一种用于检测AKR1B10的试剂盒及其制备方法与流程

一种用于检测akr1b10的试剂盒及其制备方法
技术领域
1.本发明属于医学检验技术领域，涉及一种用于检测akr1b10的试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.醛酮还原酶家族1成员b10(akr1b10)是醛酮还原酶超家族的一个新成员。akr家族主要是以单体可溶性蛋白的形式存在，分子量介于34～37kda，akr1b10基因位于7号染色体长臂3区3带，其cdna序列全长约1.35kb，编码由316个氨基酸残基构成、分子量大小为36kda的蛋白质。akr1b10的功能主要有：羰基解毒、参与视黄酸代谢、调节脂质合成、调节蛋白质的异戊烯化和信号蛋白质的激活、参与调节sip信号通路。akr1b10与多种肿瘤关系密切，大量研究表明，akr1b10可作为肝癌诊断和预后的标志物。
3.在常规的akr1b10检测中，采用时间分辨免疫荧光分析法对akr1b10进行检测，使用的标记物是铕离子(eu
3
)，通过加入底物进行反应获得检测信号，因而存在检测时间长、灵敏度低等问题。专利号zl 20141057977.0(授权公告号：cn104650234b)的专利文件公开了一种可以提高akr1b10检测灵敏度的方法，其采用了化学发光方法，具体方案为使用双抗夹心方法，一株抗体标记生物素，另外一株抗体标记吖啶酯，抗体与检测样品中游离的akr1b10结合形成“三明治”结构后，通过其中一株抗体上的生物素与磁微粒上的链霉亲和素结合，使整个“三明治”复合物被固定在磁微粒上，经磁分离去除多余杂质后，经预激发液和激发液处理，使用化学发光免疫分析仪检测发光强度，经计算得到样本中akr1b10。这一方法与市场上销售的akr1b10检测试剂盒相比，具有一定方法学上的进步，但因akr1b10在人体中含量少，为pg级别，研制出一种灵敏度更高，反应时间更短的试剂盒是很有必要的。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测akr1b10的试剂盒，并提供了上述试剂盒的制备方法，使用此试剂盒的检测方法能够提高检测akr1b10的灵敏度和线性范围。
5.本发明是这样实现的，一种用于检测akr1b10的试剂盒，包括akr1b10第一抗体和akr1b10第二抗体，所述akr1b10第二抗体标记有信号放大标记物，所述信号放大标记物包括小分子发光标记物以及偶联于小分子发光标记物的聚合物，所述聚合物和所述akr1b10第二抗体相连接。
6.进一步地，所述akr1b10第一抗体连接有载体，所述载体为磁微粒。
7.进一步地，所述载体表面修饰有活性基团。
8.进一步地，所述聚合物为聚氨基酸和生物大分子中的任意一种，所述小分子发光标记物为吖啶酯和异鲁米诺中的任意一种。
9.进一步地，所述聚氨基酸为聚赖氨酸，所述生物大分子为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。
10.进一步地，所述小分子发光标记物经活化与nhs基团连接，所述聚合物中的氨基与
nhs基团反应而使聚合物与小分子发光标记物偶联形成信号放大标记物。
11.进一步地，所述试剂盒还包括使得所述小分子发光标记物发光的激发试剂，所述激发试剂包括预激发液和激发液。
12.进一步地，所述预激发液为酸性双氧水溶液，所述激发液为强碱溶液。
13.进一步地，还包括akr1b10校准品和akr1b10质控品，所述akr1b10校准品和akr1b10质控品均包括akr1b10抗原。
14.本发明还提供一种如上述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
15.包被有akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物的制备：将表面修饰有活性基团的载体和含有akr1b10第一抗体的包被液混合，使得载体包被有akr1b10第一抗体，采用封闭液和包被有akr1b10第一抗体的载体反应，得到包被有akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物；
16.信号放大标记物标记的akr1b10第二抗体的制备：将小分子发光标记物活化，然后使活化的小分子发光标记物和聚合物反应得到信号放大标记物，再对信号放大标记物进行活化，之后使活化的信号放大标记物和akr1b10第二抗体反应，得到标记有信号放大标记物的akr1b10第二抗体，信号放大标记物标记的akr1b10第二抗体。
