脂肪膜相关蛋白及其相关编码基因和片段的新用途

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及脂肪膜相关蛋白及其相关编码基因和片段的新用途。


背景技术：

2.哈明(harmine，har)、哈马灵(harmaline，hal)和哈尔满(harmane，ham)是一类简单β-咔啉生物碱，具有相似的药理作用。体外实验表明，他们具有抗ache和bche活性以及抗单胺氧化酶活性。而且，动物的体内实验也进一步证明其具有改善学习记忆水平的药理作用。因此har、hal和ham被认为是潜在的ad治疗药物。前期研究通过检测不同发育水平的大鼠和人血浆，发现har等β-咔啉生物碱是广泛存在于动物体内的小分子化合物。但是，人们并不知晓，har是否可以内源性合成，以及体内合成β-咔啉生物碱的是何种蛋白及其医药用途。


技术实现要素：

3.基于此，本发明提供了一种脂肪膜相关蛋白apmap-x1或其片段在制备用于预防和/或治疗老年痴呆症的药品、食品和/或保健品中的用途，该脂肪膜相关蛋白apmap-x1的氨基酸序列为seq id no：1所示的氨基酸序列，可选地为取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的seq id no：1所示的氨基酸序列，可选地为与seq id no：1所示的氨基酸序列同一性程度为至少大约为95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；该脂肪膜相关蛋白apmap-x1的片段的氨基酸序列为seq id no：2所示，可选地为取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的seq id no：2所示的氨基酸序列，可选地为与seq id no：2所示的氨基酸序列同一性程度为至少大约为95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
4.其中seq id no：1如下所示：
5.mseadglrqrrplrpqvitddgqvpevkegssfsgrvfrmtflmlavslaipllgammllespidpqsfsfkeppfmfgvlqpntklrqaerlfenqlngpesivnigdvlftgtadgrvvklengeietiarfgsgpcktrddeptcgrplgirvgpngtlfvvdaykglfevnpqkrsvklllssetpiegkkmsfvndltitrdgrkiyftdssskwqrrdylllvmegtddgrlleydtvtkevkvlldqlqfpngvqlspeedfvlvaetamarirrvyvsglmkggadmfvenmpgfpdnirpsssggywvaaatiranpgfsmldflsdkpfikrmifklfsqetvmkfvpryslvlevsdsgafrrslhdpdgqvvtyvseahehdgylylgsfrspficrlslqsi。
6.其中seq id no：2如下所示：
7.lespidpqsfsfkeppfmfgvlqpntklrqaerlfenqlngpesivnigdvlftgtadgrvvklengeietiarfgsgpcktrddeptcgrplgirvgpngtlfvvdaykglfevnpqkrsvklllssetpiegkkmsfvndltitrdgrkiyftdssskwqrrdylllvmegtddgrlleydtvtkevkvlldqlqfpngvqlspeedfvlvaetamarirrvyvsglmkggadmfvenmpgfpdnirpsssggywvaaatiranpgfsmldflsdkpfikrmifklfsqetvmkfvpryslvlevsdsgafrrslhdpdgqvvtyvseahehdgylylgsfrspficrlslqsi。
8.根据本发明的另一个方面，提供了一种脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因或其
片段的编码基因在制备用于预防和/或治疗老年痴呆症的药品、食品和/或保健品中的用途，该脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因的核苷酸序列为seq id no：3所示的核苷酸序列，可选地为与seq id no：3所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列，可选地在严格条件下与seq id no：3所示的核苷酸杂交的核苷酸序列；该脂肪膜相关蛋白apmap-x1的片段的编码基因的核苷酸序列为seq id no：4或seq id no：5所示的核苷酸序列，可选地为与seq id no：4或seq id no：5所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列，可选地在严格条件下与seq id no：4或seq id no：5所示的核苷酸杂交的核苷酸序列。
9.其中seq id no：3如下所示：
10.atgagcgaggcagacgggctgaggcagcgccggccactgcggccgcaggtcatcacggacgatggccaggtcccggaggtcaaggagggcagttcctttagtggcagagttttcagaatgaccttcttgatgctggctgtgtcccttgccattcccctgcttggagccatgatgctgttggagtcccccatagatcctcagagtttcagcttcaaagaaccccctttcatgtttggtgttctgcaaccaaatacgaagttgcgacaagcagaaaggctatttgaaaaccaacttaacggaccagaatccatagtaaatattggggatgtgctgtttactggcacagccgatggccgagttgtaaaactggagaatggagaaatagagaccatcgcccggtttggttcgggcccttgcaaaacccgagatgatgaacctacctgtgggagacccctgggcatccgggtaggacccaacgggactctttttgtggttgatgcatacaagggactgttcgaagtgaatcctcagaaacgttcagtgaaactgctgctatcctctgagactcccattgagggcaagaaaatgtcctttgtgaatgatctcactattactcgggatgggagaaagatttatttcacggattctagcagcaagtggcagagacgagactacctgcttctggtgatggagggcactgatgatgggcgcttgttggagtatgataccgtgacaaaagaagtgaaggttttgttggaccagttgcagttccctaatggagttcagctgtctcctgaggaagactttgtcctggtggcagagacagctatggccaggatacgaagagtctatgtgtctggcctgatgaaaggaggggcagacatgtttgtggagaacatgcctggatttcctgacaatatccggcccagcagctctggcgggtactgggttgctgctgcaaccattcgtgctaaccctgggttttccatgttggatttcttatctgacaagccttttatcaagagaatgatttttaagctgttcagtcaggagacagtgatgaagtttgtaccacgatatagcctggtcctggaagtcagtgacagtggtgccttccggagaagcctgcatgatcctgatggacaggtggtcacctatgtgagtgaggcacatgaacacgatggatacctgtacctgggctccttcagatctcccttcatctgcagactcagcctccagtcaatttag。
