富氢水组合物及其在缓解动物温度应激中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种富氢水组合物及其在缓解动物温度应激中的应用。


背景技术：

2.动物的温度应激包括热应激和冷应激，是有效环境温度高于上限临界温度或低于下限临界温度时，环境热力破坏机体热恒态，进而在生理、生化、养分调配、生产和行为诸方面产生相应变化的代偿过程。其中：
3.热应激是当动物受到超出其自我调节能力的过高温度刺激时发生的非特异性全身反应的总和。夏季炎热的天气经常导致动物处于热应激状态。热应激不仅会降低牲畜的生产性能，造成经济损失，还会危及牲畜的健康状况并引起多种疾病。研究表明，当暴露于热应激时，牲畜表现出食欲下降，精神低落，体温升高和呼吸急促。长期热应激会导致内分泌紊乱、消化功能下降、免疫力下降、广泛的炎症和其他病理过程。之前的研究表明，热应激下奶牛的产奶量比非热应激下的产奶量低20％。一些研究报告指出，热应激奶牛血液中肌酸、乳酸等代谢物的含量与非热应激奶牛的含量明显不同，表明热应激会导致奶牛代谢紊乱。最近的一项研究表明，热应激会改变猪小肠中蛋白质的表达水平，这些蛋白质与肠道完整性和功能有关，这表明热应激可能会损害肠道完整性。因此，寻找能够缓解热应激的药物对于保证畜禽的生产性能和健康具有重要意义。
4.冷应激是当动物受到过低温度刺激时产生的非特异性应激反应的总和。由于受到冬季的低温影响，冷应激成为畜禽养殖过程中不可忽视的问题之一。冷应激对畜禽养殖造成的影响主要包括两个方面：养殖户经济损失和畜禽健康水平下降。在经济方面，首先，冷应激会造成畜禽生产性能的下降；其次，冷应激会造成畜禽能量消耗增加，从而使畜禽主动增加采食量，饲料消耗增加，大部分的饲料并没有用来增加畜禽的发育速度，只是成为畜禽抗寒的能量来源，从而导致料重比提高，饲料转化率下降，增加了养殖成本。在畜禽健康方面，冷应激可以引起畜禽特别是畜禽幼仔的神经内分泌系统紊乱、免疫机能下降、抗氧化功能受损，引发畜禽的多种疾病，甚至导致畜禽的死亡。已经有研究表明，冷应激可以破坏雏鹌鹑法氏囊组织中氧化与抗氧化之间的平衡，并诱导细胞发生损伤,降低雏鹌鹑的免疫力。并且有研究发现，冷应激会降低牛pbmc和mdbk细胞的细胞活力，抑制细胞增殖。对断奶仔猪进行冷应激实验发现，低温刺激可以导致仔猪中hsp70/tlr4/nf-κb通路的激活，引发仔猪的先天性免疫反应和炎症反应，并且随着应激时间的延长，仔猪的免疫功能出现了明显的下降。冷应激可以对畜禽造成较大的危害，因此，寻找可以有效缓解畜禽冷应激的药物对于保证畜禽健康具有重要意义。
5.氢气(h2)是一种具有还原性的双原子气体分子，近年来，随着对氢气的研究深入，氢气已经被发现具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节自噬等作用。2007年，《自然医学》首次报道h2被用作抗氧化剂和自由基清除剂来治疗氧化应激。2015年，人们发现含量较高的富氢水可以显著抑制小鼠结肠癌的发展，2020年，人们发现h2可以显著提高成年非小细胞肺癌患
者的健康指数。除肿瘤的治疗作用外，近年来，氢气还被发现在预防和治疗帕金森综合征、痛风、以及一些代谢性疾病具有良好效果。并且当前流行的新冠肺炎方面，氢氧混合气已经被证明具有良好的治疗效果。氢气作为治疗性气体，于其他药物相比有着突出的优势。首先，氢气分子质量小，可以穿过脂质膜到达线粒体、细胞核等细胞器发挥生物学作用；其次，氢气具有较强的抗氧化作用，且不会影响机体正常的氧化还原状态；第三，氢气具有非常高的安全性，无论是在氢气的实验室实验还是临床应用过程中，目前尚且没有发现氢气具有负面影响。
6.但目前还很少见有氢气或者含有富氢的物质在缓解动物温度应激方面的相关报道。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种富氢水组合物及其在缓解动物温度应激中的应用。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明的第一方面，提供一种富氢水组合物，所述富氢水组合物中含有h