17.本发明还提供一种akr1b10的检测方法，包括以下步骤：
18.使用上述的试剂盒测定受试者待测样本和akr1b10校准品的信号强度；
19.根据akr1b10校准品中不同浓度的akr1b10重组抗原的信号强度建立标准曲线；
20.根据待测样本的信号强度和标准曲线计算待测样本中akr1b10的含量。
21.进一步地，所述检测方法的检测结果用作判断细胞异常增殖的指标，以用于肿瘤疾病和神经系统是否异常的诊断。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果表现为：
23.1、本发明将小分子发光标记物连接于聚合物上制得信号放大标记物，由于一个聚合物分子可与多个小分子发光标记物分子连接，如此能够大大增加小分子发光标记物的标记量，从而实现对akr1b10检测信号的放大功能，从而能够提高akr1b10检测灵敏度，进而扩大akr1b10的线性检测范围；
24.2、本发明采用小分子发光标记物标记akr1b10第二抗体，能够直接发光产生检测信号，直接发光反应时间短，从而大大提高akr1b10的检测速度。
25.3、本发明的akr1b10第一抗体和akr1b10第二抗体为不同的抗体，能够识别不同的特异性表位，第二抗体和akr1b10特异性结合时，不受第一抗体和akr1b10发生免疫应答的而占据抗原表位的影响，因而能够提高第二抗体和akr1b10结合效率，并通过信号放大标记物放大检测信号，进一步提高检测akr1b10的灵敏度，进而扩大akr1b10的线性检测范围；
26.4、本发明的试剂盒具有检测灵敏度高、特异性强，检测时间短，检测成本低，可自动化操作的优点，采用本发明的试剂盒来检测akr1b10，克服了常规的akr1b10检测方法(时间分辨免疫荧光分析法)中存在的检测时间长、灵敏度低等问题。
附图说明
27.图1为实施例1提供的akr1b10第二抗体的标记过程示意图；
28.图2为实施例1提供的试剂盒中校准品建立的标准曲线；
29.图3为实施例1提供的试剂盒中校准品的拟合浓度和理论浓度的线性关系图；
30.图4为实施例1提供的试剂盒和时间分辨荧光免疫分析法比较图。
具体实施方式
31.为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
32.本发明的实施例提供一种用于检测akr1b10的试剂盒，包括akr1b10第一抗体和akr1b10第二抗体，所述akr1b10第二抗体标记有信号放大标记物，所述信号放大标记物包括小分子发光标记物以及偶联于小分子发光标记物的聚合物，所述聚合物和所述akr1b10第二抗体相连接。
33.其中，将小分子发光标记物连接于聚合物上制得信号放大标记物，再与akr1b10第二抗体结合得到标记有信号放大标记物的akr1b10第二抗体，如此能够大大增加小分子发光标记物的标记量，从而实现对akr1b10检测信号的放大功能，从而能够提高akr1b10检测灵敏度，进而扩大akr1b10的线性检测范围；且采用小分子发光标记物标记akr1b10第二抗体，能够直接发光产生检测信号，直接发光反应时间短，从而大大提高akr1b10的检测速度，如此克服了常规的akr1b10检测(时间分辨免疫荧光分析法)中存在的检测时间长、灵敏度低等问题。
34.其中，akr1b10第一抗体、akr1b10第二抗体为不同的抗体，两种抗体能够同时与akr1b10表面的不同表位结合形成双夹心复合物，检测时利用akr1b10第一抗体将待测样本中的akr1b10分离出来，之后akr1b10第二抗体与akr1b10结合，akr1b10第二抗体和akr1b10特异性结合时，不受akr1b10第一抗体和akr1b10结合而占据抗原表位的影响，因而能够提高akr1b10第二抗体和akr1b10结合效率。
35.具体地，所述akr1b10第一抗体连接有载体，所述载体为磁微粒，将akr1b10第一抗体偶联在磁微粒表面上形成包被akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物，将待测样本与免疫磁微粒复合物反应，通过磁分离，将免疫磁微粒复合物分离出来，实现了将待测样本中的akr1b10分离出来的目的。