11.其中seq id no：4如下所示：
12.ttggagtcccccatagatcctcagagtttcagcttcaaagaaccccctttcatgtttggtgttctgcaaccaaatacgaagttgcgacaagcagaaaggctatttgaaaaccaacttaacggaccagaatccatagtaaatattggggatgtgctgtttactggcacagccgatggccgagttgtaaaactggagaatggagaaatagagaccatcgcccggtttggttcgggcccttgcaaaacccgagatgatgaacctacctgtgggagacccctgggcatccgggtaggacccaacgggactctttttgtggttgatgcatacaagggactgttcgaagtgaatcctcagaaacgttcagtgaaactgctgctatcctctgagactcccattgagggcaagaaaatgtcctttgtgaatgatctcactattactcgggatgggagaaagatttatttcacggattctagcagcaagtggcagagacgagactacctgcttctggtgatggagggcactgatgatgggcgcttgttggagtatgataccgtgacaaaagaagtgaaggttttgttggaccagttgcagttccctaatggagttcagctgtctcctgaggaagactttgtcctggtggcagagacagctatggccaggatacgaagagtctatgtgtctggcctgatgaaaggaggggcagacatgtttgtggagaacatgcctggatttcctgacaatatccggcccagcagctctggcgggtactgggttgctgctgcaaccattcgtgctaaccctgggttttccatgttggatttcttatctgacaagccttttatcaagagaatgatttttaagctgttcagtcaggagacagtgatgaagtttgtaccacgatata
gcctggtcctggaagtcagtgacagtggtgccttccggagaagcctgcatgatcctgatggacaggtggtcacctatgtgagtgaggcacatgaacacgatggatacctgtacctgggctccttcagatctcccttcatctgcagactcagcctccagtcaatttag。
13.其中seq id no：5如下所示：
14.ctggagagcccgattgatccgcaaagcttcagctttaaggaaccgccgttcatgtttggcgttctgcaaccgaacaccaaactgcgtcaggcggagcgtctgttcgaaaaccagctgaacggtccggaaagcatcgtgaacattggcgacgttctgtttaccggtaccgcggatggccgtgtggttaagctggagaacggcgagatcgaaaccattgcgcgttttggtagcggcccgtgcaaaacccgtgacgatgagccgacctgcggtcgtccgctgggtatccgtgtgggtccgaacggtaccctgttcgtggttgacgcgtacaagggcctgtttgaggtgaacccgcaaaagcgtagcgttaaactgctgctgagcagcgagaccccgattgaaggtaagaaaatgagcttcgttaacgacctgaccatcacccgtgatggccgtaagatttactttaccgacagcagcagcaaatggcaacgtcgtgattatctgctgctggtgatggaaggtaccgacgatggccgtctgctggagtatgacaccgttaccaaggaagtgaaagttctgctggatcagctgcaattcccgaacggtgtgcagctgagcccggaggaagactttgtgctggttgcggagaccgcgatggcgcgtatccgtcgtgtgtacgttagcggtctgatgaaaggtggcgcggacatgttcgtggaaaacatgccgggctttccggataacatccgtccgagcagcagcggtggttactgggtggcggcggcgaccattcgtgcgaacccgggtttcagcatgctggactttctgagcgataagccgttcatcaaacgtatgattttcaagctgtttagccaggagaccgtgatgaaattcgttccgcgttacagcctggtgctggaagttagcgacagcggtgcgtttcgtcgtagcctgcacgacccggatggccaagtggttacctatgttagcgaggcgcacgaacacgatggttacctgtatctgggcagcttccgtagcccgtttatctgccgtctgagcctgcagagcatttaa。
15.根据本发明的另一个方面，提供了一种包含上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因或上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1的片段的编码基因的质粒在制备用于预防和/或治疗老年痴呆症的药品、食品和/或保健品中的用途。
16.进一步地，该质粒通过以下方法获得：
17.(1)将seq id no：3或seq id no：4或seq id no：5所示的核苷酸序列以seq id no：6和seq id no：7所示的引物，或者seq id no：8和seq id no：9所示的引物进行pcr扩增，获得目标碱基序列；
18.(2)采用限制性内切酶将质粒pet28a或质粒pgapzb线性化，得到线性化pet28a或线性化pgapzb；
19.(3)使用连接酶将该目标碱基序列和该线性化pet28a或该线性化pgapzb连接，得到插入seq id no：3或seq id no：4或seq id no：5所示的核苷酸序列的pet28a质粒或pgapzb质粒；
20.进一步地，该限制性内切酶为ecor1、xba1、nde1和/或xhol1。
21.进一步地，该连接酶为t4连接酶和/或infusion酶。
22.进一步地，该脂肪膜相关蛋白apmap-x1是合成内源性β-咔啉生物碱的蛋白酶。
23.进一步地，该老年痴呆症是与内源性β-咔啉生物碱含量降低相关的老年痴呆症。
24.进一步地，该β-咔啉生物碱选自以下的一种或多种：哈明(harmine，har)、哈马灵(harmaline，hal)和哈尔满(harmane，ham)。
25.进一步地，该β-咔啉生物碱是在哺乳动物组织内的β-咔啉生物碱。
26.进一步地，该哺乳动物为鼠、兔和/或人。
27.进一步地，该组织为脑组织和/或肝组织。
28.进一步地，该组织为脑微粒体和/或肝微粒体。
29.进一步地，该脂肪膜相关蛋白apmap-x1是催化皮克特－施彭格勒反应的蛋白酶。
30.进一步地，该皮克特－施彭格勒反应的底物1选自以下的一种或多种：以色胺(tryptamine，try)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-ht)和6-甲氧基色胺(6-methoxy-tryptamine，mot)。
31.进一步地，该皮克特－施彭格勒反应的底物2选自以下的一种或多种：开联番木鳖苷(secologanin,sec)、甲醛(formaldehyde，fa)和乙醛(acetaldehyde，aa)。
