一种快速检测花生中黄曲霉毒素B1电化学免疫传感器及其制备方法和应用

一种快速检测花生中黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于电化学免疫传感器检测霉菌毒素领域，涉及电化学免疫传感器制备，具体涉及一种快速检测花生中黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.黄曲霉毒素b1（afb1）是对人类健康危害极大，毒性最大的一种霉菌毒素，它们是由多种曲霉产生的多肽化合物，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，能在＞100℃的温度下稳定存在。广泛产生于食品中，如谷物及其副产物、香料、坚果、牛奶和干果等。根据联合国粮食及农业组织（fao）的数据，全球每年约有25%的农产品受到不同程度污染，给农业造成了巨大的经济损失。花生油是生活中基础的食品用料，在花生生产、收获、存储、炼油过程中，由于气候、储藏环境等方面的异常，极其容易滋生afb1。又因其热稳定性强，结构不容易被破坏，从而造成花生中花生油被afb1污染。
3.目前针对afb1的检测技术主要包括酶联免疫法、试纸条法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法等。但是这些方法都有其自身的局限性，其中酶联免疫法、试纸条法灵敏度高、特异性好，但容易导致假阳性结果；气相色谱-质谱联用法、液相色谱法往往需要繁琐的样品预处理和昂贵的检测仪器，对操作人员素质和实验条件均有较高的要求，不适用于现场的快速检测。
4.英文文献发表了一种基于aunps/zn/ni-zif-8-800@graphene复合材料的电化学免疫传感器，用于检测牛奶中的莫能菌素。但存在着电流信号不理想的问题（hu m et al.label-free electrochemical immunosensor based on aunps/zn/ni-zif-8-800@graphene composites for sensitive detection of monensin in milk[j]. sensors & actuators b chemical, 2019）。
[0005]
因此，制备一种操作简单、检测快速、灵敏度高、重复性好、成本低的检测方法是本领域亟待解决的问题，目前市场并无利用zn/ni-zif-8
–
800@graphene复合材料制备电化学免疫传感器从花生中检测afb1的方法。


技术实现要素：

[0006]
针对现有花生中afb1检测技术存在成本高、假阳性、材料单一和检测限高等问题，本发明提出一种快速检测花生中黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器的制备方法和应用。本发明可以实现对花生中afb1的快速检测，具有制作成本低、便于携带、操作简单、特异性好等优点。
[0007]
为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种快速检测花生中黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：（1）zn/ni-zif-8-800的制备：通过溶剂热法，把ni(no3)2·
6h2o、zn (no3)2·
6h2o和2-甲基咪唑（hmelm）溶于甲醇中，并连续搅拌离心后取沉淀，用甲醇清洗后真空干燥；最
后，在管式炉中高温煅烧，得到黑色粉末zn/ni-zif-8
–
800；（2）zn/ni-zif-8-800@graphene的制备：将步骤（1）所得的zn/ni-zif-8
–
800和石墨烯分别加入到壳聚糖溶液中，超声分散至均匀，得到复合材料，即zn/ni-zif-8
–
800@graphene；（3）金纳米颗粒的沉积：在电极表面滴涂步骤（2）所得的复合材料，然后电沉积金纳米颗粒，得到金纳米颗粒沉积的滴涂有复合材料的电极；（4）将步骤（3）所得的电极浸泡在调节好ph的铁氰化钾、亚铁氰化钾和氯化钾的混合检测液中，检测电流信号，然后在电极表面依次滴加afb1抗体溶液和bsa溶液孵育后得到黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器。
[0008]
进一步，所述步骤（1）中ni(no3)2·
6h2o、zn (no3)2·
