靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗神经病理性疼痛药物中的应用

1.本公开涉及生物医药技术领域，具体地，涉及靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗神经病理性疼痛药物中的应用。


背景技术：

2.np(neuropathic pain,神经病理性疼痛)是由神经系统的原发性损害或功能障碍所引发或导致的疼痛，表现为自发性持续性的疼痛、异位痛或痛觉过敏，是临床上最常见的病症之一，持续时间长且难以根治，严重影响患者的生活质量。np发病机制复杂，涉及外周和中枢神经系统的多个方面，目前仍未完全阐释清楚。临床上用的治疗药物大多是简单的对症治疗，所使用药物多针对单一靶点，效果不明显且不良反应多。近年来大量研究发现，由促炎细胞因子诱导的神经炎症是np产生和延续的主要原因。因此，基于炎性细胞因子，探讨np的产生及镇痛机制具有重要的理论价值和现实意义。
3.小分子干扰rna具有严格的序列特异性、高效性和生物遗传性，能够特异、高效地阻断体内同源基因表达，促使同源mrna降解，诱导细胞表现出特定基因缺失的表型，而且操作简单、特异性高。本公开提供一种靶向分子标志物的试剂，用于抑制基因的表达从而缓解/治疗慢性神经疼痛。


技术实现要素：

4.本公开提供了一种靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗神经病理性疼痛药物中的应用，该靶向生物标志物的试剂敲低靶标基因c/ebpβ的表达，显著降低了clec7a的表达，进而抑制syk、erk、jnk的磷酸化水平和nlrp3、gsdmd等相关蛋白诱导的细胞焦亡，从而发挥其缓解/治疗神经病理性疼痛的药效。
5.为了实现上述目的，一方面，本公开提供了靶向生物标志物的试剂在制备治疗/缓解神经病理性疼痛中的应用，该生物标志物为cebpb。
6.根据本公开，其中，所述靶向生物标志物的试剂包括cebpb的抑制剂。
7.根据本公开，其中，所述cebpb的抑制剂包括cebpb基因的sirna、shrna、反义寡核苷酸和功能缺失型基因中的至少一种。
8.根据本公开，其中，所述cebpb的抑制剂为针对cebpb基因或其上游或下游基因的干扰分子、核酸抑制物、结合分子、小分子化合物中的至少一种。
9.根据本公开，其中，所述sirna包括sicebpb，
10.所述sicebpb的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示：
11.agaacgagcggcugcagaatt seq id no.1，
12.uucugcagccgcucguucutt seq id no.2；
13.所述shrna包括shcebpb，所述shcebpb的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示：
14.ggatccagaacgagcggctgcagaagactcgagagaacggatatagaggaaatctttttt seq id no.3,
15.gaattcagaacgagcggctgcagaagactcgagtcttctgcagccgctcgttct seq id no.4。
16.根据本公开，其中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、口服溶液、粉针和注射剂中的至少一种。
17.本公开提供了一种用于治疗/缓解神经病理性疼痛的药物组合物，该药物组合物含有sirna和/或shrna作为有效成分，所述sirna为sicebpb，
18.所述sicebpb的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示：
19.agaacgagcggcugcagaatt seq id no.1，
20.uucugcagccgcucguucutt seq id no.2。
21.所述shrna包括shcebpb，所述shcebpb的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示：
22.ggatccagaacgagcggctgcagaagactcgagagaacggatatagaggaaatctttttt seq id no.3,
23.gaattcagaacgagcggctgcagaagactcgagtcttctgcagccgctcgttct seq id no.4。
24.根据本公开，其中，所述药物组合物中还包括药学上可接受的载体；所述有效成分和药学上可接受的载体的体积比为1：(0.5-1.5)。
25.根据本公开，其中，所述药学上可接受的载体包括脂质体、阳离子多聚物和纳米材料中的至少一种。
26.根据本公开，其中，所述sirna和/或shrna作为有效成分的浓度为20-80μm。