2 1.2-1.5ppm和γ-氨基丁酸0.5-1g/l。
10.优选的，所述富氢水组合物中含有h
2 1.4ppm和γ-氨基丁酸0.8g/l。
11.本发明的第二方面，提供上述富氢水组合物的制备方法，包括以下步骤：
12.以生理盐水作为溶剂，将γ-氨基丁酸溶于生理盐水中，得到γ-氨基丁酸溶液；然后向γ-氨基丁酸溶液中通入h2，并使h2充分溶解在γ-氨基丁酸溶液中。
13.本发明的第三方面，提供上述富氢水组合物在制备缓解动物温度应激的药物中的应用。
14.上述应用中，所述温度应激为热应激和/或冷应激。
15.上述应用中，所述富氢水组合物通过如下(1)-(2)至少一条途径来缓解动物温度应激：
16.(1)减轻高温或低温对细胞的损伤作用，缓解高温或低温造成的细胞活性降低；
17.(2)减少热刺激或冷刺激引起的热休克蛋白表达的增加。
18.本发明的有益效果：
19.h2在细胞中能够选择性减少强氧化剂而作为一种具有治疗和保护性的抗氧化剂，通过抵抗氧化应激而发挥细胞保护作用。
20.γ-氨基丁酸是一种重要的神经抑制性递质，广泛存在于动物体内，近年来研究发现γ-氨基丁酸在提高畜禽采食量及日增重、抗热应激方面有良好效果。
21.本发明研究发现，对于温度引起的动物应激反应，h2与γ-氨基丁酸配伍使用能够起到协同增效的作用，能够有效缓解由高温或低温引起的动物应激反应。
附图说明
22.图1：热应激细胞模型的建立；(a)高温处理细胞后，细胞活力的变化；(b)用蛋白免疫印迹检测细胞的hsp70的表达水平；(c)hsp70的蛋白水平分析；(d)用蛋白免疫印迹检测细胞内hsp27的表达；(e)hsp27的蛋白水平分析；图中的“hs”表示进行热处理的时间点；注：
数据均表示平均值(n＝3)，*p《0.05，**p《0.01,***p《0.001。
23.图2：富氢组合物对热处理诱导的细胞活力变化的影响。
24.图3：富氢组合物对热处理后细胞内热休克蛋白的影响。
25.图4：富氢组合物对热应激小鼠肝脏热休克蛋白表达的影响。
26.图5：富氢组合物对低温诱导的细胞活力变化的影响。
27.图6：富氢组合物对低温处理后细胞内热休克蛋白的影响。
具体实施方式
28.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
29.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
30.实施例1：富氢水组合物的制备
31.以生理盐水作为溶剂，将γ-氨基丁酸溶于生理盐水中，得到γ-氨基丁酸溶液；然后将γ-氨基丁酸溶液转移至不锈钢反应釜中，向γ-氨基丁酸溶液中通入h2，充分搅拌使h2充分溶解在γ-氨基丁酸溶液中，制备得到富氢水组合物。所制备的富氢水组合物中含有h21.4ppm和γ-氨基丁酸0.8g/l。
32.实施例2：富氢水组合物在缓解高温引起的热应激反应中的应用
33.1、材料和方法
34.(1)试验材料
35.dmem培养基购自赛维尔生物公司。胎牛血清购自上海逍鹏生物科技有限公司。cck-8试剂盒购自新赛美生物公司。bca分析试剂盒购自康维生物公司。hsp70、tubulin抗体从proteintech购买，hsp27从affinity购买。
36.(2)细胞培养
37.将mac-t细胞(牛乳腺上皮细胞系)在补充有10％血清的dmem中培养，将细胞培养至80％汇合用于进一步的实验。
38.(3)热应激模型的建立
39.为了探索处理mac-t细胞热处理的最合适时间点，将细胞暴露在42.5℃下1小时，并在37℃下恢复不同时间(3h、6h、9h、12h)，检测细胞活力和细胞中热休克蛋白的表达。
40.为了研究富氢水组合物在热应激中的作用，将mac-t细胞随机分为以下处理：