32.进一步地，参与合成该内源性β-咔啉生物碱的另一种蛋白酶为血红素过氧化物酶例如髓过氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)。
33.进一步地，在该脂肪膜相关蛋白apmap-x1和该髓过氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)的催化下，乙醛(acetaldehyde，aa)分别与以色胺(tryptamine，try)和6-甲氧基色胺(6-methoxy-tryptamine，mot)反应合成该内源性β-咔啉生物碱。
34.根据本发明的另一个方面，提供了一种上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1或其片段，用于预防或治疗受试者中的老年痴呆症。
35.根据本发明的另一个方面，提供了一种脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因或脂肪膜相关蛋白apmap-x1的片段的编码基因，用于预防或治疗受试者中的老年痴呆症。
36.根据本发明的另一个方面，提供了一种包含脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因或脂肪膜相关蛋白apmap-x1的片段的编码基因的质粒，用于预防或治疗受试者中的老年痴呆症。
37.根据本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗受试者中的老年痴呆症的方法，包括向该受试者施用有效量的上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1或其片段。
38.根据本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗受试者中的老年痴呆症的方法，包括向该受试者施用有效量的上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因或其片段的编码基因。
39.根据本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗受试者中的老年痴呆症的方法，包括向该受试者施用有效量的上述包含脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因或脂肪膜相关蛋白apmap-x1的片段的编码基因的质粒。
40.本发明的有益效果：
41.本发明的脂肪膜相关蛋白(apmap-x1)或其片段或包含它们的质粒可用于催化pictet-spengler反应，是哺乳动物和人体(脑组织)合成内源性β-咔啉生物碱(例如harmine)的关键蛋白酶，从而可用于治疗老年痴呆症。
附图说明
42.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
43.图1为apmap-x1跨膜区域预测图。
44.图2为dna和蛋白质电泳图。其中a：pet28a载体和目标基因的dna电泳图；b：诱导和未诱导菌体的蛋白质电泳图；c：菌体裂解后的上清和沉淀蛋白电泳图；d：包涵体复性中可溶性蛋白电泳图。
45.图3为大肠杆菌表达apmap-x1活性表征色谱图。其中a：异胡豆苷标准品，b：孵育产物，c：不含底物的阴性对照，d：不含apmap-x1的阴性对照；e：孵育产物的质谱裂解碎片；f：异胡豆苷标准品的质谱裂解碎片。
46.图4为dna和蛋白质电泳图。a：pgapzb载体和目标基因的dna电泳图；b：pgapzb和apmap-x1-pgapzb载体转化的菌体dna电泳图；c：诱导和未诱导菌体裂解液沉淀的蛋白电泳图；d：诱导和未诱导菌体裂解液上清的蛋白电泳图。
47.图5为毕赤酵母表达apmap-x1活性表征图。a：异胡豆苷标准品，b：孵育产物，c：不含底物的阴性对照，d：不含apmap-x1的阴性对照；e：孵育产物的质谱裂解碎片；f：异胡豆苷标准品的质谱裂解碎片。
48.图6为人和大鼠脑微粒体的western-blot表征图。
49.图7为脑微粒体催化p-s反应的活性表征色谱图。a：异胡豆苷和内标标准品的色谱图；b：底物与微粒体共孵育色谱图；c：阴性对照色谱图。
50.图8为血浆中har浓度随大鼠衰老的变化趋势图。
具体实施方式
51.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
52.除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何序列、物质或材料，但本文描述了优选的序列、物质或材料。
53.本发明包含多个方面、特征和实施方案，其中这样的多个方面、特征和实施方案可以以任意期望的方式组合和变型。本发明的这些和其它方面、特征和实施方案在参照本发明的其余部分包括如下详细描述时变得显而易见。
54.除非上下文清楚地指明，如本文所用，单词的单数形式包括复数，反之亦然。因此，“一”、“一个”和“该”通常包括相应术语的复数。例如，“一种脂肪膜相关蛋白apmap-x1”包括所述“脂肪膜相关蛋白apmap-x1”的复数。类似的，术语“例如”，特别是位于一系列术语前面时，仅表示示范性和解释性的，不应被视为是排除性的或综合性的。
55.用于本文时，“约”是指一个特定值的
±
1％范围的值。例如，“约95”包括95的
±
1％，或从94.05到95.95，包含94.05和95.95；“约99”包括99的
±
1％，或从98.01到99.99，包含98.01和99.99。
56.在本发明中，术语“受试者”、“个体”或“患者”在此可互换地使用并且是指一种脊椎动物，优选一种哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表老年痴呆症(ad)模型的受试者。优选地，所述受试者是人。这样的受试者们典型地遭受或易于患有一种可以通过给
予本发明的上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1或其片段或上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因或其片段的编码基因。
57.本发明所用的上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1或其片段或上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因或其片段的编码基因的“有效量”可以获得所需要的治疗和/或预防效果。对此用途有效的量将取决于例如递送的途径、所采用的具体的活性物质或制剂的活性、炎症的类型、治疗的疾病的阶段和严重性、个体体重和总体健康状况、以及处方医师的判断。剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可以在短期(例如数周至数月)或更长时间段(数月至数年)给予剂量单元。“有效量”具体指的是向所治疗的受试者赋予治疗作用(例如，控制、缓解、改善、缓和或减缓进展)；或预防(例如，延迟发作或降低发展风险)疾病、病症或病状或其症状的上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1或其片段或上述脂肪膜相关蛋白apmap-x1的编码基因或其片段的编码基因的量。
58.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
59.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本技术所要求保护的范围。
60.实施例
61.仪器：abi proflex梯度pcr仪；恒温金属浴tu-100-加热型；君意电泳仪jy300c；zf-7a手提式紫外检测灯；genosens 1800系列凝胶成像采集仪；stab mini多功能恒温振荡培养箱；herocell c1全能型二氧化碳振荡培养箱；lrh-150电热恒温培养箱；实验型高压均质机；thermo nanodrop