27.通过上述技术方案，本公开提供了靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗神经病理性疼痛的药物中的应用，所述靶向生物标志物的试剂抑制cebpb转录因子的过表达，并降低了clec7a基因的表达量以及syk、erk、jnk的磷酸化水平、细胞焦亡相关蛋白nlrp3、gsdmd、il-1β和il-18等的表达量，显著减轻了细胞焦亡的发生，形成了一条完整的抑制上游转录因子、下游炎性因子和细胞焦亡通路，从而发挥其缓解/治疗神经病理性疼痛的药效。
28.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
29.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
30.图1是clec7a的过表达与cci模型中细胞焦亡的相关基因有关。
31.图2是sirna抑制clec7a表达减轻cci大鼠脊髓中细胞焦亡。
32.图3是sirna抑制clec7a表达的验证图。
33.图4是sirna抑制clec7a表达的tunel染色验证图。
34.图5是c/ebpβ是clec7a的转录因子的验证图。
35.图6是sicebpb抑制c/ebpβ表达减轻细胞焦亡的tunel染色图。
36.图7是shcebpb抑制c/ebpβ表达的结果图。
37.图8是shcebpb抑制c/ebpβ表达减轻细胞焦亡的tunel染色图。
具体实施方式
38.以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
39.一方面，本公开提供了靶向生物标志物的试剂在制备治疗/缓解神经病理性疼痛中的应用，该生物标志物为cebpb。
40.可选地，所述靶向生物标志物的试剂包括cebpb的抑制剂。
41.可选地，所述cebpb的抑制剂包括cebpb基因的sirna、shrna、反义寡核苷酸和功能缺失型基因中的至少一种。
42.可选地，所述cebpb的抑制剂为针对cebpb基因或其上游或下游基因的干扰分子、核酸抑制物、结合分子、小分子化合物中的至少一种。
43.可选地，所述sirna包括sicebpb，
44.所述sicebpb的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示：
45.agaacgagcggcugcagaatt seq id no.1，
46.uucugcagccgcucguucutt seq id no.2。
47.所述shrna包括shcebpb，所述shcebpb的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示：
48.ggatccagaacgagcggctgcagaagactcgagagaacggatatagaggaaatctttttt seq id no.3，
49.gaattcagaacgagcggctgcagaagactcgagtcttctgcagccgctcgttct seq id no.4。
50.可选地，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、口服溶液、粉针和注射剂中的至少一种。
51.另一方面，本公开提供了一种用于治疗/缓解神经病理性疼痛的药物组合物，该药物组合物含有sirna和/或shrna作为有效成分，
52.所述sirna为sicebpb，所述sicebpb的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示：
53.agaacgagcggcugcagaatt seq id no.1，
54.uucugcagccgcucguucutt seq id no.2。
55.所述shrna包括shcebpb，所述shcebpb的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示：
56.ggatccagaacgagcggctgcagaagactcgagagaacggatatagaggaaatctttttt seq id no.3,
57.gaattcagaacgagcggctgcagaagactcgagtcttctgcagccgctcgttct seq id no.4。
58.可选地，所述药物组合物中还包括药学上可接受的载体；所述有效成分和药学上可接受的载体的体积比为1：(0.5-1.5)。
59.可选地，所述药学上可接受的载体包括脂质体、阳离子多聚物和纳米材料中的至少一种。
60.可选地，所述sirna和/或shrna作为有效成分的浓度为20-80μm。
61.下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
62.实施例1
63.本实施例用于说明cebpb可以作为缓解或者治疗np的靶点。
