一种高纯度猪脂肪祖细胞的分离纯化方法

1.本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域，涉及一种高纯度脂肪祖细胞的分离纯化方法，具体地，涉及用于培养肉研究和生产的高纯度猪脂肪祖细胞分离纯化方法。


背景技术：

2.培养肉，也称为培育肉或清洁肉，是指利用畜禽干细胞和组织工程技术生产的肉。与传统肉类生产方式相比，培养肉有望解决动物福利、资源短缺和公共卫生问题。培养肉的最终目标是模拟传统肉类产品的感官和营养特性。脂肪是传统肉类的重要组成部分，对肉的风味、质地、营养和外观的起关键作用。因此，培养脂肪已成为培养肉研究的一个重要领域。
3.培养脂肪技术的首要难题就是在体外分离得到高纯度的脂肪祖细胞。传统分离细胞的方法在很多方面不适合未来产业化的培养脂肪，包括(1)培养脂肪所需的种子细胞数量大，传统使用剪刀手动剪碎脂肪组织工作量大、效率低下；(2)猪的皮下脂肪组织中结缔组织较多，传统的消化过程采用依赖于人力使用注射器或移液管反复吹打，将肉充分消化，此种原始消化方法同样不适用于培养肉所需的规模化种子细胞生产；(3)猪脂肪组织中含有大量的成熟脂肪细胞，传统依赖于细胞筛过滤去除成熟脂肪细胞的方法，因为成熟脂肪细胞的浮力和体积较大，易堵塞细胞筛，导致过滤操作困难；(4)由于皮下脂肪组织中还含有多种来源的细胞如血细胞、内皮细胞、成纤维细胞、成熟脂肪细胞、脂肪前体细胞或祖细胞等。因此，如何大量、高效的获得高纯度的apc是制约培养脂肪研究的难题之一。
4.猪脂肪祖细胞研究领域还没有获得高纯度猪脂肪祖细胞的方法。
5.基于以上传统分离和纯化猪脂肪祖细胞存在的诸多弊端，本发明开发一种用于培养脂肪研究和生产的高效获取高纯度猪脂肪祖细胞的分离纯化方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是解决猪的脂肪祖细胞分离纯化难题，提供一种，用于培养脂肪研究和生产的猪脂肪祖细胞的分离纯化方法。
7.本发明具体技术方案如下：
8.本发明的第一个目的是提供一种猪脂肪祖细胞的纯化方法，所述方法包括如下步骤：
9.(1)分离待纯化细胞样品：采集猪脂肪组织，漂洗，消化，得到含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液；
10.(2)初步纯化：取含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液，离心、细胞筛过滤、裂解、贴壁培养，贴壁细胞即为含有猪脂肪祖细胞的单核细胞群；
11.(3)流式分选纯化：将步骤(2)得到的猪脂肪祖细胞的单核细胞群进行流式分选，所述流式分选的抗体为cd140a、cd29、cd31、cd45，先选取出cd31和cd45阴性的细胞，再从前述细胞中选取出cd29和cd140a阳性的细胞，即为纯化后的猪脂肪祖细胞。
12.进一步的，步骤(1)中，所述猪脂肪组织为1～10日龄内仔猪皮下脂肪组织。
13.进一步的，步骤(1)中，所述漂洗为采用酒精和/或含青霉素-链霉素双抗的pbs漂洗；
14.进一步的，所述酒精为75％酒精溶液，所述含青霉素-链霉素双抗的pbs为含3％(体积百分比)的青霉素-链霉素双抗的pbs；
15.进一步的，酒精漂洗时间为10～30s，含青霉素-链霉素双抗的pbs漂洗时间为10～60s。
16.进一步的，步骤(1)中，所述消化为将漂洗后的猪脂肪组织切碎，置于消化液中，将猪脂肪组织切碎，按体积比为1:1～5:1的比例与猪皮下脂肪组织和消化液混合，所述消化液为含0.5～5％(质量体积比)ⅰ型胶原酶和3％(体积比)青霉素-链霉素双抗的1％(质量体积比)牛血清白蛋白溶液，消化结束后，加入含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基终止消化，得到含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液；
17.在某一个特殊的实施例中，含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12培养基的加入量为：与含有猪脂肪祖细胞的单细胞悬液等体积。
18.进一步的，消化时间为30～150min；
19.进一步的，消化温度为37℃；
20.进一步的，所述消化在摇床上以30rpm～120rpm的转速震荡下操作。与传统的采用移液管或注射器机械辅助消化过程，消化每克组织可节约0.5～2h，而且节约劳动成本。
21.进一步的，所述含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液可顺利通过10～50ml注射器针头；优选的，所述含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液可顺利通过30ml注射器针头。
22.进一步的，所述切碎为将漂洗后的猪脂肪组织切碎至0.1～0.5mm3。在某个特殊的实施例中，使用绞肉机将组织剪碎，以实现高通量处理组织；在某个特殊的实施例中，绞肉机工作参数为切割速度为30～120次/s，每间隔5s，切割50～100次，优选的60～80次。
23.进一步的，步骤(2)中，所述离心为在80～1000g转速下离心3～15min；去除上层成熟的脂肪细胞，得到去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液，优选的，采用100～200g离心5～10min。
24.进一步的，步骤(2)中，所述细胞筛过滤为将去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液经过60～200目的细胞筛过滤，得到去除成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液；