41.处理1：将mac-t细胞接种在dmem培养基(将dmem干粉培养基用生理盐水溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml生理盐水溶解，并添加nahco3，每1l dmem培养基中添加3.7g nahco3)中，在37℃条件下进行培养。
42.处理2：将mac-t细胞接种在富氢培养基(将dmem干粉培养基用实施例1制备的富氢水组合物溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml富氢水组合物溶解，并添加nahco3，每1l富氢培养基中添加3.7g nahco3)中，在37℃条件下进行培养。
43.处理3：将mac-t细胞接种在dmem培养基(将dmem干粉培养基用蒸馏水溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml蒸馏水溶解，并添加nahco3，每1l dmem培养基中添加3.7g nahco3)中，先在42.5℃条件下培养1h，再在37℃条件下培养6h。
44.处理4：将mac-t细胞接种在富氢培养基(将dmem干粉培养基用实施例1制备的富氢水组合物溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml富氢水组合物溶解，并添加nahco3，每1l富氢培养基中添加3.7g nahco3)中，先在42.5℃条件下培养1h，再在37℃条件下培养6h。
45.处理5：将mac-t细胞接种在培养基a(将dmem干粉培养基用含有h
2 1.4ppm的生理盐水溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml含有h
2 1.4ppm的生理盐水溶解，并添加nahco3，每1l培养基a中添加3.7g nahco3)中，先在42.5℃条件下培养1h，再在37℃条件下培养6h。
46.处理6：将mac-t细胞接种在培养基b(将dmem干粉培养基用含有γ-氨基丁酸0.8g/l的生理盐水溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml含有γ-氨基丁酸0.8g/l的生理盐水溶解，并添加nahco3，每1l培养基b中添加3.7g nahco3)中，先在42.5℃条件下培养1h，再在37℃条件下培养6h。
47.处理结束后，收集细胞进行分析，测定细胞活力和热休克蛋白(hsp27和hsp70)的表达量。
48.(4)小鼠模型建立和样品收集
49.将雄性昆明小鼠(8周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)随机分为5组(每组10只)，分别为：
50.处理a：将雄性昆明小鼠在的标准环境(恒温25℃，湿度50％，12h光照，12h黑暗)中喂养，无需任何处理。
51.处理b：将雄性昆明小鼠在的标准环境(恒温25℃，湿度50％，12h光照，12h黑暗)中，饮用实施例1的富氢水组合物。
52.处理c：将雄性昆明小鼠每天中午在42℃下处理一小时，其余时间在标准环境(恒温25℃，湿度50％，12h光照，12h黑暗)中恢复，连续热处理七天。
53.处理d：将雄性昆明小鼠每天中午在42℃下处理一小时，其余时间在饮用实施例1的富氢水组合物的条件下，在标准环境(恒温25℃，湿度50％，12h光照，12h黑暗)中恢复，连续热处理七天。
54.试验小鼠每天早中晚三次集中充分饮水，每次饮水时间为40分钟。第7天结束时，处死小鼠，收集血清和肝脏组织并储存在-80℃直至使用。
55.(5)细胞活力测定
56.使用cck-8法测量细胞的活力。将细胞与10％cck-8孵育2小时，用酶标仪测量450nm处的od。
57.(6)蛋白质印迹分析