tm one微量紫外分光光度计；biotek power wave xs酶标仪；bio-rad mini-protean tetra cell小型电泳系统；transference decoloring shaker ts-8摇床；gi54dw立式自动压力蒸汽灭菌锅；eyela bath sb-9恒温孵育锅；ab sciex 6500三重四级杆；ab sciex triple tof
tm 5600 ；赛多利斯bp211d精密电子天平；htp-312电子天平；移液枪(eppendorf research，0.1-2.5，1-10，10-100，10-200μl)；vortex mixer涡旋振荡器；milli-q纯水仪；5810r台式高速大容量冷冻离心机；5415r小型台式冷冻离心机；2-16k台式离心机；xe-90高速冷冻离心机；hgc-36a干式热氮吹仪；tanon凝胶图像分析系统；sanyo mdf-u73v ultra low超低温冰箱；海尔bcd-256kt冰箱；海尔医用4℃冷藏箱；海尔bc/bd-429h-20℃电冰柜；与岛津lc-30ad液相串联质谱仪；高通量组织研磨仪。
62.试剂：质粒pet-28a和菌株bl21(de3)、dh5α由贺庆利研究员馈赠；质粒pgapzb由赵淑娟研究员馈赠，菌株gs115由王峥涛教授馈赠；高保真pcr酶，infusion酶，dntp，2
×
phanta max buffer；regular agarose g-10；限制性内切酶nde1和xhol1，cut smart buffer，限制性内切酶ecor1和xba1，pcr酶混合溶液(super hf pcr master mix)，t4连接酶；plasmid miniprep kitⅰ(d6943)；bca蛋白测定试剂盒，glycine，tris-base，sds；卡那霉素(kanamycin，kan)，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，溴化乙锭，dna marker，还原型谷胱甘肽(gsh)，氧化型谷胱甘肽(gssg)，过硫酸铵(aps)，四甲基乙二胺(temed)，预染蛋白(protein marker，4
–
66kda)，bradford蛋白测定试剂盒；high affinity ni-nta resin；浓盐酸，蔗糖，氯化钾，正丁醇，edta-2na，双氧水；异胡豆苷标准品；柳胺酚标准品；try标准品；hal，ham和6-甲氧基色胺(mot)；har(harmine)由本实验室从骆驼蓬种子提取物中分离获得，通过ms与nmr鉴定，经鉴定纯度大于98％；1,4-哌嗪二乙磺酸
(pipes)，mncl2·
4h2o，cacl2·
2h2o，硼酸，咪唑，l-精氨酸，40％乙醛，40％甲醛，丁醛和异戊醛；sec标准品，胰蛋白胨，酵母提取物，nacl，尿素，丙甲菌素(ala)，葡萄糖-6-磷酸(g-6-p)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g-6-p-h)，辅酶ⅱ(nadph)，葡萄糖醛酸供体(udpga)；ecl化学发光超敏显色试剂盒，ripa裂解液，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，快速封闭液；pvdf转移膜；上样缓冲液；兔抗apmap；预染蛋白(protein marker，10
–
180kda)，bsa和pbst；色谱级乙腈、甲醇、甲酸；超纯水通过milli-q academic system纯水仪制备；灭菌水由超纯水经过gi54dw立式自动压力蒸汽灭菌锅灭菌获得；9-氨基吖啶(tacrine,is)；高氯酸和氢氧化钠；牛血清白蛋白；肝素钠均来自于商购。
63.1脂肪膜相关蛋白(apmap-x1)在大肠杆菌的表达和活性验证
64.1.1含apmap-x1重组载体的构建
65.本实验选择在大肠杆菌中表达的蛋白adipocyte plasma membrane-associated protein x1(apmap-x1)。
66.利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/预测蛋白跨膜区域。结果如图1所示。1-36号氨基酸位于胞内，37-59号氨基酸位于跨膜区域，60-415号氨基酸位于胞外。故删去该蛋白前59个氨基酸，以增加溶解度，提高表达量。
67.apmap-x1的氨基酸序列如seq id no：1所示，其所对应的核苷酸序列如seq id no：3所示；删去apmap-x1前59个氨基酸后的氨基酸序列如seq id no：2所示。
68.因seq id no：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列(如seq id no：4所示)无法在大肠杆菌中大量表达，故采用密码子优化工具，对apmap-x1进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如seq id no：5所示，优化前后氨基酸序列不变。seq id no：5所示的核苷酸序列购自于金斯瑞生物科技有限公司。
69.将优化后的核苷酸序列(如seq id no：5所示)以引物apmap-x1-f1：cgcggcagccatatgctggagagcccgattgatccgcaaagcttc(如seq id no：6所示)和引物apmap-x1-r1：ggtggtggtgctcgagttaaatgctctgcaggctcagacggcag(如seq id no：7所示)进行pcr扩增，获得目标碱基序列。
70.采用nde1和xhol1限制性内切酶将质粒pet28a线性化。结果如图2a所示，通道1为pcr扩增序列，通道2位线性化质粒，对应位置均有亮斑。再将目标碱基序列和线性化pet28a用infusion酶连接，获得插入目的基因的pet28a质粒，并将该质粒采用热激法转化至dh5α感受态细胞。抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为apmap-x1-pet28a。
71.1.2目标蛋白的诱导表达
72.将apmap-x1-pet28a采用热激法转化至bl21(de3)菌株，用于目标蛋白的诱导表达。将转化成功的菌落转接至含50μg/ml kna的lb培养基(胰蛋白胨1g/100ml，酵母提取物0.5g/100ml，nacl 1g/100ml)，37℃220rpm培养过夜，获得菌株母液。再吸取60μl母液至6ml含50μg/ml kna的lb培养基，37℃220rpm培养2h后，加入1m iptg至体系终浓度为1mm，30℃150rpm诱导培养过夜。最后收集诱导后的菌体，加入蛋白上样缓冲液，100℃煮10min后，sds-page电泳，并考马斯亮蓝染色，对比诱导前的菌体，考察有无诱导成功。
73.结果如图2b所示，通道1、2是未诱导菌体，通道3、4是诱导菌体，通道3、4相对通道1、2于40kda-50kda附近有明显的特异性蛋白，表明apmap-x1成功诱导。
74.为了获得单体蛋白，采用1l的表达体系。诱导结束后，离心收集菌体，并采用高压
均质机破碎菌体。将破碎后的溶液高速离心，分别收集上清和沉淀，sds-page电泳分析后考马斯亮蓝染色，考察目标蛋白是否可溶。结果如图2c所示，通道1为沉淀，通道2为上清，表明目标蛋白均在沉淀中。
75.1.3目标蛋白的分离纯化
76.因目标蛋白均集中在沉淀，采用包涵体透析复性的方法将沉淀中的目标蛋白溶解，以便于活性验证。步骤依次为：
77.(1)包涵体洗涤：将包涵体按照1g菌10ml缓冲液的比例，加入含缓冲液a(50mm tris-hcl ph＝7.4，2m尿素，1mm edta，500mm nacl，10％甘油，1.5％triton x-100)重新混悬，再12000rpm 4℃离心15min，弃去上清，收集沉淀，以洗涤去除杂蛋白。重复两次。