25.优选的，所述细胞筛过滤为将去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液依次经过200、70目的细胞筛过滤。
26.进一步的，步骤(2)中，所述裂解为将去除成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液离心去除上清后，用红细胞裂解液重悬，优选为，离心参数为300～500g离心5～10min，用红细胞裂解液重悬；室温裂解5～20min，优选为10～15min，加10倍体积pbs终止裂解后，300～500g离心5～10min，弃上清，得到去除红细胞、成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液。
27.进一步的，步骤(2)中，所述贴壁培养为将去除红细胞、成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液接种至含有10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12培养基的培养皿中，培养至细胞贴壁后用pbs漂洗，去除未贴壁的悬浮细胞，将
贴壁的单核细胞群用0.25％的胰酶消化0.5～2min后，加入含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素～链霉素双抗的dmem/f12培养基终止消化，收集细胞悬液后，离心，弃上清，用pbs重悬细胞，得到去除红细胞、成熟脂肪细胞、未贴壁细胞和大组织块的含有猪脂肪祖细胞的单核细胞群；
28.优选的，培养条件为在37℃5％co2环境培养1～3天。
29.进一步的，步骤(3)中，所述流式分选包括待分选细胞的预处理步骤：配制抗体混合液，所述抗体混合液为将cd140a,cd29,cd31,cd45四种抗体与1％bsa以体积比1:10～1:200的比例混合，按照每毫升抗体混合液预处理106～5
×
107个细胞，将去除红细胞、成熟脂肪细胞、未贴壁细胞和大组织块的含有猪脂肪祖细胞的单核细胞群与抗体混合孵育10～50min；孵育结束后，加入pbs，离心，用培养基重悬细胞，进行流式分选；
30.所述重悬采用的培养基为含10vol％胎牛血清和1～5vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，优选的，为含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基。
31.更进一步的，所述方法还包括步骤(4)：将步骤(3)纯化得到的猪脂肪祖细胞培养，进行纯度和成脂分化能力鉴定；
32.所述步骤(4)的具体操作为：
33.(1)向纯化的脂肪祖细胞中加入增殖培养基，进行细胞培养后进行pref1基因的阳性率验证；
34.(2)细胞培养达到95％密度时，进行诱导分化实验，将培养得到的猪脂肪祖细胞加入成脂分化培养基，诱导分化成为成熟脂肪细胞，进行油红o染色鉴定成脂分化效率；
35.进一步的，(1)中所述增殖培养基，为含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，并补充碱性成纤维细胞生长因子，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～20ng/ml，优选为5～10ng/ml；
36.进一步的，(2)中所述成脂分化培养基及下述事实例中的诱导成脂分化的方法为：地塞米松为1μm、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤为0.1mm、胰岛素为10μg/ml、吲哚美辛为0.1mm、罗格列酮为1μm的含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，持续5天；然后将分化培养基替换为维持分化培养基，为胰岛素为10μg/ml的含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，持续2天；最后，将维持分化培养基替换为含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，持续3天。
37.本发明的第二个目的是提供前述的猪脂肪祖细胞的纯化方法在培养脂肪中的应用。
38.本发明所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量均为10000u/ml，链霉素的含量均为10mg/ml。
39.本发明技术方案所实现的有益效果为：
40.本发明首次将cd140a,cd29,cd31,cd45四种抗体组合，对猪脂肪祖细胞进行分选。较以往的采用差速贴壁法纯化的脂肪祖细胞，使用本发明的纯化方式，获得的猪脂肪祖细胞可高效的向成熟脂肪细胞分化，极大的提高了纯化效果。此外本发明也对传统上单细胞分离效率低下、耗时费力的问题加以改善，如采用绞肉机剪碎皮下脂肪组织、在摇床上进行消化、采用离心去除大量的成熟脂肪细胞等，应用我们的方法，极大的缩短了脂肪祖细胞分
离所需的时间和降低分离细胞的劳动强度。同时，应用本发明建立的纯化猪脂肪祖细胞的方法，可高效的获得培养脂肪用的高纯度猪脂肪祖细胞，并且所得的脂肪祖细胞能够在体外大规模增殖，并分化为成熟脂肪细胞。
附图说明
41.图1为剪刀和绞肉机剪碎皮下脂肪组织效率统计图；
42.图2为机械吹打和摇床振荡消化皮下脂肪组织效率统计图；
43.图3为去除和未去除成熟脂肪细胞的过滤效率统计图；
44.图4为猪脂肪祖细胞的流式细胞分选流程图；
45.图5为猪脂肪祖细胞分选结果图；
46.图6为流式分选纯化脂肪祖细胞(lin-:cd29