36.具体地，所述载体表面修饰有活性基团，所述akr1b10第一抗体和所述活性基团相连接，如此可使akr1b10第一抗体以共价偶联的方式固定在磁珠上，得到包被有akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物，其稳定性更强，磁微粒不易脱落，不易受环境影响。
37.具体地，活性基团包括但不限于羧基、氨基、醛基、亲和素等，磁微粒和akr1b10第一抗体的偶联方法包括但不限于碳二亚胺法、戊二醛法、过碘酸钠法、n-羟基琥珀酰亚胺酯法、马来酰亚胺法等。
38.具体地，所述聚合物为聚氨基酸和生物大分子中的任意一种，所述小分子发光标记物为吖啶酯和异鲁米诺中的任意一种。
39.具体地，所述小分子发光标记物经活化与nhs基团连接，所述聚合物中的氨基与nhs基团反应而使聚合物与小分子发光标记物偶联形成信号放大标记物。
40.其中，聚合物自身结构中含有羧基和多个氨基，小分子发光标记物经活化与nhs基团连接，多个氨基可与多个nhs基团反应，从而使一个聚合物分子连接多个小分子发光标记
物，能够大大增加小分子发光标记物的标记量，大大增强akr1b10的检测信号，起到放大akr1b10检测信号的作用，从而提高检测akr1b10的灵敏度，并增加akr1b10的线性检测范围；小分子发光标记物能够直接发光产生检测信号，直接发光反应时间短，从而大大提高akr1b10的检测速度，克服常规检测中检测时间长的问题。
41.具体地，所述聚氨基酸为聚赖氨酸，所述生物大分子为牛血清白蛋白或血蓝蛋白，聚赖氨酸的标记过程如图1所示。
42.具体地，试剂盒还包括使得小分子发光标记物发光的激发试剂，所述激发试剂包括预激发液和激发液，使得发光标记物在激发试剂的作用下发出闪光，因而本技术试剂盒具有检测耗时短的优点。
43.优选的，所述小分子发光标记物为吖啶酯或异鲁米诺时，所述预激发液为酸性双氧水溶液，所述激发液为强碱溶液，先加作为预激发液的酸性双氧水，一个作用是保护吖啶基团，一个作用是打开已经固化的标记抗体与抗原的结合，使吖啶酯变成游离状态，然后再加作为激发液的氢氧化钠，使整个反应环境变成碱性的氧化条件，游离的吖啶酯在碱性双氧水的作用下直接发光，通过检测发光强度实现了对akr1b10含量的检测。
44.具体地，试剂盒还包括akr1b10校准品和akr1b10质控品，所述akr1b10校准品和akr1b10质控品均包括akr1b10抗原，所述akr1b10校准品中akr1b10抗原的浓度范围为0.0pg/ml～6000.0pg/ml，所述akr1b10质控品中akr1b10抗原的浓度为200.0pg/ml和800.0pg/ml。
45.优选的，akr1b10校准品中akr1b10抗原的浓度包括0.0pg/ml、200.0pg/ml、800.0pg/ml、1500.0pg/ml、3000.0pg/ml和6000.0pg/ml；
46.具体地，试剂盒还包括稀释液，用于对待测样品、校准品、质控品，优选地，所述稀释液为pbs缓冲液。
47.本发明实施例还提供一种如上述的试剂盒的制备方法，包括：
48.包被有akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物的制备：将表面修饰有活性基团的载体和含有akr1b10第一抗体的包被液混合，akr1b10第一抗体通过共价偶联方式固定在载体上，采用封闭液和包被有akr1b10第一抗体的载体反应，封闭液中的蛋白和载体表面的空白位置进行结合，以机械填补和吸附覆盖的方式结合在载体上，避免后续akr1b10第二抗体和载体发生非特异性反应而干扰检测结果，之后洗涤并加入稀释液得到包被有akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物；
49.信号放大标记物标记的akr1b10第二抗体的制备：将小分子发光标记物进行活化(可使用edc或ddc活化)，使其与具有活性的nhs基团连接(带nhs基团的小分子发光标记物也可直接购得)，然后使活化的小分子发光标记物中的nhs基团和聚合物中的氨基反应得到信号放大标记物，再对信号放大标记物经edc/(edc和nhs)活化，之后使活化的信号放大标记物中的羧基和akr1b10第二抗体的氨基反应，得到标记有信号放大标记物的akr1b10第二抗体，信号放大标记物标记的akr1b10第二抗体，图1为聚合物为聚赖氨酸的标记过程及与akr1b10第二抗体连接的过程。
50.本发明实施例还提供一种akr1b10的检测方法，包括以下步骤：
51.利用上述试剂盒测定受试者待测样本和akr1b10校准品的信号强度；