6h2o和hmelm的摩尔比为1：1：（10~20）进一步，所述步骤（1）中搅拌温度为20~30℃，搅拌时间为20~30h，真空干燥的时间为10~15h，高温煅烧的温度为700~900℃，高温煅烧的时间为1~2h。
[0009]
进一步，所述步骤（2）中壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为0.25%~1%进一步，所述步骤（3）中电沉积金纳米颗粒所用溶液为0.5%~1%质量比的氯金酸溶液；0.5%~1%质量比的氯金酸溶液中含有0.5m硫酸溶液，氯金酸和硫酸混合体积比为1:（10~50），电沉积中电位为-0.2v，沉积时间为100~500s。
[0010]
进一步，所述步骤（4）中调节ph为5.0~9.0；afb1抗体浓度为4.125~66μg/ml，afb1抗体孵育温度为37℃，孵育时间为10~60min；bsa的质量分数为0.5%~1%，孵育时温度为37℃，孵育时间为20~40min。
[0011]
进一步，上述方法制备的快速检测花生中黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器。
[0012]
进一步，所述的快速检测花生中黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器在快速检测花生中黄曲霉毒素b1中的应用。
[0013]
进一步，应用步骤如下：a. 将1mg/ml的afb1标准品溶液用pbs缓冲液稀释成浓度为0.01~100ng/ml的afb1溶液存于4℃冰箱中；b. 将步骤a所得的浓度为0.01~100ng/ml的afb1溶液滴涂在构建好的快速检测花生中黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器表面，以含1m氯化钾的5mm铁氰化钾及5mm亚铁氰化钾（体积比为1：1）的混合溶液作为dpv检测的分析液，在检测液中进行dpv测试，根据所得的峰电流大小与afb1的浓度之间关系，绘制标准曲线；c. 将待测样品进行预处理，滴涂至修饰好的曲霉毒素b1电化学免疫传感器表面，按照b的操作进行检测，将检测出的电流信号代入步骤b得到的标准曲线中，即得到待测样本中afb1的浓度。
[0014]
本发明具有以下有益效果：1、本发明通过对复合材料的配料比、纳米金沉积条件探索以及实验条件优化，制备了zif-8 标准模拟卡片更接近的复合材料，晶体结构更接近理论晶体结构，利用复合材料提高了传感器的灵敏度，比较适合用于本发明花生中afb1的检测。同时通过研究发现将稀硫酸与1%氯金酸溶液混合使用后，能够使电流信号显著增强，灵敏度高，检测限更低，其中稀硫酸主要是通过溶解金属氧化层，从而达到活化金属表面的目的。
[0015]
2、本发明包括复合材料的制备及传感器表面功能的修饰等步骤，用复合纳米材料zn/ni-zif-8
–
800和graphene提高了传感器的灵敏度，将afb1作为抗原，引入afb1抗体识别特异性抗原的方法使得传感器具备高效的选择性，复合材料与传感器的结合，不仅提高了afb1抗体吸附量，也改善了afb1的吸附过程，从而增大了检测效率。
[0016]
3、本发明可以实现对花生中afb1的快速检测，检测限为0.18ng/ml，加标回收率在80.26%-109.60%范围内，5次重复测定的rsd＜11%，本发明制备的快速检测花生中afb1电化学免疫传感具有制作成本低、便于携带、操作简单、灵敏度高、特异性强等优点。
[0017]
4、本发明所制备的一种快速检测花生中afb1电化学免疫传感器方法弥补了传统方法成本高、耗时耗力及易出现假阳性的不足的问题，从而实现对花生中afb1的高效及快速检测。
附图说明
[0018]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]
图1为本发明实施例1复合材料的制备流程示意图。
[0020]
图2为本发明实施例1快速检测花生中afb1电化学免疫传感器的表面功能修饰的流程示意图。
[0021]
图3为本发明实施例1复合材料的扫描电镜表征结果图，其中（a）zn/ni-zif-8 sem图、（b）zn/ni-zif-8-800 sem图、（c）石墨烯、（d）zn/ni-zif-8-800@graphene sem图、（e）zn/ni-zif-8
–
800@graphene sem-eds图。
[0022]
图4为本发明对比例复合材料的扫描电镜表征结果图，其中(a)zn/ni-zif-8、(b)zn/ni-zif-8-800、(c)石墨烯、(d)zn/ni-zif-8-800@石墨烯混合材料的sem图像、(e)壳聚糖溶液中zn/ni-zif-8-800、(f)aunps/zn/ni-zif-8-800@石墨烯复合材料的sem-eds图像。