cd140a

)的分选效率图；
47.图7为分选前后的细胞转录组结果主成分分析图
48.图8为分选前后的细胞转录组结果热图，
49.图9为分选前后差异基因表达火山图，a apc(lin-:cd29

cd140a

)与未分选的svf相比，b为apc(lin-:cd29

cd140a

)与lin-:cd29-cd140a-相比，c为lin-:cd29-cd140a-与未分选的svf相比。
50.图10为脂肪祖细胞(apc)标志基因的表达量，a为itga5基因表达量，b为paqr7基因表达量，c为tnc基因表达量，d为cd44基因表达量；
51.图11为流式分析纯化效果分析图，a为cd140a流式分析直方图，b为cd29流式分析直方图；
52.图12为分选前分选后的细胞成脂分化结果分析图，a为油红o染色图，b为成脂面积百分比统计图，c成脂分化关键基因c/ebpα和fabp4的表达量图；
53.图13为脂肪祖细胞制备培养脂肪，a空白水凝胶宏观图，b培养脂肪宏观图，c猪皮下脂肪组织宏观图，d培养脂肪全组织尼罗红染色图(分别放大40倍、100倍和200倍)，e脂肪生成相关基因c/ebpβ、pparγ、c/ebpα和lpl的表达量，f终末分化相关基因plin1、fabp4、adipoq的表达量。
具体实施方式
54.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
55.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
56.本发明实验样品为3日龄的仔猪。
57.本发明发现，将采用绞肉机，可有效的将皮下脂肪组织剪碎，而不影响单细胞的收获效率，采用绞肉机剪碎组织每克组织可节约2～10min，极大缩短了分离细胞所需时间。另外，大动物的脂肪组织中结缔组织较多，传统的消化方法难以充分消化，且难以有一定的标准表明消化完全。经过多次尝试表明，将混合物置于摇床上振荡消化与传统采用移液管和注射器等机械方式消化，消化每克组织可节约0.5～2h，极大提高消化效率，并节约劳动力。当消化混合物(即含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液)能够流畅的通过10～50ml的注射器针头时，所得到的消化混合物能够较为流畅的通过细胞筛进行过滤。尤其是脂肪祖细胞在过滤过程中，传统方法未将成熟脂肪细胞事先移除，极大影响后续纯化步骤，在本发明中发
现利用成熟脂肪细胞浮力大的特点，离心去除成熟脂肪细胞后，每过滤50ml含脂肪祖细胞的混合物可节约0.5～1.5h，可有效提高过滤效率。而且后续的纯化步骤如细胞筛过滤，红细胞裂解，贴壁培养等步骤可以有效的减少非脂肪祖细胞的比例，从而减少分选抗体的使用，提高分选效率。所得的脂肪祖细胞能够在体外增殖，并更高比例的分化为成熟脂肪细胞。
58.本发明的猪脂肪祖细胞分离纯化方法，为根据猪脂肪祖细胞特征性的表面标志物，应用流式细胞分选的方法获得高纯度的猪脂肪祖细胞。
59.本发明的关键是通过对采用绞肉机、摇床上振荡辅助消化、采用是否能够流畅通过3～50ml注射器作为判断是否消化完全的标准、离心去除成熟脂肪细胞，分离得到脂肪单核细胞。再通过cd140a,cd29,cd31,cd45的抗体组合，分选得到高纯度的脂肪祖细胞。
60.实施例1猪脂肪中单核细胞的分离和初步纯化方法：
61.无菌条件下取猪皮下脂肪组织，75％酒精漂洗时间为20s，含青霉素-链霉素双抗的pbs漂洗时间为30s。将获得的猪脂肪组织保存在含有3vol％的青霉素-链霉素双抗的dmem/f12培养液中；24h以内进行下一步。
62.在无菌条件下用绞肉机将皮下脂肪组织剪成1mm3大小的组织块，将剪碎的皮下脂肪组织加入消化液，所述消化液为含1％ⅰ型胶原酶和3vol％青霉素-链霉素双抗的1％牛血清白蛋白溶液，碎脂肪组织和消化酶液体积比为2:1，所述的消化过程包括在摇床上以80rpm的转速震荡，37℃消化90min。消化过程中先采用50ml的移液管吹打，再利用注射器吹打，每隔10分钟左右一次。消化终点判定为最后脂肪细胞消化产物能顺利通过30ml注射器针头则证明消化完全。