52.根据akr1b10校准品中不同浓度的akr1b10重组抗原的信号强度建立标准曲线；
53.根据待测样本的信号强度和标准曲线计算待测样本中akr1b10的含量。
54.具体地，所述待测样本为血清样本。
55.具体地，所述检测方法的检测结果作为判断细胞异常增殖的指标，用于肿瘤疾病、神经系统等是否异常的诊断，如肝癌、肝硬化的早期诊断、诊断、治疗指导、及预后判断。
56.以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
57.实施例1
58.本实施例制备一种试剂盒，包括包被有akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物，吖啶酯的akr1b10第二抗体，akr1b10校准品，akr1b10质控品、样品稀释液和激发试剂(包括预激发液和激发液)。其中akr1b10第一抗体为anti akr1b10 mab(fi269)，akr1b10第二抗体为anti akr1b10mab(jid619)，购自creative diagnostics，akr1b10抗原(重组蛋白)来源于生工生物公司。
59.1、包被有akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物的制备：
60.1.1制备包被有akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物所需试剂如表1所示：
61.表1
[0062][0063]
1.2取含有羧基磁珠原液用涡旋混匀器混匀，置于磁分离器上静置磁性分离2min，去除上清液；
[0064]
1.3加入含偶联试剂的偶联缓冲液，置于旋转混匀仪上室温反应30min，用偶联缓冲液洗涤三次；
[0065]
1.4加入含akr1b10第一抗体的包被液重悬，置于旋转反应仪上反应2h；
[0066]
1.5静置磁性分离2min，去除上清液，用洗涤缓冲液洗涤磁珠，静置磁性分离2min，去除上清液；
[0067]
1.6加入封闭液，涡旋混匀后置于恒温培养振荡箱中反应2h，用洗涤缓冲液洗涤磁珠，静置磁性分离2min，去除上清液；
[0068]
1.7加入1
×
pbs，涡旋混匀既得免疫磁微粒复合物。
[0069]
2、吖啶酯标记的akr1b10第二抗体的制备：
[0070]
2.1制备吖啶酯标记的akr1b10第二抗体所需试剂如表2所示：
[0071]
表2
[0072][0073]
2.2将聚合物稀释至1.0％(w/w)，搅拌下加入含带nhs基团的吖啶酯溶液(购自英国bbi solutions公司)进行标记，室温下反应2h，超声、离心、除去上清液，得到偶联于小分子发光标记物的聚合物；
[0074]
2.3将偶联于小分子发光标记物的聚合物稀释至1.0％(w/w)，搅拌下加入10mg/ml edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和10mg/ml nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)溶液，室温下反应2h，超声、离心、除去上清液，得到活化的信号放大标记物。
[0075]
2.4将akr1b10第二抗体置于缓冲液中，稀释至1.0％(w/w)，将活化的信号放大标记物置于缓冲液，稀释至1.0％(w/w)，在搅拌下向akr1b10第二抗体加入活化的信号放大标记物,室温下反应2h，超声、离心、除去上清液，得到信号放大标记物标记的akr1b10第二抗体。
[0076]
3、akr1b10校准品、akr1b10质控品、样品稀释液的制备：
[0077]
3.1akr1b10校准品、akr1b10质控品的配方如表3所示，将一定量的akr1b10抗原加入pbs缓冲液中混匀，即得对应浓度的akr1b10校准品和akr1b10质控品。
[0078]
表3
[0079][0080]
3.2样品稀释液的配方和制备如表4所示：
[0081]
表4
[0082][0083]
实施例2
[0084]
与实施例1的不同之处在于：使用1％异鲁米诺标记akr1b10第二抗体。
[0085]
实施例3
[0086]
对实施例1中制备的试剂盒进行方法学验证。
[0087]
1、操作步骤
[0088]
取实施例1制得的包被有akr1b10第一抗体的免疫磁微粒复合物工作液30μl加入至多个反应杯中，在相应的反应杯中分别加入50μl校准品、待测样品、质控品，混匀，37℃孵育50min，经过3次磁分离，加入上述制备的吖啶酯标记的akr1b10第二抗体工作液50μl，混
