一种偶联随机长片段核酸序列的磁珠制备工艺的制作方法

buffer 400μl和t4 dna ligase 100μl，终体积为1.4ml的混合体系；用8道移液器将其分装在上述盛有p2 r2双链结构的孔板中，每个孔中加入14μl，混匀，在25℃垂直悬摇1h；反应结束后置于pcr仪上65℃处理10min使酶变性失活，收集全体磁珠于离心管中加入纯水轻柔吹吸混匀磁珠，将磁珠置于磁力架上，静置20s，弃上清，重复两次；加入适量的纯水，得到第三步连接反应使用的磁珠混合物；
9.(5)第三步连接反应：将多条第三段双链oligo(p3 r3)分装在的孔板中，每种加入3μl，每孔对应一种p3 r3双链结构；向步骤(4)中得到的磁珠混合物中加入5
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t4 dna ligase buffer 400μl和t4 dnaligase 100μl，终体积为1.4ml的混合体系；用8道移液器将其分装在上述盛p3 r3双链结构的孔板中，每个孔中加入14μl，混匀，在25℃垂直悬摇1h；反应结束后置于pcr仪上65℃处理10min使酶变性失活，收集全体磁珠于离心管中；
10.(6)解链：向步骤(5)中收集的磁珠加入2ml 150mm naoh 0.5％brij 35p轻柔吹吸混匀磁珠，将磁珠置于磁力架上，静置20s，弃上清；将磁珠从磁力架上取下后加入2ml 100mm naoh 0.5％brij 35p轻柔吹吸混匀磁珠，将磁珠置于磁力架上，静置20s，弃上清，重复一次；将磁珠从磁力架上取下，加入2ml的纯水，轻柔吹吸混匀磁珠，将磁珠置于磁力架上，静置20s，弃上清，重复两次加入1ml的0.1
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te，获得具有分子随机长片段核酸序列的磁珠。
11.优选的，所述第一段oligo(p1)、第二段oligo(p2)和第三段oligo(p3)对应的序列分别为：第一段oligo(p1)：ctacacgacgctcttccgat ctb1～b1l1～l1，其中b1，l1为a、t、c、g任一碱基，“～”为4-16个任意序列；第二段oligo(p2)：b2～b2l2～l2，其中b2，l2为a、t、c、g任一碱基，“～”为4-16个任意序列；第三段oligo(p3)：b3～b3n～n【ttt】，其中b3，n均为a、t、c、g任一碱基，且“～”为4-16个任意序列，【ttt】为10-30个t；第一段辅助序列(r1)、第二段辅助序列(r2)和第三段辅助序列(r3)分别为：第一段辅助序列(r1)：部分前段序列和b1～b1的互补序列；第二段辅助序列(r2)：l1～l1b2～b2的互补序列；第三段辅助序列(r3)：l2～l2b3～b3的互补序列；且上述序列中p1、p2、p3三段中的b1～b1、b2～b2、b3～b3为不同序列。
12.优选的，所述步骤(2)中退火互补成双链的方法为在pcr仪中进行反应，反应程序为95℃5min，0.05℃/s降至20℃，20℃1min；或shaker:95℃5min，55℃2h进行连接。
13.本发明的技术效果和优点：本发明操作简单，生成成本低，制备成功率高且有很好的单细胞测序结果的稳定性和精确性。
附图说明
14.图1为本发明的工艺流程示意图。
具体实施方式
15.为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.实施例
17.如图1所示，一种偶联随机长片段核酸序列的磁珠制备工艺，具体包括以下步骤：
18.(1)oligo溶解：取oligo置于离心机中，12000rpm离心2min使oligo沉降到底部，加入适量的纯水溶解至终浓度为50μm；室温静置10min，将上述溶解的oligo漩涡震荡20s，掌上离心机顺时针离心使oligo沉降在底部，形成第一段oligo(p1)、第二段oligo(p2)和第三段oligo(p3)对应的试剂，置于4℃保存备用，如使用频率不高，可置于-20℃保存备用；
