干姜在制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂中的应用

1.本发明属于药物技术领域，具体涉及干姜在制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂中的应用。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacter pylori)是世界范围内最常见的传染性病原菌之一，全球有超过50％的人群感染。幽门螺杆菌感染不但是消化性溃疡、慢性胃炎的主要病因，而且与胃黏膜相关性淋巴瘤及胃腺癌的发生密切相关。幽门螺杆菌虽然是对生长条件要求十分苛刻的细菌，但也是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。胃内是一个强酸环境，幽门螺杆菌能在胃内存活的最主要原因是它的脲酶活性，脲酶水解尿素释放出来的氨能提高ph值，并且最新研究显示，受体结构中尿素分子是幽门螺杆菌感知和避免胃酸环境的关键因素。因此脲酶的作用为幽门螺杆菌营造了一个适宜的微环境。具有脲酶活性的病原菌要么靠脲酶水解尿素产生氨为自身的生命活动提供氮源，要么利用氨的碱性为其生存提供一个适宜的微环境。但是氨的释放会造成细胞毒性、引发炎症或溃疡，也会因造成血氨过高引发肝性脑病等，此外脲酶本身会通过免疫反应，刺激人中性粒细胞的氧化爆发，产生氯氨，参与细胞损伤和诱发癌变，因此脲酶是上述致病菌重要的毒力因子。故阻断了脲酶活性，就能有效的抑制甚至杀灭这类病菌，达到治疗上述疾病的目的。同时，毒力因子并非像dna、蛋白质等一样，是细菌生存必不可少的，因此与传统抗生素相比，抑制细菌的毒力因子较为不容易发展耐药性，这些优越性显示脲酶抑制剂将有可能成为治疗上述疾病的一线药物。
3.目前，针对脲酶对人类生产和生活中带来的严重危害，国内外学者研究并使用脲酶抑制剂进行预防与治疗。迄今，脲酶抑制剂被广泛应用于医药，农业，畜牧业等领域，其种类主要包括尿素类似物、异羟肟酸类、重金属离子类、磷酰胺酯类、醌类、多酚类等。然而，现有的脲酶抑制剂因为大多具有稳定性差、作用时间短、毒副作用明显等问题，在实际应用中具有一定的限制。因此，从天然药物中筛选出安全、高效、无污染的脲酶抑制剂的研究备受关注。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种干姜在制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂中的应用。干姜抑制幽门螺杆菌脲酶的效果良好，且具有价廉易得，安全无毒等特点，具备良好的应用价值与开发前景，可作为幽门螺杆菌脲酶抑制剂，能够被被广泛用于治疗与幽门螺杆菌相关的胃部疾病，如消化性溃疡、胃炎、胃黏膜淋巴瘤等，并进一步降低耐药性的发生几率。
5.本发明第一方面提供了干姜在制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂中的应用。
6.干姜是一味传统的药食两用的中药材，为姜科植物zingiber officnale rosc的干燥根茎，主治脘腹冷痛，呕吐泄泻，肢冷脉微，寒饮喘咳等症状。现代药理研究表明，干姜
具有镇痛、抗炎、抗肿瘤等作用。本发明率先发现，干姜具有抑制幽门螺杆菌脲酶活性的作用，因而可应用于制备幽门螺杆菌脲酶抑制剂。
7.本发明第二方面提供了一种幽门螺杆菌脲酶抑制剂。
8.具体地，所述幽门螺杆菌脲酶抑制剂包括干姜提取物。
9.优选地，所述干姜提取物由水提取得到。
10.更为具体地，所述干姜提取物的制备方法如下：
11.将干姜粉碎，然后加水浸泡，再回流提取，过滤去滤渣，制得所述干姜提取物。
12.优选地，所述干姜与所述水的质量比为1：(5-20)。
13.优选地，所述浸泡的时间为0.2-1h。通过先浸泡在回流提取，有利于充分提取干姜中的活性成分。
14.优选地，所述回流提取的时间为1-3小时。
15.优选地，所述幽门螺杆菌脲酶抑制剂还包括所述干姜提取物在药学上可接受的盐或辅料。
16.优选的，所述药学上可接受的辅料包括填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。
17.优选的，所述幽门螺杆菌脲酶抑制剂的制剂形式为片剂、胶囊、颗粒剂或包衣药丸。
18.本发明第三方面还提供了所述幽门螺杆菌脲酶抑制剂在制备治疗胃部疾病的药物中的应用。
19.优选的，所述胃部疾病包括胃炎、胃溃疡或胃癌。
