1M)。
为了评估onvansertib对于肾上腺素能收缩的影响的可逆性，在一系列单独的实验中，在洗去DMSO和onvansertib(100nM)后评估去甲肾上腺素诱导的收缩。在这些条件下，去甲肾上腺素诱导的收缩没有差异，即在洗去DMSO和onvansertib之后是类似的(图1C)。
onvansertib对非肾上腺素能收缩的影响
测试了onvansertib对内皮素-1、ATP或血栓素A2类似物U46619诱导的前列腺平滑肌收缩的影响。onvansertib(100nM)引起内皮素-1诱导的收缩的显著抑制(100nM onvansertib产生了对3μM内皮素-1诱导的收缩的45±6.6％抑制)，以及ATP诱导的收缩的显著抑制(100nM onvansertib产生了对10mM ATP诱导的收缩的51±18.6％抑制)(图2)。onvansertib(100nM)不改变U46619诱导的收缩(图2)。
onvansertib对EFS诱导的收缩的影响
使用两种不同浓度的onvansertib测试了onvansertib对通过EFS诱导的人类前列腺组织的神经源性收缩的影响。两种浓度，即100nM和1μM，都引起EFS诱导的收缩的显著抑制(图3A)。两种浓度的抑制程度是类似的，因此将onvansertib浓度从100nM增加到1μM不增加抑制程度(100nM onvansertib产生了对32Hz诱导的收缩的34±11.3％抑制，1μM onvansertib产生了对32Hz诱导的收缩的34±14％抑制)。
为了评估onvansertib对于EFS诱导的收缩的影响的可逆性，在一系列单独的实验中，在洗去DMSO和onvansertib(100nM)后评估EFS诱导的收缩。在这些条件下，EFS诱导的收缩没有差异，即在洗去DMSO和onvansertib之后是类似的(图3B)。
α1-阻断剂对EFS和去甲肾上腺素诱导的收缩的影响
α1-阻断剂坦索罗辛和西洛多辛显著地抑制EFS诱导的人类前列腺组织的收缩，并且抑制到类似的程度(图4A)。两种化合物的抑制程度是类似的(300nM坦索罗辛产生了对32Hz诱导的收缩的48±18.3％抑制，100nM西洛多辛产生了对32Hz诱导的收缩的47±16.4％抑制)。与EFS诱导的收缩的不完全抑制相反，相同浓度的坦索罗辛和西洛多辛几乎完全抑制去甲肾上腺素诱导的收缩(300nM坦索罗辛产生了对100μM去甲肾上腺素诱导的收缩的93±3.5％抑制，100nM西洛多辛产生了对100μM去甲肾上腺素诱导的收缩的84±4.99％抑制)(图4B)。
onvansertib与α1-阻断剂的组合对EFS诱导的收缩的影响
在添加单独的α1-阻断剂或α1-阻断剂和100nM onvansertib的组合之后，比较了人类前列腺组织之间的EFS诱导的收缩(图5a)。与添加单独的α1-阻断剂之后EFS诱导的收缩相比，添加α1-阻断剂与onvansertib的组合之后EFS诱导的收缩显著较低(图5a)。使用坦索罗辛和西洛多辛时，添加onvanestib的影响是类似的(与单独的坦索罗辛相比，onvanestib产生了对32Hz诱导的收缩的59±11.5％抑制，与单独的西洛多辛相比，onvanestib产生了对32Hz诱导的收缩的61±9.8％抑制)。
在两个单独系列的实验中，将onvansertib和α1-阻断剂的组合对EFS诱导的收缩的影响与单独的onvansertib(100nM)的影响进行了比较(图5b)。与添加单独的onvansertib之后EFS诱导的收缩相比，添加onvansertib与α1-阻断剂的组合之后EFS诱导的收缩显著较低(图5b)。使用坦索罗辛和西洛多辛时，添加α1-阻断剂的影响是类似的(与单独的onvansertib相比，坦索罗辛产生了对32Hz诱导的收缩的68±12.2％抑制，与单独的onvansertib相比，西洛多辛产生了对32Hz诱导的收缩的68±12.7％抑制)。
WPMY-1细胞中PLK1的检测
为了比较人类前列腺基质细胞系WPMY-1和人类前列腺组织中可能的PLK1表达水平，使用针对PLK1产生的抗体进行蛋白质印迹分析。检测揭示了具有PLK1的预期分子量的尺寸的条带(图6)。与先前的发现(Hennenberg等人，2018)一致，这些条带的强度在来自不同患者的前列腺组织的样品之间差异很大(图6A)。相比之下，WPMY-1细胞的四个不同样品的强度是恒定的，并且在人类前列腺组织中观察到范围处于最高表达水平(图6B)。通过RT-PCR检测PLK1 mRNA之后，观察到类似的模式(图6C)。因此，PLK1 mRNA的含量在人类前列腺组织中表现出高的变化(图6C)。在WPMY-1细胞中，PLK1 mRNA的含量是恒定的，并且范围处于与前列腺组织中观察到的最高含量类似的水平(图6C)。在人类前列腺组织中，未观察到PLK1和PSA的mRNA水平之间的相关性(R＝-0.543，P＝0.297)(图6D)。