63.消化完成后，加入等体积的含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，终止消化，得到含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液。
64.将含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液在330g转速下离心5min，去除上层的成熟脂肪细胞，得到去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液。
65.将去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液依次经过200、70目的细胞筛过滤，得到去除成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液；
66.将去除成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液在330g离心5min去除上清后，10ml红细胞裂解液重悬；室温裂解10min，加10倍体积pbs终止裂解后，330g离心5min，弃上清，得到去除成熟脂肪细胞、大组织块和红细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液。
67.将去除成熟脂肪细胞、大组织块和红细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液接种至含有加入含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基的培养皿中，在37℃5％co2环境培养3天至细胞贴壁。
68.培养后可见大量细胞贴壁。同时也有大量的悬浮细胞和组织碎片。通过pbs清洗1～2次，可以去除大量悬浮细胞和组织碎片，取贴壁细胞用2ml 0.25％的胰酶消化1min后，加入2ml含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基终止消化，收集细胞悬液后，在330g离心5min，弃上清，用2ml pbs重悬细胞，然后用血球计数板计数，在330g离心5min，弃上清，得到去除红细胞、成熟脂肪细胞、未贴壁细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞群。
69.得到去除红细胞、成熟脂肪细胞、未贴壁细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞群，达到初步纯化的目的。
70.结果显示，采用绞肉机将皮下脂肪组织剪碎至1mm3，与传统采用剪刀剪碎组织的速度约为0.5g/min，而绞肉机剪碎组织的速度约为15g/min，采用绞肉机剪碎组织每克组织可节约14.5min(图1)；消化过程中，在摇床上连续振荡与传统的采用移液管或注射器机械辅助(如移液管或注射器吹打)消化，每克组织可节约1.5h(图2)。每过滤50ml去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液需0.4h，而未去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液每过滤50ml需1.25h，每过滤50ml可节约0.85h(图3)。
71.实施例2猪脂肪中单核细胞流式分选方法
72.猪脂肪祖细胞流式分选。
73.(1)流式分选包括待分选细胞的预处理步骤：配制抗体混合液，所述抗体混合液为将cd140a,cd29,cd31,cd45四种抗体与1％bsa以体积比1:40的比例混合，按照每毫升抗体混合液预处理107个细胞，将含脂肪祖细胞的单细胞与抗体混合孵育30min；孵育结束后，加入pbs，离心，用培养基重悬细胞，进行流式分选；所述培养基为含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基。
74.(2)使用流式细胞分选仪(bd ariaii)分选到97％的cd31和cd45阴性细胞，然后得到51.7％的cd140a和cd29阳性细胞，即为猪脂肪祖细胞(图4和5)。
75.结果显示，采用上述纯化策略，仔猪皮下脂肪组织单核细胞中脂肪祖细胞(lin
～
：cd29