[0023]
图5为本发明实施例1傅立叶红外光谱表征结果图，a为二甲基咪唑，b为zn/ni-zif-8。
[0024]
图6为本发明实施例1 x射线光电子能谱表征结果图，其中左图为zn/ni-zif-8-800的xps测量光谱；右图为zn/ni-zif-8-800的精细光谱，其中(a)碳1s xps光谱、(b)氮1s xps光谱、(c)镍2p xps光谱、(d)锌2p xps光谱。
[0025]
图7为本发明实施例1 x射线衍射光谱表征结果图，其中左图为实施例1 xrd图谱，右图为对比例xrd图谱。
[0026]
图8为本发明实施例1与对比例制备的复合材料的电流信号对比图。
[0027]
图9为本发明实施例1的1%氯金酸与硫酸混合沉积金与对比例制备的1%氯金酸沉积金的电流信号对比图。
[0028]
图10为本发明应用例afb1浓度测定的dpv检测图（a）和afb1浓度测定的标准曲线图（b）。
具体实施方式
[0029]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030]
afb1抗体的制备参考文献：姚静静,胡骁飞,韩俊岭,徐帆,滕蔓,邢云瑞,孙亚宁,邓瑞广,张改平.黄曲霉毒素b1单克隆抗体的制备及基于该抗体的黄曲霉毒素b1免疫学检测方法的建立[j].动物营养学报,2019,31(03):1405-1414.中的方法制得。
[0031]
bsa由河南省农业科学院动物免疫重点实验室购于gibco公司。
[0032]
实施例1本实施例快速检测花生中afb1电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：（1）zn/ni-zif-8
–
800的制备：通过溶剂热法，把ni(no3)2·
6h2o、zn(no3)2·
6h2o、hmelm以1：1：14的比例溶于甲醇，并在25℃下连续搅拌25h，离心后取沉淀，用甲醇清洗后真空干燥10h；最后，在管式炉中800℃高温煅烧1h得到黑色粉末zn/ni-zif-8
–
800，如图1所示；（2）复合材料的制备：将步骤（1）制得的zn/ni-zif-8
–
800与石墨烯以1：5的比例混合后加入5ml 0.75%的壳聚糖溶液中，超声分散至均匀，得到zn/ni-zif-8
–
800@graphene；（3）金纳米颗粒沉积：将滴涂复合材料的gce电极表面插入0.7%氯金酸中含有0.5m硫酸的溶液中，在-0.2v的电位下沉积300s，此时工作电极表面被沉上一层金纳米颗粒（aunps）；（4）传感器表面用双蒸水冲洗后，调节ph至6.0后，滴加浓度为4.125-66μg/ml的afb1的抗体在37℃孵育30min；具体地，将66μg/ml的afb1抗体用pbs稀释至16.5μg/ml，所得的溶液存储于-20℃冰箱中；（5）将质量分数为0.7%的bsa溶液滴加在传感器表面于37℃孵育40min以封闭特异性识别位点。具体地，准确称取0.7gbsa固体溶于100mlpbst中，所得的溶液储存于-20℃冰箱中，如图2所示。
[0033]
实施例2本实施例快速检测花生中afb1电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：（1）zn/ni-zif-8
–
800的制备：通过简单的溶剂热法，把ni(no3)2·
6h2o、zn (no3)2·
6h2o、hmelm以1：1：18的比例溶于甲醇，并在20℃下连续搅拌25h，离心后取沉淀，用甲醇清洗后真空干燥14h；最后，在管式炉中700℃高温煅烧2h得到黑色粉末zn/ni-zif-8
–
800；（2）复合材料的制备：将步骤（1）制得的zn/ni-zif-8
–
800与石墨烯以1：1的比例混合后加入5ml 0.25%的壳聚糖溶液中，超声分散至均匀，得到zn/ni-zif-8
–
800@graphene；（3）金纳米颗粒沉积：将滴涂复合材料的gce电极表面插入0.9%氯金酸中含有0.5m硫酸的溶液中，在-0.2v的电位下沉积500s，此时工作电极表面被沉上一层金纳米颗粒（aunps）；（4）传感器表面用双蒸水冲洗后，调节ph至9后，滴加浓度为66μg/ml的afb1的抗体在37℃孵育60min；具体地，将66μg/ml的afb1抗体用pbs稀释至4.125μg/ml，所得的溶液存