onvansertib对WPMY-1细胞的活力和增殖的影响
通过CCK-8测定评估onvansertib对WPMY-1细胞的活力的影响。onvansertib诱导了活力的浓度(10nM、50nM、100nM)和时间(24h-72h)依赖性降低(图7A)。降低范围在以下之间：在24h之后，10nM的15±8.8％至100nM的63±2.2％，在48h之后，10nM的28±8.3％至100nM的86±1.9％，以及在72h之后，10nM的40±4.4％至100nM的89±1.4％(图7A)。
通过两种不同的读出(readouts)评估onvansertib对WPMY-1细胞的增殖的影响，其中结果进行了彼此确认(图7B和图7C)。在板集落测定中，onvansertib以浓度依赖性地降低了集落形成，总计具有以下降低：10nM降低39±4.5％，50nM降低89±1.9％，并且100nM降低97±0.4％(图7B)。在EdU测定中，onvansertib以浓度依赖性地降低了增殖细胞的百分比，在24h之后总计具有以下降低：10nM降低18±0.1％，50nM降低24±2.1％，并且100nM降低35±2.0％(图7C)。
讨论
我们的发现表明，PLK1抑制剂onvansertib抑制1)人类前列腺中神经源性、α1-肾上腺素能和内皮素诱导的收缩，以及2)前列腺基质细胞的增殖。值得注意的是，与单独的α1-阻断剂相比，onvansertib与α1-阻断剂的组合引起神经源性收缩的更大的抑制。从临床角度来看，onvansertib和α1-阻断剂的加性作用与对生长的同时作用一起可能特别有意义。前列腺平滑肌收缩和前列腺生长都可能有助于BPH中的BOO和LUTS(Hennenberg等人，2014)。因此，两者都是医学疗法的靶，然而其仍然受到有效性不足、联合疗法的普遍使用和低依从性的困扰，最终导致并发症、住院和手术(Hennenberg等人，2014；Oelke等人，2013)。新的靶的鉴定是未来克服这些限制的先决条件。基于我们的发现，onvansertib可能是待在提示BPH的LUTS的环境下进行体内测试的有吸引力的化合物。
我们使用两种不同的浓度测试了onvansertib对EFS和去甲肾上腺素诱导的收缩的影响。两种浓度100nM和1μM的onvansertib将收缩抑制到类似的程度。因此，与报告的IC50值一起，我们得出结论，对收缩的抑制在很大程度上取决于PLK1抑制，并且在这种高达1μM的范围内没有其他收缩介导激酶参与。实际上，据报告onvansertib对PLK1具有高度特异性，在生物化学测定中显示出PLK1的IC50值为2nM，PLK2的IC50值为10μM，并且PLK3的IC50值为10μM(Beria等人，2011)。在另一项通过生物化学测定的筛选中，针对296种激酶测试了onvansertib，并且示出当在1μM测试时，11种激酶(包括PLK1)的活性下降(<50％)，并且当在100nM测试时，仅抑制PLK1(Valsasina等人，2012)。用63种激酶进行的相同研究中另一系列的生物化学测定揭示了，FLT3的IC50值为510nM，MELK的IC50值为744nM，并且CK2的IC50值为826nM(Valsasina等人，2012)。因此，我们大部分的实验中使用的100nM的浓度可能对PLK1具有高度特异性，并且大部分的影响可能归因于PLK1抑制。因为相比由100nM导致的抑制，1μM的浓度没有提供更大的抑制，我们假定1)1μM不引起收缩介导激酶的脱靶抑制，以及2)100nM足以达到最大的、PLK1依赖性作用。与先前报道onvansertib通过氢键与PLK1的ATP口袋结合并因此充当具有可逆解离的ATP竞争性抑制剂的研究(Beria等人，2011；Valsasina等人，2012)一致，在我们的研究中，onvansertib的作用是可逆的。因此，在洗去onvansertib后，收缩恢复到对应的对照的水平。