cd140a

)的占未分选细胞的61.97
±
10.51％(图6)。
76.实施例3转录组鉴定猪脂肪祖细胞
77.将流式分选得到的p1代脂肪祖细胞(apc)和双阴性细胞(lin-:cd29-cd140a-)、未分选的细胞(svf)接种到培养皿，增殖培养3天后，用trizol提取总rna样品，由北京诺禾致源生物科技有限公司进行转录组测序。
78.所述的增殖培养，为含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，并补充碱性成纤维细胞生长因子，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5～10ng/ml。
79.结果显示，主成分分析(pca)表明，三组样本按细胞类型紧密聚类，脂肪祖细胞(apc)、未分选的细胞(svf)和lin-:cd29-cd140a-在不同维度上分离(图7)。此外，热图数据表明，脂肪祖细胞(apc)与lin-:cd29-cd140a-细胞与未分选的svf细胞的转录组图谱显著不同(图8)。差异表达基因分析(degs，log2 fc》1，p《0.05)表明，在脂肪祖细胞(apc)与未分选的细胞(svf)和lin-:cd29-cd140a-细胞之间分别检测到3191和1559degs，在apc和lin-:cd29-cd140a-细胞中检测到1101degs(图9)。脂肪祖细胞(apc)标记基因tnc，cd44，paqr7，itga5的基因表达量(fpkm)在分选后的脂肪祖细胞(apc)中均高于为分选的细胞(svf)和lin-:cd29-cd140a-(图10)。
80.对流式细胞分选纯化得到的猪脂肪祖细胞，进行流式分析以确认本发明纯化的猪脂肪祖细胞的纯化效果。包括待分析细胞的预处理步骤：cd140a,cd29两种抗体分别与1％bsa以体积比1:40的比例配置成工作液，按照每毫升抗体混合液预处理107个细胞，将含脂肪祖细胞的单细胞与抗体混合孵育30min；孵育结束后，加入pbs，离心，用培养基重悬细胞，进行流式分析；所述培养基为含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12
的培养基。使用流式细胞分析仪分别对cd140a和cd29两个标记蛋白的细胞进行分析，结果显示，使用纯化后的猪脂肪祖细胞cd140a阳性率为84.1％(图11a)，cd29阳性率为81.5％(图11b)。
81.实施例4猪脂肪祖细胞成脂分化能力鉴定
82.(1)油红o检测成脂分化。将流式分选得到的脂肪祖细胞(apc)、未分选的细胞(svf)接种到分化培养皿，先进性增殖培养，每两天更换培养基，细胞达到95％密度时，进行诱导分化实验。
83.所述的增殖培养，所使用的增殖培养基为：10vol％胎牛血清和1vol％青霉素～链霉素双抗的dmem/f12的培养基，并补充碱性成纤维细胞生长因子，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5ng/ml；。
84.所述成脂分化培养基及诱导成脂分化的方法为：地塞米松为1μm、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤为0.1mm、胰岛素为10μg/ml、吲哚美辛为0.1mm、罗格列酮为1μm的含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素～链霉素双抗的dmem/f12的培养基，持续5天；然后将分化培养基替换为维持分化培养基，为胰岛素为10μg/ml的含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，持续2天；最后，将维持分化培养基替换为含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素～链霉素双抗的dmem/f12的培养基，持续3天。
85.培养结束后，将得分化为成熟脂肪细胞的脂肪祖细胞(apc)、未分选的细胞(svf)和lin-:cd29-cd140a-细胞用4％多聚甲醛室温固定15min，pbs浸洗3次，每次3min，加入500μl配制好的油红o染料。室温孵育15min，孵育结束后用pbs洗三次，甘油明胶封片，拍照。