匀，37℃孵育20min，经过3次磁分离，然后加入100μl预激发液和100μl激发液混匀，对发光信号进行检测，记录最大的发光强度值(rlu)。检测发光信号的仪器为全自动发光免疫分析仪。
[0089]
2、校准主曲线
[0090]
将实施例1制备的akr1b10校准品溶于人空白血清中，配制成0.0pg/ml、200.0pg/ml、800.0pg/ml、1500.0pg/ml、3000.0pg/ml和6000.0pg/ml 6个浓度梯度。按照上述操作步骤进行检测，测定结果如表5所示。利用多项式拟合得到回归曲线如图2所示。根据图2可知，本实施例试剂盒的校准品得到的拟合曲线线性相关性强、线性范围宽。
[0091]
表5
[0092]
浓度(pg/ml)rlu029342002418788001046077150019825293000403879260007980216
[0093]
3、lod(最低检测限)
[0094]
平行测定20次零浓度校准品的相对发光强度，计算相对发光强度的平均值(m)和标准差(sd)，根据零浓度校准品与临近浓度(200.0pg/ml)校准品之间的浓度-发光强度结果进行两点回归拟合得出一次方程，将m 2sd所对应的发光强度代入上述方程，求得的浓度即为最低检测限应小于等于100pg/ml，具体计算结果如表6所示。本实施例提供的试剂盒最低检测限能够达到3.3248pg/ml，远远小于100pg/ml，灵敏度高，远优于现有akr1b10试剂盒的灵敏度。
[0095]
表6
[0096][0097][0098]
4、精密度
[0099]
批内精密度：用上述制备的1批用于检测akr1b10的试剂盒分别对质控品l(200.0pg/ml)和h(800.0pg/ml)进行批内精密度测试。取实施例1制备的同一批试剂盒，分
别平行测定质控品l和h10次，计算所有结果的变异系数应小于10％，具体如表7所示，变异系数远远小于10％，说明本实施例制备的试剂盒中的批内稳定性好，重复性佳，试剂盒批内系统误差小。
[0100]
批间精密度：用上述制备的3批用于检测akr1b10的试剂盒分别对质控品l((200.0pg/ml)和h(800.0pg/ml)进行批内精密度测试。每批分别平行测定质控品l和h10次，计算所有结果的变异系数应小于15％，具体如表8所示，变异系数远远小于15％，说明本实施例制备的试剂盒批间稳定性好，重复性好，试剂盒批间系统误差小。
[0101]
表7
[0102][0103][0104]
表8
[0105][0106][0107]
5、线性
[0108]
使用空白人血清样本，将最高浓度点6000.0pg/ml的校准品等5倍稀释成理论浓度为1200.0pg/ml、240.0pg/ml、48.0pg/ml、9.6pg/ml、1.92pg/ml，使用上述的校准曲线进行拟合，将拟合值与理论浓度做一元二次线性回归分析，得到拟合曲线，具体拟合结果如表9所示，理论浓度和拟合浓度的线性关系图如图3所示，r2大于等于0.99，说明本实施例制备的试剂盒的校准曲线线性关系优异，检测结果可靠性高。
[0109]
表9
[0110]
理论浓度(pg/ml)rlu拟合浓度(pg/ml)600079612455986.7120015941321209.2
240291236237.7485612748.29.6125589.61.9245351.8
[0111]
6、方法学比较(与时间分辨荧光免疫分析法比较)
[0112]
取40例待测血清样本，用醛酮还原酶1b10测定试剂盒(时间分辨荧光免疫分析法)试剂盒测试akr1b10，同时用实施例1的用于检测akr1b10的试剂盒测试，用线性回归法计算两组测试值的相关系数，计算结果如表10所示，比较结果如图4所示。
[0113]
从图4可知，实施例1制备的试剂盒与醛酮还原酶1b10测定试剂盒(时间分辨荧光免疫分析法)检测akr1b10相比，可报告范围更广，灵敏度更高，相关性好；且本实施例的试剂盒检测耗时短，本实施例仅需22min可出第一个结果，而时间分辨荧光免疫分析法需要2h；线性范围更宽，测量范围为10-6000.0pg/ml，而时间分辨荧光免疫分析法为105-6000.0pg/ml。
[0114]
表10
[0115]
[0116][0117]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。