尽管所纳入的患者的病史未被考虑，但在我们的器官浴槽实验中观察到平滑肌收缩的抑制。因此，组织样品是匿名化的，并且没有为本研究收集、存储或分析患者数据。为了消除个体差异或先前治疗导致的异质性，我们使收缩以高摩尔KCl诱导的收缩为参考，并且通过不同的设置，即，使用不同的α1-肾上腺素受体激动剂或不同的组合设置来确认我们的发现。然而，缺乏对患者特征的参考，特别是对可能影响收缩性的先前药物的参考，需要被认为是潜在的限制。神经源性和α1-肾上腺素能前列腺平滑肌收缩的抑制与最近用其他四种对PLK1具有假定选择性的抑制剂获得的发现一致(Hennenberg等人，2018年)。与我们目前的结果类似，其他PLK1抑制剂对EFS诱导的收缩的抑制的范围为约50％(Hennenberg等人，2018)。在这里，我们测试了两种α1-阻断剂对EFS诱导的收缩的影响，并且将onvansertib与α1-阻断剂的组合与单独的α1-阻断剂和onvansertib进行了比较。两种α1-阻断剂坦索罗辛和西洛多辛提供了非常类似的结果，并且对EFS诱导的收缩的抑制小于50％。α1-阻断剂的这种不完全抑制与先前的结果一致，先前的结果报告α1-阻断剂在EFS诱导的人类前列腺组织收缩中的类似或甚至更小的影响(Angulo等人，2012；Buono等人，2014；Chueh等人，1996；Oger等人，2009，2010)。我们排除了坦索罗辛和西洛多辛对EFS诱导的收缩的不完全抑制是由于α1-阻断剂的过低浓度导致的。实际上，在EFS实验中使用的相同浓度完全降低了去甲肾上腺素诱导的前列腺收缩(至少在这里应用的去甲肾上腺素浓度的范围内是如此)。我们观察到，与单独的α1-阻断剂或onvansertib之后的张力相比，应用onvansertib和α1-阻断剂的组合之后EFS诱导的收缩显著较低，这可以被认为是我们研究的关键发现。可以推测，在患有BPH的患者中，与单独的α1-阻断剂相比，在α1-阻断剂的基础上添加onvansertib或其他PLK1抑制剂可能导致更高的LUTS的改善。与先前在蛋白质水平获得的结果一致，我们在此确认了PLK1 mRNA表达与PSA表达不相关，表明其独立于BPH的程度发挥作用(Hennenberg等人，2018)。
最近的发现中PLK1抑制剂SBE 13和cyclapolin没有改变内皮素-1诱导的人类前列腺组织收缩，与最近的发现相反，我们在此观察到onvansertib对内皮素-1诱导的收缩的抑制(Hennenberg等人，2018)。这种差异的原因在现阶段仍然是推测，但可能反映了不同的药理学概况。然而，值得注意的是，甚至是对肾上腺素能收缩的抑制(由去甲肾上腺素、苯肾上腺素和甲氧明诱导)，由onvansertib的抑制也显示出比所报道的SBE 13和cyclapolin9的抑制更大(Hennenberg等人，2018)。除了内皮素-1诱导的收缩之外，onvansertib还抑制由ATP诱导的收缩。值得注意的是，我们的数据可能是表明人类前列腺中嘌呤能平滑肌收缩的第一个证据，因为尽我们所知，先前解决前列腺中的ATP诱导的收缩的研究限于动物模型(Brandli等人，2010；Buljubasich和Ventura，2004；Hennenberg等人，2017；White等人，2015；Xu和Ventura，2010)。与其他PLK抑制剂一致，U46619诱导的收缩在这里再次对onvansertib具有耐受性。非肾上腺素能介质，包括内皮素-1、血栓素A2以及可能的ATP，可能在BPH中与α1-肾上腺素受体平行地有助于前列腺平滑肌张力，因此尽管使用α1-阻断剂进行治疗，它们仍然可以维持尿道梗阻，这可能解释了α1-阻断剂的限制或大量无反应者(Hennenberg等人，2014，2017)。考虑到对内皮素-1和ATP诱导的收缩的影响，onvansertib在体内对提示BPH的LUTS的改善可能超过α1-阻断剂。
作为另一个关键发现，我们观察到onvansertib抑制前列腺基质细胞的增殖。先前报道onvansertib对增殖的抑制的研究在不同类型的肿瘤细胞中进行(Casolaro等人，2013；Hartsink-Segers等人，2013；Sero等人，2014；Valsasina等人，2012)。在前列腺中，其他PLK抑制剂或PLK1的敲低抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤生长，并且增强抗肿瘤治疗的有效性(Lin等人，2019；Reagan-Shaw和Ahmad，2005；Shao等人，2015；Zhang等人，2014)。通常，包括onvansertib在内的PLK抑制剂通过G2-M细胞周期阻断来减少增殖(Valsasina等人，2012)。通过PLK抑制进行的延长的有丝分裂阻断可能随后是细胞凋亡和细胞死亡(Valsasina等人，2012)。这两个过程可能解释了在我们的研究中onvansertib对WPMY-1细胞的增殖和活力的影响。早在24h就出现了WPMY-1细胞的降低的活力，但这明显是时间依赖性的。关于平滑肌细胞，针对气道平滑肌细胞已经提出PLK1促进增殖的作用，其中PLK1敲低抑制了生长因子诱导的增殖(Jiang和Tang，2015)。总之，我们的WPMY-1细胞的增殖和活力受到PLK1抑制剂影响的观察结果与先前在其他细胞类型中进行的研究一致。WPMY-1细胞来源于非恶性人类前列腺基质，并且与前列腺平滑肌细胞非常类似，并且可以被认为就是这样的前列腺平滑肌细胞(Wang等人，2015)。平滑肌细胞是前列腺基质中的主要细胞类型，在BPH中可能显示增加的增殖(Strand等人，2017)。后者有助于BPH中的前列腺肥大(Strand等人，2017)。通过蛋白质印迹和RT-PCR比较表达水平表明，WPMY-1细胞以恒定水平表达PLK1，这类似于人类前列腺组织中的最高水平，在人类前列腺组织中PLK1的含量不同。可以预期，onvansertib可以预防BPH中的前列腺生长或减小前列腺尺寸(这是用5-ARI进行治疗的主要目标)，以便防止BPH的进展并且降低并发症和手术的风险(Oelke等人，2013)。