86.结果显示：apc诱导分化至第10天积累的脂质较未分选的svf细胞更多(图12a)，而且计算脂滴面积百分比，显示在apc中成脂面积百分比为31.18
±
3.86％，而为分选的svf细胞的成脂面积百分比为19.16
±
1.22％，纯化后得到的apc积累脂质的能力提高了1.63倍(图11b)。
87.(2)qpcr检测成脂分化关键基因的mrna水平：分别收取步骤(1)中分化第10天的脂肪祖细胞(apc)、未分选的细胞(svf)和lin-:cd29-cd140a-细胞，按照天根生物的总rna提取试剂盒说明书提取其总rna，微量分光光度计测定总rna浓度；然后按照诺唯赞的反转录试剂盒说明书将rna反转成cdna，并按照荧光定量pcr的说明书，测定脂肪生成相关基因c/ebpα分析表明，与诱导分化前相比，在第5天的表达显著更高(图12c)。与终末成熟脂肪细胞相关的基因fabp4在分化的第10天显著升高(图12c)。
88.实施例5猪脂肪祖细胞制备培养脂肪
89.(1)宏观观察培养脂肪：将2
×
107个apc轻柔的重悬在1ml 2％海藻酸钠生物墨水中。在对3d打印机表面进行彻底消毒后，用注射器将含有细胞的生物墨水轻轻转移到墨盒中。将打印压力和速度设置为183kpa和40mm/s。打印成长度、宽度和高度为30mm
×
30mm
×
1mm的网络结构。然后，使用1％cacl2交联结构1分钟，以形成稳定的结构。在添加增殖培养基之前，用pbs冲洗结构以去除交联剂的残留物。按照上述方法，在第2天更换诱导分化培养基。
90.所述的增殖培养，为含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，并补充碱性成纤维细胞生长因子，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5ng/ml。
91.所述成脂分化培养基及诱导成脂分化的方法为：地塞米松为1μm、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤为0.1mm、胰岛素为10μg/ml、吲哚美辛为0.1mm、罗格列酮为1μm的含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，持续5天；然后将分化培养基替换为维持分化培养基，为胰岛素为10μg/ml的含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12的培养基，持续2天；最后，将维持分化培养基替换为含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素～链霉素双抗的dmem/f12的培养基，持续3天，即得到培养脂肪。
92.结果显示，培养脂肪和猪皮下脂肪组织宏观观察显示，培养脂肪呈现淡黄色，但是与空白水凝胶相比，培养脂肪在外观上更接近于传统猪皮下脂肪组织(图13a～c)。同时，测定了培养脂肪、空白水凝胶和猪皮下脂肪组织的l*、a*、b*值，与宏观观察结果一致，培养脂肪的b*值显著高于空水凝胶和猪皮下脂肪组织(表1)。
93.表1培养脂肪肉色指标
[0094][0095]
(2)培养脂肪全组织尼罗红染色：按照实施例5(1)所述的方法制备培养脂肪，将培养脂肪用4％多聚甲醛室温固定15min，弃固定液，pbs洗三遍，加入500μl尼罗红染色液，37℃孵育15min，弃染色液，pbs洗三遍，倒置荧光显微镜拍照，结果显示：全组织尼罗红染色显示培养脂肪有大量的脂滴积累(图13d)。
[0096]
(3)qpcr检测成脂分化关键基因的mrna水平：按照实施例5(1)所述的方法制备培养脂肪，并按照实施例4(2)所述的方法检测基因表达量。脂肪生成相关基因c/ebpβ、pparγ、c/ebpα和lpl的定量pcr分析表明，与诱导分化前相比，在第5天的表达显著更高(图13e)。与终末分化相关的基因plin1、fabp4、adipoq在分化的第10天显著上调(图13f)
[0097]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0098]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。