78.(2)包涵体溶解：将上述沉淀按照1g菌100ml缓冲液的比例，加入含缓冲液c(50mm tris-hcl ph＝7.4，8m尿素，1mm edta，500mm nacl，10％甘油，0.7m l-精氨酸，5mm gsh，0.5mm gssg)重新混悬溶解60min。12000rpm 4℃离心15min，弃去沉淀，收集上清。
79.(3)包涵体复性：因缓冲液b(50mm tris-hcl ph＝7.4，1mm edta，500mm nacl，10％甘油，0.7m l-精氨酸，5mm gsh，0.5mm gssg)和缓冲液c尿素浓度不同，其他浓度相同，故将缓冲液b和缓冲液c按照不同比例混合，可以获得5m，2m，1m尿素的缓冲液b/c。采用透析的方法复性。将上清转移至7000da透析袋，于5m尿素的缓冲液b/c中透析12h，再依次于2m尿素、1m尿素、0m尿素的缓冲液b/c中透析6h、4h、2h。
80.(4)亲和层析纯化：因缓冲液1(50mm nah2po4，500mm nacl，10％甘油，ph＝7.4)和缓冲液2(50mm nah2po4，500mm nacl，500mm咪唑，10％甘油，ph＝7.4)咪唑浓度不同，其他浓度相同，故将缓冲液1和缓冲液2按照不同比例混合，可以获得100mm，250mm，500mm咪唑的缓冲液1/2。透析结束后12000rpm 4℃离心15min，收集上清，将上清于缓冲液1中透析2h后，与平衡好的镍柱充分吸附，再分别用10柱体积的50mm咪唑的缓冲液1、5倍柱体积的100mm咪唑、250mm咪唑和500mm咪唑的缓冲液1/2洗脱。50mm洗脱液收集于15ml离心管，100mm、250mm和500mm洗脱液收集于1.5ml离心管，每管1ml。各组分sds-page分析。
81.结果如图2d所示，通道1为包涵体沉淀，通道2号为溶解后的沉淀，通道3为透析复性结束后的包涵体，通道4为镍亲和柱吸附后的上清，通道5为50mm咪唑洗脱液，通道6、7为100mm咪唑洗脱液，通道8、9为250mm咪唑洗脱液，通道10、11为500mm咪唑洗脱液。结果显示，用8m尿素溶解沉淀后，目标蛋白含量有所降低，部分杂蛋白较为显著的减少。实际上，在沉淀溶解过程中，无法将全部包涵体溶解，为避免体系过大而给实验造成操作困难，故舍弃了无法溶解的沉淀。复性结束后，蛋白含量总体降低。将复性后的蛋白上清镍柱进行进一步的亲和柱层析。上清与镍柱吸附后，剩余的上清中仍然有目标蛋白，而且条带明显，表明蛋白中的his-tag与镍柱有一定的吸附，但是亲和性不高。
82.用镍柱吸附后，采用咪唑梯度洗脱。从sds-page考马斯亮蓝染色的结果分析，100mm的咪唑即可将蛋白洗脱下来，表明该蛋白的his-tag与镍离子亲和性不高。在咪唑浓度增加的过程中，目标蛋白逐步被洗脱，250mm咪唑的洗脱液中，即纯的目标蛋白。
83.从上述实验结果来看，得益于目标蛋白在总蛋白中含量较高，因此，即使与镍柱没有产生强亲和力，也能达到纯化蛋白的目的。
84.1.4活性验证
85.将上述获得的目标蛋白纯溶液脱盐后，按照以下孵育体系进行孵育：按照以下孵
育体系：ala(50μg/ml)；纯化蛋白(1mg/ml)；g-6-p(10mm)；g-6-p-h(1unit/ml)；nadph(1mm)；udpga(5mm)；kcl(4mm)；try(600μm)；sec(600μm)；tris-hcl缓冲液补足至100μl。37℃孵育60min，同时，为排除阴性干扰，设置不含微粒体的阴性组1，和不含底物的阴性组2。
86.37℃孵育结束后，加入1ml水饱和正丁醇，涡旋2min后，13000rpm离心10min，取上清900μl氮吹，最后用90μl初始流动相复溶，进样分析。本次实验通过ab sciex triple tof
tm 5600 的ms-ida负离子模式，用于查看产物保留时间以及质谱裂解碎片，通过对比标准品，以判断产物是否为异胡豆苷。
87.采用ab sciex triple tof
tm 5600 (sciex,usa)与岛津lc-30ad液相串联质谱检测产物异胡豆苷。本实验采用uplc beh c18色谱柱(100
×
2.1mm，1.7μm，waters，usa)，流动相为0.1％甲酸-乙腈，洗脱梯度：0min
–
1.5min 2％
–
20％乙腈；1.5min
–
4min 20％
–
65％乙腈；4min
–
11min 65％
–
95％乙腈；11min
–
15min 95％乙腈；15min
–
20min 95％
–
2％乙腈。柱温45℃，样品室温度4℃，流速0.4ml/min，进样体积5μl。
88.本实验采用esi离子源负离子模式，毛细管电压，-4500v；离子源温度，550℃；去簇电压，60v；碰撞能，35ev；分散碰撞能，15ev；氮气作为喷雾器和辅助气体，雾化气，55psi；加热气，55psi；气帘气，35l/min；ms-ida-10ms/ms分析的全扫范围是m/z 50到m/z 1200。
89.结果如图3所示，a是异胡豆苷标准品色谱图，b是孵育产物色谱图，c是不含底物的阴性对照色谱图，d是不含apmap-x1的阴性对照色谱图，e是孵育产物的质谱裂解碎片，f是异胡豆苷标准品的质谱裂解碎片。结果表明原核表达的apmap-x1蛋白在合适的孵育体系下能生成目标产物异胡豆苷，该峰的保留时间和离子对均与异胡豆苷标品一致，且不含底物和apamap-x1的阴性对照组中，对应的时间中没有相应的峰，因此，该产物可以判定为异胡豆苷。
90.同时查看产物的质谱裂解碎片，该化合物分子量530，负离子模式中减去一个氢，质核比为529，发现其主要离子碎片与异胡豆苷相似，主要的两个裂解碎片为367.1037和161.0253，进一步验证该产物是异胡豆苷。
91.2脂肪膜相关蛋白(apmap-x1)在毕赤酵母中的表达和活性验证
92.从上述活性验证的数据来看，大肠杆菌表达的apmap-x1催化活性不高。推测原因可能是包涵体复性率低，且该蛋白存在结构后修饰。因原核表达体系的限制，无法在大肠杆菌表达体系中做进一步的结构后修饰，故限制了活性。故采用毕赤酵母做进一步的活性验证。
93.2.1含apmap-x1重组载体的构建
94.将核苷酸序列(如seq id no：4所示)采用引物apmap-x1-f2：gagatgagtttttgttctagaattgactggaggctgagtctgc(如seq id no：8所示)和引物apmap-x1-r2：ctatttcgaaacgaggaattcatgttggagtcccccatagatcctc(如seq id no：9所示)进行pcr扩增，以获得目标碱基序列。以ecor1和xba1为酶切位点，将质粒pgapzb线性化。然后采用t4连接酶，将目标碱基序列和线性化pgapzb连接，并将该质粒采用热激法转化至dh5α感受态细胞。结果如图4a所示，通道1为pcr产物，通道2为酶切产物，对应位置均有明亮的条带。抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为apmap-x1-pgapzb。
95.2.2apmap-x1-pgapzb阳性菌落的构建
96.将质粒apmap-x1-pgapzb采用电击法转化至gs115感受态。随后于超净台中挑取单
菌落至10μl dd h2o中，吹打混匀，再将上述菌体混悬液30℃孵育10min，-80℃冻存10min，95℃煮10min，以此作为模板进行pcr验证。
97.以gap-f(gtccctatttcaatcaattgaa)(如seq id no：10所示)和终止子aox-r(tggcattctgacatcctc)(如seq id no：11所示)作为引物，pcr扩增并琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下检视，参照pgapzb转化的gs115阴性菌落，考察有无转化成功的菌落。