20.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
21.本发明提供了干姜作为幽门螺杆菌脲酶抑制剂在医药领域中的新用途，可用于制备治疗和预防胃炎、胃溃疡等胃部相关疾病的药物。同时，将干姜作为幽门螺杆菌脲酶抑制剂还丰富了现有脲酶抑制剂的可选种类，有助于减少药物的耐药性。此外，由于干姜本身为天然来源的中药材，并具有高效无毒的特点，因此在抑制幽门螺杆菌脲酶活性方面具有良好的开发前景。
附图说明
22.图1为实施例1制备的干姜提取物对脲酶的抑制活性；
23.图2为实施例1制备的干姜提取物抑制脲酶的lineweaver-burk双倒数图；
24.图3为实施例1制备的干姜提取物抑制脲酶lineweaver-burk双倒数图中曲线的截距与抑制剂浓度关系图；
25.图4为含疏基化合物对干姜抑制脲酶活性影响的条形图；
26.图5为含疏基化合物、干姜与脲酶三者的加入顺序对脲酶活性影响的条形图。
具体实施方式
27.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
28.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，
或者可以通过现有已知方法得到。
29.实施例1
30.制备干姜提取物：取干燥的干姜，打粉，称取50g，加入10倍量蒸馏水浸泡0.5小时后，加热回流提取2小时，趁热过滤，收集滤液，药渣按同样操作再提取一次，合并两次滤液，滤液置旋转蒸发仪减压浓缩得干姜提取物的浓缩液，置于4℃避光保存，备用。
31.利用该提取物作为幽门螺杆菌脲酶抑制剂。
32.产品效果测试
33.1.实验材料
34.(1)受试药物
35.尿素，二硫苏糖醇、半胱氨酸均购自索莱宝；谷胱甘肽购自美仑生物；氟化钠、硼酸均购自麦克林。hepes、水杨酸钠、硝普钠、氢氧化钠、次氯酸钠、丙三醇，均购自广州化学试剂厂，均为分析纯。
36.(2)幽门螺杆菌的培养
37.在37℃，含5％o2、10％co2和85％n2的微氧条件下，对幽门螺杆菌进行24h的培养，培养液为含有10％灭活马血清的布氏肉汤。复苏培养3天后，对经过鉴定且无污染的幽门螺杆菌进行传代培养：用接种环从母板刮取菌团，接种于新鲜的培养平板上，轻轻均匀涂布于整个平板，然后装罐培养3天。
38.(3)幽门螺杆菌脲酶的提取
39.取50ml幽门螺杆菌菌液在5000g，4℃的条件下离心分离并收集幽门螺杆菌，用ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤两次后，将幽门螺杆菌沉淀在-80℃保存24h，取出放置至室温，加入3ml蒸馏水和蛋白酶抑制剂，超声1min，以15000g、4℃离心10min，取出上层清夜透析除盐，得到幽门螺杆菌脲酶溶液，加入等体积的甘油后放于4℃储存。
40.(4)干姜提取物配制
41.取实施例1制备的干姜提取液的浓缩液，用20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)稀释制备成不同浓度的溶液。
42.(5)尿素的配制
43.称取尿素适量，溶解于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，配制成150mm的尿素溶液，放于4℃冰箱中保存，备用。
44.(6)berthelot显色液的配制
45.a液：分别称取适量的硝普钠和水杨酸钠粉末，溶解于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，配制成含9.73mm亚硝基铁氰化钠、700mm水杨酸钠的显色a液，置于4℃避光保存，备用。
46.b液：称取氢氧化钠9g，溶解于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，放冷，加入12ml次氯酸钠，混匀，定容至50ml，置4℃避光保存，备用。
47.2.测试试验
48.试验1：干姜抑制幽门螺杆菌脲酶活性试验
49.将一定浓度的幽门螺杆菌脲酶溶液和一系列浓度的干姜提取物溶液混匀，置37℃孵育20min，然后在室温下加入尿素溶液避光反应20min，再加入berthelot显色液避光显色10min，吸取200μl孵育液至96孔板上，通过酶标仪测定595nm下的od
绝对
值，求得相应的od
相对
值，以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。根据公式1求得相应的od
相对
值。根据公式2求得残余酶活性，并通过浓度-残余酶活性曲线求得相应半数抑制浓度ic