前列腺生长和平滑肌收缩是BPH中的药物疗法的靶，但长期以来大多被彼此单独地考虑。基于最近的显示出前列腺平滑肌收缩和基质细胞生长易受相同抑制剂影响的证据，现在越来越清楚的是，这两个过程彼此密切相关(Hennenberg等人，2014)。Rho激酶、Rac GTP酶或Src家族激酶的抑制剂同时抑制激动剂诱导的人类前列腺组织收缩和前列腺基质细胞生长(Rees等人，2003；Wang等人，2015，2016b)。这可能类似于其他平滑肌细胞中的情况，例如血管平滑肌细胞中的情况，其中RhoA/Rho激酶介导收缩和增殖(Shimokawa等人，2016)。值得注意的是，提出了PLK1在气道平滑肌细胞中的类似作用，其中增殖和收缩二者都取决于PLK1(Jiang和Tang，2015；Li等人，2016)。这明显也适用于前列腺平滑肌。因此，与α1-阻断剂或5-ARI相反，onvansertib可能立即降低前列腺平滑肌张力和生长。onvansertib寻址于(addresses)相同还是不同的细胞内信号传导途径以抑制平滑肌收缩和增殖，以及哪些其他效应物与PLK1一起参与onvansertib敏感的信号传导，不能基于我们的数据进行估计。尽我们所知，迄今为止尚未报道PLK抑制剂对血管平滑肌收缩的影响(其可能引起心血管副作用，并且可能限制体内的应用)。
总之，可以推测，出于三个原因，如果onvansertib应用于治疗提示BPH的LUTS，它在体内可能非常有效。首先，可以假定通过在α1-阻断剂的基础上添加onvansertib对LUTS的改善可能高于通过单独的α1-阻断剂，这基于我们从EFS诱导的收缩的组合实验中的发现。第二，可以预期高程度的症状减轻和Q最大的改善，因为onvansertib抑制内皮素-1诱导的收缩，这种收缩对α1-阻断剂不敏感，但有助于BPH中的前列腺平滑肌张力(Hennenberg等人，2014，2017)。第三，可能预期前列腺尺寸的减小与症状减轻并行，因为onvansertib强烈地降低了基质细胞的活力。在体内长期应用后，由于体内平滑肌细胞的数量可能减少，抗增殖作用甚至可能比在器官浴槽中的短时间暴露更强地降低收缩性。在器官浴槽中，暴露1h通常不足以通过影响活力来降低收缩性(Yu等人，2018，2019a，2019b)，因此抗收缩作用最有可能因促进收缩的PLK1介导的信号传导机制而发生。α1-阻断剂和5-ARI的联合疗法通常应用于治疗男性LUTS(Oelke等人，2013)。然而，副作用是加性的，并且停药率高(Fullhase等人，2013)。可以同时解决肾上腺素能和非肾上腺素能前列腺平滑肌张力连同生长的单一化合物，诸如onvansertib，可能对临床试验有吸引力，因为它们可以替代α1-阻断剂与5-ARI的联合疗法，并且可能超过用α1-阻断剂进行的单一疗法的有效性。onvansertib是可用于口服的(orally available)(Beria等人，2011；Valsasina等人，2012)。最近在I期研究中对药代动力学和安全性进行了检查，其中人类中的血浆浓度达到了三位数纳摩尔范围，甚至是通过所测试的最低剂量也是如此(Weiss等人，2018)。因此，看起来可能的是，通过口服施用在前列腺中可以获得类似于我们的器官浴槽实验中的浓度(100nM)的浓度，使得在提示BPH的LUTS的背景下的临床研究可能是有前景的。
结论
onvansertib抑制人类前列腺平滑肌的神经源性和α1-肾上腺素能收缩以及前列腺基质细胞的增殖。α1-阻断剂使神经源性收缩减少不超过50％，但α1-阻断剂与onvansertib的组合提供了对神经源性前列腺收缩的加性和更强的抑制。看起来可能的是，onvansertib可以同时降低BPH中的前列腺平滑肌张力和生长，使得onvansertib可以是待在提示BPH的LUTS的背景下进行体内测试的有吸引力的化合物。
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鉴于上文，将可以看出，本发明的若干个目的已经实现，并且获得了其他优点。
由于在不偏离本发明的范围的情况下，可以对上文的方法和组合物进行各种改变，意图是包含在上文描述中并且在附图中示出的所有内容应被解释为说明性的，而不是限制意义。