64.本公开基因芯片的检测由上海gminix生物技术公司使用affymetrix基因芯片大鼠基因2.0st阵列进行；转录组测序由北京诺禾致源生物技术公司进行，测序文库使用illumina(美国neb)的nebnextultra rna文库制备生成。
65.本公开使用的cci模型(chronic constriction injury，慢性压迫性损伤)是np研究中最常用的一种动物模型，通过在一侧坐骨神经主干上松散结扎4道造成对神经的压迫，从而导致异位痛和热痛觉过敏，已被广泛应用于研究。有研究表明cci模型通常伴随有较强的局部神经炎症，包括神经内水肿、神经结构紊乱和免疫细胞浸润，与sham组(假手术组)大鼠相比，cci模型组的机械缩足阈值显著降低(图1a)。
66.首先基于sham组和cci组大鼠的脊髓样本，进行基因芯片(n＝3，混样)和转录组测序(n＝4)。结果表明，这两项检测分别确定了sham组和cci组之间的602个(361个上调基因和241个下调基因)和1304个(667个上调基因和637个下调基因)差异基因(图1b和c)。之后，根据fc值(fold change，差异倍数)和p值，筛选两批结果中排名靠前的差异基因、取并集，并进一步通过文献调研排除在np已有较多研究的基因，最终将目的基因聚焦在clec7a(fc分别为6.5039和12.2381)。通过免疫荧光实验(n＝4)、qpcr(n＝6)、western blot(n＝6)，进一步验证了clec7a在cci模型中的高表达(图1d-f)。
67.在转录组测序数据中，fc值排名第一的为nlrp3，该基因主要参与细胞焦亡的经典通路。对cci模型中细胞焦亡相关基因nlrp3、il1β和il18的表达以及与目的基因clec7a表达的相关性进行了pearson相关性分析。结果显示，clec7a mrna的表达与nlrp3、il1β和il18的表达显著正相关(图2)。
68.实施例2
69.体内试验验证clec7a能够作为缓解或者治疗np的靶点，通过向鞘内注射siclec7a敲低clec7a的表达，进而减轻np。
70.抑制nlrp3诱导的细胞焦亡从而减轻np：采用sirna干扰(small interfering rna，小干扰rna)的方法，通过向cci大鼠鞘内注射siclec7a，局部敲低clec7a表达，检测抑制clec7a是否可能通过抑制nlrp3诱导的细胞焦亡从而减轻np。实验动物共分为5组(sham、sham si-nc、cci、cci si-nc、cci siclec7a，nc为negative control，阴性对照组)。si-nc的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.5和6所示，siclec7a的正义链和反义链的核酸序列如seq id no.7和8所示。
71.5-uucuccgaacgugucacgutt-3 seq id no.5，
72.5-acgugacacguucggagaatt-3 seq id no.6；
73.5-gaguucauugaaagccaaatt-3 seq id no.7，
74.5-uuuggcuuucaaugaacuctt-3 seq id no.8；
75.在行为学上，与sham组相比cci组大鼠的机械缩足阈值显著降低；与cci si-nc组相比，cci siclec7a组的机械缩足阈值显著升高，疼痛明显减轻(n＝10)(图3a)；在分子水平上，通过western blot(n＝9)、免疫组化(n＝6)实验，表明：鞘内注射siclec7a，显著降低了大鼠脊髓内clec7a的表达；并通过降低syk、erk、jnk的磷酸化水平，显著降低了细胞焦亡相关蛋白nlrp3、gsdmd等的表达；elisa实验表明，鞘内注射siclec7a抑制clec7a表达，显著降低了cci大鼠血清中炎性因子il1β和il18的表达(n＝9)(图3b-e)。tunel染色实验，是一
种检测细胞或组织内细胞凋亡发生情况的方法，也可以直观反应细胞焦亡的情况，结果显示，抑制cle c7a表达显著减轻了cci大鼠脊髓中细胞焦亡的发生(n＝6)(图3f和图4)。
76.实施例3
77.确认c/ebpβ是clec7a的转录因子：先在tfsearch search软件(http://www.cbrc.jp/research/db/tfsear ch.html)上，预测到c/ebpβ在clec7a启动子区域前2000bp上共有17个可能的结合位点(图5a)；为进一步确证具体的结合位点，本公开进行了双荧光素酶报告基因实验，在hek293t细胞上转染不同长度的clec7a启动子报告基因载体(0-500bp、0-100bp、0-1500bp、0-2000bp)，然后检测荧光素酶活性。结果显示，在所有报告基因载体中，缺失其余结合位点但保留前两个结合位点(0-500bp)不影响荧光素酶活性，即不影响c/ebpβ的转录活性(n＝3)(图5b)；表明，c/ebpβ在clec7a上主要的结合位点在启动子0-500bp内，而后将0-500bp内预测的结合位点序列(-483bp到-467bp)突变并构建成载体，转染hek293t细胞，然后检测荧光素酶活性。结果显示，突变后c/ebpβ对clec7a的转录活性降低了3.5倍(n＝3)(图5c)，表明c/ebpβ可能是clec7a的转录因子，正向调控clec7a转录。