50
，以平均值
±
标准误差表示。
50.od
相对
＝od
绝对-od
空白
ꢀꢀ
(公式1)
51.残余酶活性(％)＝od
相对值供试品
/od
相对空白
×
100％
ꢀꢀ
(公式2)
52.实施例1制备的干姜提取物对幽门螺杆菌脲酶活性的抑制结果如图1所示，由图1可知，干姜提取物抑制幽门螺杆菌脲酶活性的半数抑制浓度(ic
50
)为7.17
±
0.59mg/ml。
53.试验2：干姜对幽门螺杆菌脲酶的抑制类型研究
54.取一定浓度的幽门螺杆菌脲酶和一系列浓度的实施例1制备的干姜提取液(0、6、12、24mg/ml)混匀，置37℃孵育20min。然后在室温下加入一系列浓度的尿素溶液(0.469-15mm)避光反应20min，再根据试验1的方法显色测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。实验通过反应速度的倒数(1/v，即1/od
相对
)对底物浓度的倒数(1/[urea])作lineweaver-burk图，最后通过l-b曲线结合公式3求得动力学参数km、v
max
，并通过l-b曲线进行二次作图求得抑制常数k
is
。
[0055]
结果如图2、3所示。由图2的lineweaver-burk双倒数图可知，随着干姜浓度的增加，干姜抑制幽门螺杆菌脲酶的动力学参数km和v
max
均降低，由此可初步推断干姜抑制幽门螺杆菌脲酶的作用类型为反竞争性抑制类型。此外，结合干姜抑制幽门螺杆菌脲酶类型，对lineweaver-burk双倒数图进行二次作图，得到图3干姜提取物抑制脲酶lineweaver-burk双倒数图中曲线的截距与抑制剂浓度关系图。由图3可求得干姜抑制幽门螺旋杆菌脲酶的抑制常数k
is
为1.60
±
0.32mg/ml。
[0056][0057]
试验3：含巯基化合物对干姜抑制幽门螺杆菌脲酶活性的影响
[0058]
把幽门螺杆菌脲酶溶液，含巯基化合物溶液(二硫苏糖醇，半胱氨酸或谷胱甘肽溶液，浓度均为1.25mm)以及24mg/ml干姜溶液混匀，置37℃预孵育20min后，于室温下加入尿素反应20min，再根据试验1的方法显色测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值，并求出相应的残余酶活性。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
[0059]
结果如图4所示，当反应体系中含有巯基化合物(二硫苏糖醇，半胱氨酸或谷胱甘肽)时，即使是在干姜存在的情况下，幽门螺杆菌脲酶仍能保持较高的酶活性，由此可推测干姜抑制幽门螺杆菌脲酶活性的其中一个作用位点为脲酶氨基酸系列中的巯基基团。
[0060]
试验4：干姜提取物、巯基、幽门螺杆菌脲酶的相互作用试验
[0061]
把幽门螺杆菌脲酶溶液，含巯基化合物溶液(二硫苏糖醇，半胱氨酸或谷胱甘肽溶液，浓度均为1.25mm)以及24mg/ml干姜溶液中的其中两种溶液混匀，置37℃预孵育20min后，接着加入第三种溶液混匀，并在37℃再孵育20min，然后在室温下向共孵育液加入尿素反应20min，再根据试验1的方法显色测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值，并求出相应的残余酶活性。以加入物质的溶剂hepes作空白对照，平行测定3次。
[0062]
结果由图5所示，幽门螺杆菌脲酶的活性与含巯基化合物、幽门螺杆菌脲酶、干姜提取物三者的加入顺序密切相关。先将巯基保护剂与脲酶反应再加入干姜提取物时((脲酶 巯基) 干姜组)，脲酶的残余酶活性最高；将巯基保护剂和干姜提取物反应后再加入脲酶
((干姜 巯基) 脲酶)，脲酶的残余酶活性次之；若在干姜提取物与脲酶反应一段时间后再加入巯基保护剂((脲酶 干姜) 巯基组)，脲酶残余酶活性最低。
[0063]
以上实验表明，干姜能显著抑制幽门螺杆菌脲酶的活性。此外，干姜抑制幽门螺杆菌脲酶作用机理的研究证明干姜是一种反竞争性脲酶抑制剂，其主要是通过作用于幽门螺杆菌脲酶活性部位中的巯基活性基团从而抑制脲酶的活性。通过上述机理研究可进一步证实干姜具抗幽门螺杆菌脲酶的作用，且作用效果明显。结合干姜价廉易得，安全无毒，干姜在制备抗幽门螺杆菌的药物方面具有良好的应用价值与开发前景，是潜在的脲酶抑制剂，具有治疗幽门螺杆菌相关性胃肠道疾病的作用。
[0064]
以上所述仅为本发明的优选实施例而己，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。