本说明书中引用的所有参考文献由此通过引用并入。本文对参考文献的讨论仅意图总结作者的主张，并不承认任何参考文献构成现有技术。申请人保留质疑所引用的参考文献的准确性和相关性的权利。
如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。此外，“或”的使用意图包括“和/或”，除非上下文另外清楚地指示。
如本文使用的，在特定的实施方案中，当在数值之前时，术语“约(about)”或“约(approximately)”指示该值正或负10％的范围。在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外清楚地规定，该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限的单位的十分之一，和在该陈述的范围中的任何其他陈述的或中间的值被包括在本公开内容内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小的范围内，还被包括于本公开内容内，服从陈述的范围的任何特别排除的限值。在陈述的范围包括上限和下限之一或两者的情况下，排除这些包括的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本公开内容中。
说明书和实施方案中使用的措辞“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“一个或两个”，即，在一些情况下结合存在而在其他情况下分离存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应该以相同的方式解释，即，这样结合的要素中的“一个或更多个”。除了由“和/或”子句具体识别的要素之外，可以任选地存在其他要素，无论与那些具体识别的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与诸如“包括(comprising)”的开放性语言结合使用时，对“A和/或B”的提及可以在一种实施方案中仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一种实施方案中仅指B(任选地包括除A之外的要素)；在又一种实施方案中指A和B两者(任选地包括其他要素)；等等。
如在说明书和实施方案中所使用的，“或”应被理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包括性的，即，包括多个要素或要素的列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地包括另外的未列出的项目。明确指示相反的仅有术语，诸如“...中的仅一个”或“...中的恰好一个”，或者当在实施方案中使用时，“由...组成”将指的是包括多个要素或要素的列表中的恰好一个要素。一般来说，当前面有排他性的术语诸如“任一”、“...中的一个”、“...中的仅一个”或“...中的恰好一个”时，如本文使用的术语“或”仅应被解释为指示排他性的替代物(即“一个或另一个，但不是两者”)。当在实施方案中使用时，“基本上由...组成”应具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如在说明书和实施方案中所使用的，提到一个或更多个要素的列表，措辞“至少一个”应被理解为意指从要素的列表中的任何一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但不一定包括要素的列表中具体列出的每个要素中的至少一个，并且不排除要素的列表中要素的任何组合。该定义还允许可以任选地存在除了在措辞“至少一个”所指的要素的列表中具体识别的要素之外的要素，无论与那些具体识别的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或者等效地，“A或B中的至少一个”，或者等效地，“A和/或B中的至少一个”)可以在一种实施方案中指至少一个，任选地包括多于一个的A，不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一种实施方案中指至少一个，任选地包括多于一个的B，不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一种实施方案中指至少一个，任选地包括多于一个的A，和至少一个，任选地包括多于一个的B(并且任选地包括其他要素)；等等。
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