58.将各处理组的细胞，用pbs洗涤三次，然后用ripa裂解液在4℃下裂解细胞10分钟。然后在4℃环境，以12，000
×
g离心10分钟来分离细胞裂解物。通过bca测定试剂盒测定样品的蛋白质浓度。将等量的蛋白质样品在5
×
sds-page上样缓冲液中稀释并煮沸15分钟。将等效蛋白在12％sds-page凝胶中电泳并转移到0.45μm pvdf膜上。在室温下用5％脱脂牛奶封闭2小时，并与稀释的一抗hsp27、hsp70和tubulin在4℃下孵育过夜。之后，用tbst洗涤膜三次10分钟。并将膜与适当的二抗在室温下孵育1小时。使用ecl蛋白质检测仪测量每种目标
dmem干粉培养基用50ml生理盐水溶解，并添加nahco3，每1l dmem培养基中添加3.7g nahco3)中，在37℃条件下进行培养。
79.处理2：将pk-15细胞接种在富氢培养基(将dmem干粉培养基用实施例1制备的富氢水组合物溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml富氢水组合物溶解，并添加nahco3，每1l富氢培养基中添加3.7g nahco3)中，在37℃条件下进行培养。
80.处理3：将pk-15细胞接种在dmem培养基(将dmem干粉培养基用蒸馏水溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml蒸馏水溶解，并添加nahco3，每1l dmem培养基中添加3.7g nahco3)中，先在30℃条件下培养1h，再在37℃条件下培养6h。
81.处理4：将pk-15细胞接种在富氢培养基(将dmem干粉培养基用实施例1制备的富氢水组合物溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml富氢水组合物溶解，并添加nahco3，每1l富氢培养基中添加3.7g nahco3)中，先在30℃条件下培养1h，再在37℃条件下培养6h。
82.处理5：将pk-15细胞接种在培养基a(将dmem干粉培养基用含有h
2 1.4ppm的生理盐水溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml含有h
2 1.4ppm的生理盐水溶解，并添加nahco3，每1l培养基a中添加3.7g nahco3)中，先在30℃条件下培养1h，再在37℃条件下培养6h。
83.处理6：将pk-15细胞接种在培养基b(将dmem干粉培养基用含有γ-氨基丁酸0.8g/l的生理盐水溶解，每1g dmem干粉培养基用50ml含有γ-氨基丁酸0.8g/l的生理盐水溶解，并添加nahco3，每1l培养基b中添加3.7g nahco3)中，先在30℃条件下培养1h，再在37℃条件下培养6h。
84.处理结束后，收集细胞进行分析，测定细胞活力和热休克蛋白(hsp27和hsp70)的表达量。测定方法和数据处理同实施例2。
85.2、试验结果
86.(1)富氢水组合物缓解低温处理引起的细胞活力下降
87.将pk-15细胞在30℃下处理1小时，并在37℃的富氢培养基中培养6小时。然后用cck-8方法测量细胞活力的变化。如图5所示，低温处理后，细胞活力明显下降，富氢水组合物可有效缓解低温引起的细胞活力下降；与单独使用氢气(处理5)和单独使用γ-氨基丁酸(处理6)相比，富氢水组合物(处理4)在缓解低温处理引起的细胞活力降低方面具有显著的协同增效作用。
88.(2)富氢水组合物缓解低温处理引起的热休克蛋白的激活
89.热休克蛋白的产生是细胞在应激期间普遍发生的反应。如图6所示，低温处理后，细胞产生了应激反应，hsp27和hsp70的蛋白表达与对照组相比显著增强，富氢水组合物处理可显著降低hsp27和hsp70的表达水平。这表明富氢水组合物减轻了pk-15细胞的冷应激反应。
90.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。