19.(2)将第一段oligo(p1)、第二段oligo(p2)和第三段oligo(p3)与其互补的序列第一段辅助序列(r1)、第二段辅助序列(r2)和第三段辅助序列(r3)分别在pcr仪中进行反应，反应程序为95℃5min，0.05℃/s降至20℃，20℃1min；或shaker:95℃5min，55℃2h进行连接，形成第一段双链oligo(p1 r1)、第二段双链oligo(p2 r2)和第三段双链oligo(p3 r3)放4度或-20度保存待用；其中所述第一段oligo(p1)、第二段oligo(p2)和第三段oligo(p3)对应的序列分别为：第一段oligo(p1)：ctacacgacgctcttccgat ctb1～b1l1～l1，其中b1，l1为a、t、c、g任一碱基，“～”为4-16个任意序列；第二段oligo(p2)：b2～b2l2～l2，其中b2，l2为a、t、c、g任一碱基，“～”为4-16个任意序列；第三段oligo(p3)：b3～b3n～n【ttt】，其中b3，n均为a、t、c、g任一碱基，且“～”为4-16个任意序列，【ttt】为10-30个t；第一段辅助序列(r1)、第二段辅助序列(r2)和第三段辅助序列(r3)分别为：第一段辅助序列(r1)：部分前段序列和b1～b1的互补序列；第二段辅助序列(r2)：l1～l1b2～b2的互补序列；第三段辅助序列(r3)：l2～l2b3～b3的互补序列；且上述序列中p1、p2、p3三段中的b1～b1、b2～b2、b3～b3为不同序列；
20.(3)第一步连接反应：将96条第一段双链oligo(p1 r1)分装在分装在的96孔板上，每种加入5μl，每孔对应一种p1 r1双链结构，每种p1 r1双链结构中的b1对应的碱基存在不同；取1ml羧基磁珠于5ml离心管中，用ph 5.0的100mm mes缓冲液清洗3遍后加入100mm的mes缓冲液至终体积为1.25ml，加入1.25ml100mg/ml的edc，混匀，用8道移液器将其分装在上述装有p1 r1双链结构的96孔板中；贴上封口膜密封，离心机中顺时针离心10s，将孔板固定在25℃垂直悬摇2h；结束后，将96孔板中磁珠收集于5ml的离心管中；加入2ml的纯水轻柔吹吸混匀磁珠，将磁珠置于磁力架上，静置20s，弃上清，重复两次；加入0.9ml的纯水，得到第二步连接反应使用磁珠混合物；
21.(4)第二步连接反应：将96条第二段双链oligo(p2 r2)分装在的96孔板，每种加入3μl，每孔对应一种p2 r2双链结构，每种p2 r2双链结构中的b2对应的碱基存在不同；向步骤(3)中得到的磁珠混合物中加入5
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t4 dna ligase buffer 400μl和t4 dna ligase 100μl，终体积为1.4ml的混合体系；用8道移液器将其分装在上述盛有p2 r2双链结构的96孔板中，每个孔中加入14μl，混匀，在25℃垂直悬摇1h；反应结束后置于pcr仪上65℃处理10min使酶变性失活，收集全体磁珠于5-10ml的离心管中加入2ml的纯水轻柔吹吸混匀磁珠，将磁珠置于磁力架上，静置20s，弃上清，重复两次；加入0.9ml的纯水，得到第三步连接反应使用的磁珠混合物；
22.(5)第三步连接反应：将96条第三段双链oligo(p3 r3)分装在的96孔板中，每种加入3μl，每孔对应一种p3 r3双链结构，每种p3 r3双链结构中的b3、n对应的碱基存在不同；向步骤(4)中得到的磁珠混合物中加入5
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t4 dna ligase buffer 400μl和t4dnaligase 100μl，终体积为1.4ml的混合体系；用8道移液器将其分装在上述盛p3 r3双链结构的96孔
板中，每个孔中加入14μl，混匀，在25℃垂直悬摇1h；反应结束后置于pcr仪上65℃处理10min使酶变性失活，收集全体磁珠于5-10ml的离心管中；
23.(6)解链：向步骤(5)中收集的磁珠加入2ml 150mm naoh 0.5％brij 35p轻柔吹吸混匀磁珠，将磁珠置于磁力架上，静置20s，弃上清；将磁珠从磁力架上取下后加入2ml 100mm naoh 0.5％brij 35p轻柔吹吸混匀磁珠，将磁珠置于磁力架上，静置20s，弃上清，重复一次；将磁珠从磁力架上取下，加入2ml的纯水，轻柔吹吸混匀磁珠，将磁珠置于磁力架上，静置20s，弃上清，重复两次加入1ml的0.1
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te，即获得具有分子随机长片段核酸序列的磁珠，从而使磁珠上的dna标签总计可以有96*96*96共约88.5万种。
24.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。