98.以pgapzb质粒的启动子和终止子为引物，apmap-x1-pgapzb转化成功的阳性菌落应有一1000bp左右的条带，pgapzb转化的gs115阴性菌落应只有小于250bp的条带，结果如图4b所示，通道1-5是apmap-x1-pgapzb转化的菌落pcr，通道6是pgapzb转化的菌落。2、3、4通道的菌落均可以看到1000bp左右的条带，即该通道的菌落转化成功。转化成功的菌株命名为apmap-x1-pgapzb-gs115。
99.2.3 apmap-x1-pgapzb-gs115诱导表达
100.将转化成功的阳性菌株apmap-x1-pgapzb-gs115从平板上转接至液体培养基，培养并诱导apmap-x1表达。首先于超净台中，将上述验证为阳性的菌落从平板中转接至5ml bmgy(100mm k2hpo
4-kh2po
4 ph＝6，胰蛋白胨2g/100ml，酵母提取物1g/100ml，1％甘油，ynb 1.34g/100ml，4
×
10-6
生物素溶液)培养基中，30℃220rpm培养过夜，至od＝3。随后收集菌体，并加入15ml bmmy(100mm k2hpo
4-kh2po
4 ph＝6，胰蛋白胨2g/100ml，酵母提取物1g/100ml，ynb1.34g/100ml，4
×
10-6
生物素溶液)培养基，吹打混匀后转移至150ml锥形瓶中，加入150μl甲醇，使甲醇的最终浓度为1％。30℃220rpm培养6天，每24h补甲醇至体系浓度为1％，每两天取5ml菌液至10ml离心管，分离菌体和上清后于-80℃冰箱保存至分析。
101.将上述获得的菌体做进一步处理，分析蛋白是否有表达。实验步骤如下：(1)从-80℃冰箱取出上述收集的诱导了2天，4天和6天的菌体适量，加入500μl破菌缓冲液(50mm磷酸钾盐缓冲液,ph＝6.5,5％甘油)，吹打混匀后，3000rpm离心5min，弃上清；(2)于沉淀中加入300μl破菌缓冲液，吹打混匀后，3000rpm离心5min，弃上清；(3)在菌体中加入150μl破菌缓冲液，吹打混匀后加入与菌体等量的酸洗玻璃珠，于涡旋仪中涡旋30s，再冰浴30s，如此重复10次；(4)13000rpm 4℃离心10min，取上清即得可溶性蛋白溶液；(5)取10μl 5
×
loading buffer，加入40μl蛋白溶液，混匀后95℃煮10min，即得菌体可溶性蛋白sds-page上样样品；(6)在步骤4的沉淀中加入与上清等量的dd h2o，吹打混匀，取10μl 5
×
loading buffer，加入40μl沉淀混悬液，混匀后95℃煮10min，即得菌体沉淀sds-page上样样品，上样前离心。
102.比较诱导前后的菌体沉淀和上清，考察是否有特异性表达。结果如图4c、d所示，通道1是pgapzb-gs115的菌落蛋白，通道2、3、4是apmap-x1-pgapzb-gs115诱导2天、4天和6天后菌体中的蛋白，其中图4c为沉淀蛋白的考马斯亮蓝染色结果，图4d为上清蛋白的考马斯亮蓝染色结果。结果显示在50kda到70kda的marker附近，有特异性条带。表明菌体中有目标蛋白的表达，大多数在沉淀中，部分在可溶性上清中。
103.2.4目标蛋白的活性验证
104.按照一定的孵育体系进行孵育，采用uplc-ms/ms检测产物是否生成。方法同1.4。
105.结果如图5所示，a是异胡豆苷标准品色谱图，b是孵育产物色谱图，c是不含底物的阴性对照色谱图，d是不含apmap-x1的阴性对照色谱图，e是孵育产物的质谱裂解碎片，f是异胡豆苷标准品的质谱裂解碎片。结果表明原核表达的apmap-x1蛋白在合适的孵育体系下能生成目标产物异胡豆苷，该峰的保留时间和离子对均与异胡豆苷标品一致，且不含底物
和apamap-x1的阴性对照组中，对应的时间中没有相应的峰，因此，该产物可以判定为异胡豆苷。同时查看产物的质谱裂解碎片，该化合物分子量530，负离子模式中减去一个氢，质核比为529，发现其主要离子碎片与异胡豆苷相似，主要的两个裂解碎片为367.1037和161.0253，进一步验证该产物是异胡豆苷。
106.因此，通过大肠杆菌和毕赤酵母表达apmap-x1，最后体外孵育验证其可以在体外催化sec和tyr反应，证明大鼠体内存在可以催化p-s反应的蛋白，为进一步发现har等β-咔啉生物碱的内源性合成途径奠定了基础。
107.3人和哺乳动物脑微粒体催化pictet-spengler反应的活性表征
108.p-s反应是β-咔啉生物碱形成的关键步骤，前面已经证实了apmap-x1可以催化sec和try的体外反应，但是催化效率低，可能是因为大肠杆菌和毕赤酵母的表达体系缺乏动物蛋白所需的翻译后修饰，因此，本部分通过微粒体做进一步的活性验证。
109.3.1脑微粒体中apmap-x1的表达
110.采用超速离心法获取脑微粒体。取大鼠全脑，加入预冷的三倍体积缓冲溶液，手动匀浆至脑组织破碎，组织匀浆液整个体系肉眼可见均匀。将上述匀浆液于4℃离心10min，离心力1000
×
g，小心倒出上清，弃去沉淀。将上清重新加至50ml离心管，配平后采用超高速离心机17000
×
g4℃离心40min，小心倒出上清，弃去沉淀。将上清加至超高速离心机专用10ml离心管内，配平后100000
×
g 4℃离心60min，弃上清，取沉淀。在上述沉淀中加入适量缓冲溶液，并反复吹打至体系均一，得微粒体，注意制备过程中均需要冰浴。
111.测定微粒体蛋白浓度后，采用western blot对大鼠脑微粒体中apmap-x1的蛋白表达进行检测。蛋白上样量为25μg，上样体积为20μl，兔抗apmap-x1溶液稀释比例为1：2000。结果如图6所示，人和大鼠脑微粒体中有一定的apmap-x1蛋白表达。由于该抗体为多克隆抗体，且动物体内存在apmap-x1不同类型的亚型酶，所以共有三个条带。
112.3.2pictet-spengler反应在脑微粒体中的发现
113.将差速离心法获得的脑微粒体，按照以下孵育体系进行孵育：ala(50μg/ml)；脑微粒体(1mg/ml)；g-6-p(10mm)；g-6-p-h(1unit/ml)；nadph(1mm)；udpga(5mm)；kcl(4mm)；try(40μm)；sec(40μm)；tris-hcl缓冲液补足至100μl。除了脑微粒体孵育，增加阴性对照，即不含底物标品的对照组。37℃孵育1h后，加入1ml水饱和正丁醇，涡旋2min后，13000rpm离心10min，取上清900μl氮吹，最后用90μl初始流动相复溶，采用质谱检测进行分析。
114.本实验采用ab sciex 6500三重四级杆(sciex,usa)，使用esi作为离子源，采用多反应监测(mrm)正离子检测模式。雾化气与干燥气均由氮气发生器提供；其它各离子源参数如下：气帘气，30psi；碰撞气，中等；离子源电压，-4500v；离子源温度，500℃；离子源气体1，50psi；离子源气体2，50psi。优化后的质谱参数如表1所示。
115.本实验采用岛津lc-30ad液相，选用uplc beh c
18
色谱柱(50
×
2.1mm，1.7μm，waters，usa)；流动相为0.1％甲酸-乙腈，洗脱梯度：0min
–
3min 10％
–
90％乙腈；3min
–
3.5min 90％乙腈。柱温40℃，样品室温度4℃，流速0.3ml/min，进样体积20μl。
116.表1待测物和内标的质谱参数
[0117][0118]
结果如图7所示。a为异胡豆苷合内标标准品的色谱图，b为底物与微粒体共孵育色谱图，c为无微粒体孵育的色谱图。通过对比异胡豆苷标准品的保留时间和离子对，发现sec和try在上述孵育体系中生成了异胡豆苷，而阴性对照中该出峰时间没有异胡豆苷。因此，两个底物和脑微粒体在合适的孵育体系下，可以发生p-s反应。
[0119]
因此，人和大鼠脑微粒体存在有apmap-x1的表达。而且在合适的孵育体系下，给予底物sec和try后，在产物中可以发现异胡豆苷，即p-s反应可以在脑微粒体催化下发生。该试验结果为进一步研究har等β-咔啉生物碱在哺乳动物的体内合成奠定基础。