储于-20℃冰箱中；（5）将质量分数为0.5%的bsa溶液滴加在传感器表面于37℃孵育20min以封闭特异性识别位点；具体地，准确称取0.5gbsa固体溶于100mlpbst中，所得的溶液储存于-20℃冰箱中。
[0034]
实施例3本实施例快速检测花生中afb1电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：（1）zn/ni-zif-8
–
800的制备：通过简单的溶剂热法，把ni(no3)2·
6h2o、zn(no3)2·
6h2o、hmelm以1：1：20的比例溶于甲醇，并在30℃下连续搅拌20h，离心后取沉淀，用甲醇清洗后真空干燥15h；最后，在管式炉中900℃高温煅烧1h得到黑色粉末zn/ni-zif-8
–
800；（2）复合材料的制备：将步骤（1）制得的zn/ni-zif-8
–
800与石墨烯以1:3的比例混合后加入5ml 1%的壳聚糖溶液中，超声分散至均匀，得到zn/ni-zif-8
–
800@ graphene；（3）金纳米颗粒沉积：将滴涂复合材料的gce电极表面插入1%氯金酸中含有0.5m硫酸的溶液中，在-0.2v的电位下沉积100s，此时工作电极表面被沉上一层金纳米颗粒（aunps）；（4）传感器表面用双蒸水冲洗后，调节ph至5后，滴加浓度为66μg/ml的afb1的抗体在37℃孵育10min；具体地，将66μg/ml的afb1抗体用pbs稀释至16.5μg/ml。所得的溶液存储于-20℃冰箱中；（5）将质量分数为1%的bsa溶液滴加在传感器表面于37℃孵育40min以封闭特异性识别位点；具体地，准确称取1gbsa固体溶于100mlpbst中，所得的溶液储存于-20℃冰箱中。
[0035]
对比例以英文文献中的电化学免疫传感器作为对比例，其制备步骤如下所示：（1）zn/ni-zif-8
–
800的制备：将2.910gni(no3)2·
6h2o、2.978gzn(no3)2·
6h2o和3.296g hmelm溶于80ml甲醇中，并在25℃下连续搅拌24h，离心后取沉淀，用甲醇清洗后60℃干燥12h；最后，在管式炉中800℃高温煅烧1h得到黑色粉末zn/ni-zif-8-800；（2）复合材料的制备：将步骤（1）制得的5mg zn/ni-zif-8
–
800与10mg石墨烯混合到5ml 0.5%的壳聚糖溶液中，超声分散1h，得到复合材料zn/ni-zif-8-800@graphene；（3）金纳米颗粒沉积：将5μlzn/ni-zif-8-800@graphene复合材料的悬浮液滴在预处理的gce电极上，室温干燥4h，然后将zn/ni-zif-8-800@graphene/gce插入5ml 1%氯金酸溶液中，在-0.2v的电位下沉积15s，用蒸馏水清洗，得到aunps/zn/ni-zif-8-800@graphene/gce。
[0036]
图3与图4分别为实施例1与对比例复合材料的扫描电镜表征结果图，如图3a所示，zn/ni-zif-8为单分散晶体状态。图3b为zn/ni-zif-8煅烧后的形貌，可以看出已经发生明显的收缩变形。从图3c可以看到，购买石墨烯符合实验要求，呈典型褶皱层状结构。图3d为复合物形貌图，可以清晰的观察到zn/ni-zif-8-800附着在石墨烯表面。由图3e可知，zn/ni-zif-8-800@graphene复合材料所选区域的主要元素包括c、o、zn、ni，初步证明复合材料的成功合成。图4中，(a)zn/ni-zif-8、(b)zn/ni-zif-8-800、(c)石墨烯、(d)zn/ni-zif-8-800@石墨烯混合材料的sem图像、(e)壳聚糖溶液中zn/ni-zif-8-800、(f)aunps/zn/ni-zif-8-800@石墨烯复合材料的sem-eds图像。由图3、图4对比可知，实施例与对比例在微米级微观结构上无明显差别。
[0037]
图5为实施例1傅立叶红外光谱表征结果图，a为二甲基咪唑，b为zn/ni-zif-8，对于二甲基咪唑，2671cm-1
、1441cm ‑1、1112cm-1
和757cm-1
处的吸收峰可分别归因于-nh拉伸、咪唑环拉伸、-ch弯曲和-ch扭转振动。zn/ni-zif-8在1441cm-1
处和757cm-1
处的峰向较低的波长1382cm-1
和755cm-1
移动，而1112cm-1
处的峰向较长的波长1145cm-1
移动，这是有机配体与金属离子的配位导致的。
[0038]