78.验证c/ebpβ与内源性clec7a启动子区的结合：通过chip-qpcr实验在野生型bv2小胶质细胞和细胞焦亡模型细胞(lps atp处理)中，使用c/ebpβ抗体或igg阴性对照进行chip分析，针对拉下来的dna-蛋白质设计引物进行qpcr实验，引物为clec7a-chip-q1、clec7a-chip-q2和clec7a-chip-q3。clec7a-chip-q1引物的正义链和反义链的序列如seq id no.7和8所示，clec7a-chip-q2引物的正义链和反义链的序列如seq id no.9和10所示，clec7a-chip-q3引物的正义链和反义链的序列如seq id no.11和12所示。
79.clec7a-chip-q1
80.f：5-atgggccagggtcatcttcc-3 seq id no.9，
81.r：5-gcagcgagtgagagccttc-3 seq id no.10；
82.clec7a-chip-q2
83.f：5-tgttctccttgttgacttacagc-3 seq id no.11，
84.r：5-gcactggcttcattcttctgga-3 seq id no.12；
85.clec7a-chip-q3
86.f：5-ttcgctttgtgtcgctggag-3 seq id no.13，
87.r：5-tataactgcctggagtcgg-3 seq id no.14；
88.结果显示，与野生型细胞相比，焦亡模型细胞中c/ebpβ的靶基因clec7a显著增加(图5d和e)，表明c/ebpβ能够与clec7a启动子区结合并激活clec7a转录。
89.实施例4
90.本实施例用于说明sicebpb可以抑制c/ebpβ的过表达，进而抑制clec7a的过表达，减轻细胞焦亡的发生，缓解/治疗np。
91.向cci大鼠鞘内注射sirna，实验动物共分为5组(sham、sham si-nc、cci、cci si-nc、cci sicebpb)。
92.在行为学上，与sham组相比cci组大鼠的机械缩足阈值显著降低；与cci si-nc组相比，cci sicebpb组的机械缩足阈值显著升高，疼痛明显减轻(n＝10)(图6a)；
93.在分子水平上，通过western blot(n＝9)、免疫组化(n＝6)实验，表明：鞘内注射
sicebpb，显著降低了大鼠脊髓内c/ebpβ的表达；并显著降低了clec7a的表达以及syk、erk、jnk的磷酸化水平、细胞焦亡相关蛋白nlrp3、gsdmd等的表达(图6b-c)；
94.tunel染色实验结果显示，抑制c/ebpβ表达显著减轻了cci大鼠脊髓中细胞焦亡的发生(n＝6)(图6d)。
95.实施例5
96.本实施例通过回复实验说明shcebpb能够敲低c/ebpβ，减轻细胞焦亡，从而缓解或治疗np。
97.慢病毒载体plv.1的构建：实验步骤(t4连接酶法)：(1)合成sense和antisense单链dna片段；(2)单链dna片段退火成双链；(3)用t4连接酶在22℃，30min将目的基因连接到载体片段上，过程如表1所示；(4)转化dh5α感受态细胞，挑选单菌落，进行pcr鉴定；(5)送阳性菌测序；(6)比对测序结果，序列正确的菌提取质粒并保种。
98.表1 t4连接酶酶连体系
[0099][0100]
表2 实验试剂
[0101]
名称品牌货号hipure tissue dna mini kit(基因组提取试剂盒)magend3121-03primer(引物)泓迅公司 primestar max dna polymerase(pcr酶)takarar045aclonexpress ii one step cloning kit(重组酶)诺唯赞公司c112-01t4 dna ligase(t4连接酶)takara2011ahipure plasmid ef midi kit(中提质粒)magenp1113-03hipure gel pure dna mini kit(胶回收试剂盒)magend2111-02无水乙醇广州化学试剂 琼脂糖biowestg10
[0102]
表3 实验仪器
[0103]
[0104][0105]
shrna序列的正义链和反义链如seq id no.3和4所示，质粒载体信息如表4所示。
[0106]
ggatccagaacgagcggctgcagaagactcgagagaacggatatagaggaaatctttttt seq id no.3
[0107]
gaattcagaacgagcggctgcagaagactcgagtcttctgcagccgctcgttct seq id no.4
[0108]
表4
[0109]