[0120]
4合成har等β-咔啉生物碱的底物筛选
[0121]
本研究关注于大鼠脑微粒体和肝微粒体催化p-s反应的底物特异性，并结合mpo等血红素过氧化物酶的氧化反应，筛选可以获得har、hal和ham的底物，其中选择try、5-ht和6-甲氧基色胺(mot)和常见的小分子醛：甲醛(fa)、乙醛(aa)、丁醛(ba)和异戊醛(iva)作为考察的底物，阐明har等β-咔啉生物碱在大鼠体内的合成路径，为其在生物体内的生理活性研究奠定基础。
[0122]
4.1合成har等β-咔啉生物碱的pictet-spengler反应研究
[0123]
结合har、hal和ham的结构特点，选取了不同的胺类和醛类化合物进行底物筛选。
[0124]
按照以下孵育体系：ala(50μg/ml)；微粒体/脑微粒体(1mg/ml)；g-6-p(10mm)；g-6-p-h(1unit/ml)；nadph(1mm)；udpga(5mm)；kcl(4mm)；try/5-ht/mot(60μm)；fa/aa/ba/iva(0.2％)；tris-hcl缓冲液补足至100μl。37℃孵育20min，同时，为排除阴性干扰，设置不含微粒体的阴性组1，和不含底物的阴性组2。
[0125]
孵育结束后迅速加入500μl冰乙腈，涡旋2min后，13000rpm离心10min，取上清480μl于另一干净1.5ml离心管，37℃氮吹干。再用80μl 10％甲醇复溶，涡旋2min后，13000rpm离心10min，取上清70μl至液相小瓶，用于质谱检测，判断是否有产物生成。
[0126]
采用ab sciex triple tof
tm 5600 (sciex,usa)与岛津lc-30ad液相串联质谱检测产物异胡豆苷。本实验采用uplc beh c18色谱柱(100
×
2.1mm，1.7μm，waters，usa)，流动相为0.1％甲酸-乙腈，洗脱梯度：0min
–
2min 10％乙腈；2min
–
5min 20％
–
30％乙腈；5min
–
8min30％
–
90％乙腈；8min
–
10min 90％乙腈；10.1min
–
11min 10％乙腈。柱温45℃，样品室温度4℃，流速0.3ml/min，进样体积5μl。
[0127]
本实验采用esi离子源正离子模式，毛细管电压，5500v；离子源温度，550℃；去簇电压，60v；碰撞能，25ev；分散碰撞能，15ev；氮气作为喷雾器和辅助气体，雾化气，55psi；加
热气，55psi；气帘气，35l/min；产物离子分析的全扫范围是m/z 50到m/z 500。
[0128]
按照上述孵育体系进行孵育，应用质谱检测，在结果中输入目标产物的分子式，选择提取离子流图，对比两个阴性组，查看实验组中是否有特异峰，并查看二级图谱，推测大概的裂解途径，进一步推测该峰是否为目标产物。
[0129]
脑微粒体催化p-s反应的底物特异性研究
[0130]
检测结束后，打开结果的idx格式数据文件，选择extract ion using dialog(xic)，输入分子式c
11h12
n2，查看实验组相对阴性对照组有无特性峰，并进一步对照裂解碎片，考察是否有目标产物生成。实验组在5min左右有一明显的c
11h12
n2峰，而阴性组均无明显的峰形。结合质谱裂解碎片173.1076，158.0837，144.0806，130.0650，判定该峰即为化合物a1(c
11h12
n2)。即try与fa可在脑微粒体的催化下发生反应，获得a1。按照相同数据处理方法，发现5-ht与fa可在脑微粒体的催化下发生反应，获得化合物b1，质谱裂解碎片189.1033，174.0794，146.0600。mot与fa可发生反应，获得化合物c1，质谱裂解碎片174.0879，159.0641。
[0131]
按照相同的数据处理方法，查看aa分别与try、5-ht和mot是否可以在脑微粒体的催化下反应。实验组在6min左右有一明显的a2(c
12h14
n2)峰，而阴性组均无明显的峰形。结合质谱裂解碎片170.0936，158.0921，143.0706，判定该峰即为化合物a2。即try与aa可发生反应，获得a2。同样的，发现5-ht与aa可发生反应，获得b2(c
12h14
n2o)，质谱裂解碎片203.1180，186.0914，171.0679。mot与aa可发生反应，获得化合物c2(c
13h16
n2o)，质谱裂解碎片200.1070，188.1068，173.0835。
[0132]
按照相同的数据处理方法，发现在脑微粒体的催化下，ba和iva均无法与try、5-ht、mot进一步反应。结果显示实验组和阴性组均无明显的峰形。
[0133]
肝微粒体催化p-s反应的底物特异性研究
[0134]
采用上述相同的数据处理方法，结果与脑微粒体的催化活性一致，try及其衍生物5-ht和mot可分别与fa和aa在肝微粒体的催化下发生p-s反应，而try/5-ht则无法与iva/ba反应。与脑微粒体催化活性不同的是，mot可以在肝微粒体催化下，与iva/ba进一步反应。该结果提示肝微粒催化p-s反应的底物特异性相对于脑微粒体较低。
[0135]
4.2 apmap-x1在大鼠和人肝微粒体中的表征
[0136]
采用差速离心法获得大鼠肝微粒体。人肝微粒体购自瑞德肝脏疾病有限公司。应用western blot对微粒体中apmap-x1的蛋白表达进行了检测，结果显示：大鼠和人肝微粒体中有一定的apmap-x1蛋白表达，由于该抗体为多克隆抗体，且动物体内存在apmap-x1不同类型的亚型酶，所以共有三个条带。
[0137]
4.3合成har等β-咔啉生物碱的氧化反应研究
[0138]
氧化反应体系结合了上述p-s反应的体系和过氧化物酶的催化体系，体系组成如下所示：ala(50μg/ml)；大鼠肝微粒体/脑微粒体(2mg/ml)；h2o2(25μm)；mpo(5unit/ml)；g-6-p(10mm)；g-6-p-h(1unit/ml)；nadph(1mm)；udpga(5mm)；kcl(4mm)；try/mot(600μm)；aa(2％)；tris-hcl缓冲液补足至100μl。37℃孵育1h，同时，为排除阴性干扰，设置不含微粒体的阴性组1，和不含底物的阴性组2。
[0139]
孵育结束后迅速加入500μl冰乙腈，涡旋2min后，13000rpm离心10min，取上清480μl于另一干净1.5ml离心管，37℃氮吹干，备用。通过质谱检测，判断是否有产物生成。检测方
法同4.1。在结果中输入目标产物的分子式，选择提取离子流图，对比两个阴性组，查看实验组中是否有特异峰，并查看二级图谱，推测大概的裂解途径，进一步推测该峰是否为目标产物。同时，对比har、hal和ham标准品的出峰时间和质谱裂解碎片，进一步明确孵育产物中的质谱峰是否为har、hal和ham。
[0140]
har、hal和ham在脑微粒体的合成路径研究
[0141]
结果显示实验组在6min左右有一明显的c
13h14
n2o峰，而阴性组均无明显的峰形。结合质谱裂解碎片215.1188，200.0956，174.0922，以及hal标准品的保留时间和质谱裂解碎片，判定该峰即为化合物hal。
[0142]
相同的，对比阴性对照和标准品的色谱保留时间和质谱裂解碎片，在脑微粒体和mpo的催化下，mot和aa可以反应获得har(c
13h12
n2o)，质谱裂解碎片：213.1034，198.0792，170.0838。try和aa可反应获得ham(c
12h10
n2)，质谱裂解碎片183.0908，141.9555，115.0574。
[0143]
har、hal和ham在肝微粒体的合成路径研究
[0144]
肝微粒体的孵育结果显示实验组在6min左右有一明显的c
13h14
n2o峰，而阴性组均无明显的峰形。结合质谱裂解碎片215.1178，200.0947，174.0917，该峰出峰时间和离子碎片与脑微粒体催化产物相一致。hal标准品出峰时间与产物一致，hal标准品的二级图谱与产物的离子碎片相符合，判定该峰即为hal。即mot与aa可发生反应，并在mpo的催化下进一步氧化，获得hal。