图6为实施例1 x射线光电子能谱表征结果图，如左图所示，zn/ni-zif-8-800复合材料由元素c、n、zn、ni组成。在右图a中，在284.7ev和286ev处的峰可归因于zn/ni-zif-8-800中有机物的碳化，其中284.7ev处为c-c键，286ev处为c-o键。右图b中398.4ev和400ev处观察到的两个强峰属于吡咯-氮。右图c中854.7ev和872.2ev出现的峰可归因于ni 2p自旋轨道分裂为ni 2p
3/2
和ni 2p
1/2
所致。右图d中1021.8ev和1044.8ev出现的峰属于zn 2p自旋轨道分裂为zn 2p
3/2
和zn 2p
1/2
所致。图6表明zn/ni-zif-8-800的成功合成。
[0039]
图7为x射线衍射光谱表征结果图，左图为实施例1 xrd图谱，右图为对比例xrd图谱。左图中可知zn/ni-zif-8在7.2
°
、10.3
°
、12.7
°
、14.6
°
、16.4
°
、18.0
°
、22.0
°
、24.4
°
、29.7
°
处的主峰，分别对应衍射峰（011）、（002）、（112）、（022）、（013）、（222）、（114）、（233）、（004），主要强峰与zif-8标准模拟卡片一致。另外，zn/ni-zif-8衍射峰（002）、（112）的峰强度相对zif-8明显增强，而（013）相对减弱，这可归因于材料中部分zn元素被ni元素取代。右图中10.4
°
、12.7
°
、14.7
°
、16.3
°
和18.1
°
处发现了几个特征衍射峰，制备的zn/ni-zif-8的xrd图与模拟图基本一致。从左右两图相关特征衍射峰对比可知，实施例1与对比例衍射峰强度及衍射角度等稍有不同，特别是30
°‑
40
°
时与模拟图更接近，表明实验例1的晶体结构更接近理论设计的晶体结构，传感器复合材料纯度更高。
[0040]
图8为实施例1与对比例复合材料电化学表征结果的电流信号对比图，电化学测试在含有1m kcl的5.0 mmk3fe(cn)6/k4fe(cn)6溶液中进行。从图中可以看到：实施例制备的复合材料的电流信号显著强于对比例的电流信号。
[0041]
图9为实施例1与对比例金纳米颗粒沉积后电化学表征结果的电流信号对比图，从图9中可以看到：与对比例相比，稀硫酸对0.1%的氯金酸起到了活化的作用，稀硫酸溶解了纳米金表面氧化层，从而达到活化金属表面的作用，能明显增强沉积金后传感器的电流信号。
[0042]
应用例快速检测花生中黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器在快速检测花生中黄曲霉毒素b1中的应用，步骤如下：1）标准曲线绘制：检测本发明的电化学免疫传感器在不同浓度afb1中的电化学信号，绘制峰电流改变值与afb1浓度的标准曲线，具体检测步骤如下：将0.01-100ng/ml范围内的afb1滴涂至快速检测花生中黄曲霉毒素b1电化学免疫传感器界面上孵育，之后在含1m氯化钾的5mm铁氰化钾及5mm亚铁氰化钾（体积比为1：1）的混合检测液中进行dpv测试，由于afb1抗体存在于传感器表面，当afb1孵育时，两者发生特异性结合。在dpv测试中，afb1分子在检测液中发生还原反应，产生还原峰，随着afb1浓度的改变，还原峰电流值液随之改变，根据此时电流峰值（图10a）和afb1浓度建立标准曲线，得到线性回归方程δi=21.695 lgc
afb1
86.959（r2=0.998），如图10b所示，其检测限为0.18ng/
ml。当afb1浓度超过100ng/ml时，由于抗原抗体反应的饱和行为，传感器开始失去灵敏度。
[0043]
2）重复性以及加标回收率测试：在dpv检测中，每种样品测量五次，以五个读数的平均值作为最终记录。对样品测得的数据如表1所示：加标回收率在80.26%-109.60%范围内，5次重复测定的rsd＜11%。验证了本发明所设计的传感器具有检测限低、灵敏度高、测量范围广等优点，可实现对花生中afb1的检测以及应用。
[0044]
表1 afb1的检测结果及回收率3）根据建立的标准曲线计算待测样品中afb1的浓度花生由本实验室提供。根据以往参考文献对样品进行处理。具体的：取5g花生研磨后放于烧杯中，加入20ml石油醚分次将式样转移至125ml分液漏斗中，加入25ml甲醇水（1：1），加塞振摇5min，静置分层，放出下层甲醇水提取液（样品提取液），用pbs稀释备用。
[0045]
将预处理后的待测样品滴涂至修饰好的电极表面，afb1分子被捕获，由于afb1分子存在于传感器界面，在dpv检测中产生还原电流，基于建立的电流值和浓度的标准曲线，通过峰电流值计算出待测样品中afb1的浓度。
[0046]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。