质粒全名plv.1-shcebpb质粒大小(bp)7906bp克隆空载体plv.1启动子h1 promoter复制子ori，f1 ori，sv40 ori真核细胞筛选抗性puror(抗嘌呤霉素)原核细胞筛选抗性ampr(抗氨苄青霉素)荧光标签egfp(增强型绿色荧光)克隆酶切位点bamhi and ecori插入基因长度66bp插入序列针对mus cebpb的shrna序列
[0110]
plvso5-clec7a载体的构建：(1)合成基因引物，pcr调取基因cds序列；(2)酶切载体；(3)用t4连接酶在22℃，30min将目的基因连接到载体片段上；(4)转化dh5α感受态细胞，挑选单菌落，进行pcr鉴定；(5)送阳性菌测序；(6)比对测序结果，序列正确的菌提取质粒并保种。
[0111]
表5 t4连接酶酶连体系
[0112]
[0113]
实验试剂和实验仪器如表2和3所示，插入基因序列如seq id no.15所示
[0114]
gaattccgccaccatggacgaagatggatatactcaattagacttcggcactcgaaacatccacaaaagacctgtaaaatcagagaaaggaagcccagctccatcttctcgttggcggtccattgcggtagctttaggaatcctgtgcttgctcacagtagtggtcgcagcagtgctgggtgccctagcatttcggagattcaattcagggagatatccagaggagaaagacaacttcccatcaagaaataaggagaaccacaaacccacagaaccatctttagatgagaaggtggctccctccaaggcatcccaaactacaggcgtcttttctggaccttgccttcccaattggatcatgcatgccaagagctgttatctatttagcttctcagaaaattcctggtatggaagtaggagacactgttcccagctaggagctcatctattgaagatagacaatgcaaaagaatttgagttcattgaaagccaaacatcttctcaccgtgttaactcattctggataggtctatctcgcaatcagagtgaagggccgtggttctgggaggatggatcagcatttacccccaactcgtttcaagtcagaaatacagctccccaagaaagcttaccccacaattgtgtttggatccatgggtcagaggtctacaaccaaatgtgcattgcttcctcattcactatctgtgagaaggaactgtaaggatcc seq id no.15
[0115]
表7 质粒载体信息
[0116][0117][0118]
采用慢病毒转导的方法，基于慢病毒载体plv.1和plvso5分别构建敲低c/ebpβ的plv.1-shcebpb载体、过表达clec7a的plvso5-clec7a载体及其相应的阴性对照载体plv.1-nc和plvso5-nc，并鞘内注射进入cci大鼠体内。
[0119]
在行为学上，与sham组相比cci组大鼠的机械缩足阈值显著降低，表明np模型构建成功；与cci plv.1-nc plvso5-nc组相比，只敲低c/ebpβ组的机械缩足阈值显著升高，疼痛明显减轻；只过表达clec7a组的机械缩足阈值显著降低，疼痛加重；而敲低c/ebpβ并过表达clec7a组的机械缩足阈值与cci组无明显差异。结果表明过表达clec7a回转了因敲低c/ebpβ造成的痛阈值升高(n＝10)(图7a)；在分子水平上，通过western blot(n＝9)实验，表明：鞘内注射相应的慢病毒载体，分别显著降低了大鼠脊髓内c/ebpβ的表达、升高了clec7a的表达(图7b)；tunel染色实验结果显示，注射plv.1-shcebpb抑制c/ebpβ表达显著减轻了cci大鼠脊髓中细胞焦亡的发生；而注射plvso5-clec7a载体过表达clec7a可逆转此现象(n＝
9)(图8)。因此，shcebpb能够抑制c/ebpβ，进而抑制clec7a的表达，减轻了cci大鼠脊髓中细胞焦亡的发生。
[0120]
通过上述技术方案，表明cebpb基因可作为np治疗的靶点，c/ebpβ作为clec7a基因的上游转录因子，靶向生物标志物的试剂能够抑制转录因子的过表达，进一步降低了生物标志物clec7a基因以及syk、erk、jnk的磷酸化水平、细胞焦亡相关蛋白nlrp3、gsdmd、il-1β和il-18等的表达量，显著减轻了细胞焦亡的发生，形成了一条完整的抑制上游转录因子、下游炎性因子和细胞焦亡通路，在np中发挥重要作用。
[0121]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0122]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0123]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。