[0145]
相同的，对比阴性对照和标准品的色谱保留时间和质谱裂解碎片，在肝微粒体和mpo的催化下，mot和aa可以反应获得har(c
13h12
n2o)，质谱裂解碎片：213.11036，198.0802，170.0849。try和aa可反应获得ham(c
12h10
n2)，质谱裂解碎片183.0914，141.9581，115.0548。
[0146]
因此，在大鼠肝微粒体和脑微粒体的催化下，fa和aa可以与try，5-ht和mot发生反应，而ba和iva只能在肝微粒体的催化下与mot反应。而且，研究发现对大鼠和人肝微粒体中也存在着apmap-x1。try和mot与aa可以在肝微粒体或脑微粒体的催化下发生缩合，并通过mpo进一步氧化，获得ham、hal和har。肝微粒体和脑微粒体的体外孵育合成体系，为人和动物体内har等生物碱的生物合成奠定了基础。
[0147]
5 har在大鼠衰老过程中的暴露规律研究
[0148]
5.1溶液配制
[0149]
储备液配制
[0150]
于称量纸上精密称取har 5mg，用甲醇溶解后，于5ml容量瓶中用甲醇定容，得1mg/ml储备液。
[0151]
工作液配制
[0152]
精密移取har储备液，按照下列浓度配制系列梯度：0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml。内标tacrine(is)配制成7ng/ml的6％高氯酸水溶液。
[0153]
标准曲线及质控样品配制
[0154]
以替代血浆(0.9％nacl和4％牛血清白蛋白)为空白基质与上述各生物碱系列浓度工作液配制标准曲线样品，浓度依次为0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml，内标浓度为7ng/ml。
[0155]
5.2样品采集
[0156]
本实验采用sd大鼠20只(200～220g)，雌雄各10只，动物被安置在标准环境条件下光照充足的空调房间(室温和相对湿度分别保持在25℃
±
1℃和60％-65％)，并在研究前自由获得动物饲料和自来水。
[0157]
这些大鼠饲养在环境控制室中，在整个实验过程中都可以自由获得食物和水。实验持续了16个月。每个月采集一次血样，大约在上午9点到11点抽血。异氟烷麻醉后眼眶静脉丛取血于肝素化的离心管中，3000
×
g离心10分钟，取上清于另一1.5ml离心管中，并-80℃冰箱中保存。共饲养16个月，共获得16批血浆。
[0158]
5.3样品检测
[0159]
采用ab sciex 6500三重四级杆(sciex,usa)与岛津lc-30ad液相串联质谱仪测定各生物碱浓度。从-80℃冰箱中取出血浆，4℃冰箱解冻，取100μl于1.5ml离心管中，加入80μl含内标的6％高氯酸，置于1.5ml离心管中漩涡混合2min。4℃，13000
×
g离心10min。将上清转移至另一管，加入适量氢氧化钠溶液。上述溶液在4℃下旋转2min，在13000
×
g离心10min。取20μl上清液注入uplc-esi-ms/ms系统进行分析。
[0160]
本实验采用ab sciex 6500三重四级杆(sciex,usa)，使用esi作为离子源，采用多反应监测(multiple reaction monitoring,mrm)正离子检测模式。雾化气与干燥气均由氮气发生器提供；其它各离子源参数如下：气帘气，30psi；碰撞气，中等；离子源电压，5500v；离子源温度，500℃；离子源气体1，50psi；离子源气体2，50psi。优化后的质谱参数如表2所示。
[0161]
表2待测物和内标的质谱参数
[0162][0163]
本实验采用岛津lc-30ad液相，选用uplc beh c
18
色谱柱(50
×
2.1mm，1.7μm，waters，usa)；流动相为0.1％甲酸-乙腈，洗脱梯度：0min
–
2.5min 9％
–
13％乙腈；2.51min
–
3min 14％
–
14.5％乙腈；3min
–
4min 14.5％
–
15.5％乙腈；4min
–
5min 15.5％
–
90％乙腈；5min
–
6min 90％
–
90％乙腈；6min
–
7min 90％
–
9％乙腈；7min
–
8min 9％乙腈。柱温45℃，样品室温度4℃，流速0.4ml/min，进样体积20μl。
[0164]
5.4数据处理
[0165]
采用spss version 18.0软件进行统计分析，数据以均数
±
标准差表示。用直方图对数据分布进行图形化评估。本研究采用参数检验。采用t检验比较各组间生物碱浓度。统计学意义如下，p《0.05表示有差异，p《0.01表示有显著性差异，p《0.001表示有极显著性统计学差异。
[0166]
5.5大鼠饲料和垫料中har的检测
[0167]
从实验大鼠的笼子中获取饲料和垫料样品。检测方法参照yang等制定的质量规范。饲料和垫料准确地粉化和称重。将粉末加入25倍于其体积的甲醇中，超声处理25min，功
率250w，频率30khz。然后将上清液(5ml)转移到另一管中，在37℃氮吹干。用100μl的9％乙腈复溶，旋涡2min，在4℃、13000
×
g离心10min后，上清液20μl注入uplc-esi-ms/ms体系中分析生物碱(杨雅迪,程雪梅,王长虹,郑立明,李岩,李晓静,张磊,温方方,王峥涛,维药骆驼蓬子药材质量标准研究,中国药学杂志,2014,49,106-112.)。
[0168]
结果显示，饲料和垫料中均未发现har。在同一出峰时间检测到微弱信号响应，上清液浓缩50倍后，所有响应均低于定量下限，响应值如表3所示。
[0169]
表3饲料和垫料中har的分析物峰面积
[0170][0171]
5.6自然衰老过程中大鼠血浆中har的暴露规律研究
[0172]
本以har含量为纵坐标，时间为横坐标，以取血的时间点为横坐标作图，如图8所示。随着年龄的增长，血浆中har的浓度逐渐降低。在第1个月，har含量达到1.80
±
1.51ng/ml，第16个月降至0.35
±
0.04ng/ml。第1个月har浓度极显著高于第6～16个月(p《0.01)。在第2～5个月，har的含量呈下降趋势，但有轻微的波动。在第6个月浓度趋于稳定，并维持在低浓度(p》0.05)。
[0173]
6 har在不同年龄、性别等受试者体内的分布研究
[0174]
6.1溶液配制
[0175]
储备液配制
[0176]
于称量纸上精密称取har 5mg，用甲醇溶解后，于5ml容量瓶中用甲醇定容，得1mg/ml储备液。
[0177]
工作液配制
[0178]
精密移取har储备液，按照下列浓度配制系列梯度：0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml。内标tacrine配制成7ng/ml的6％高氯酸水溶液。
[0179]
标准曲线及质控样品配制
[0180]
以替代血浆(0.9％nacl和4％牛血清白蛋白)为空白基质与上述各生物碱系列浓度工作液配制标准曲线样品，浓度依次为0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml，内标浓度为7ng/ml。
[0181]
6.2取样
[0182]
健康受试者和ad患者的具体信息如表4所示。
[0183]
表4健康受试者和ad患者信息
[0184]
[0185][0186]-：无相关数据。
[0187]
受试者空腹12小时后，静脉采血约1ml。血样于4℃条件下，3000
×
g离心10min。用移液枪吸取上清于干净的离心管中，-80℃保存。
[0188]
6.3检测
[0189]
于-80℃冰箱中取出样品，4℃冰箱融化。用移液枪精密移取100μl血浆于1.5ml离心管中，加入含内标的6％高氯酸80μl，涡旋2min后，13000
×
g，4℃离心10min。移取上清后加入1m naoh。涡旋混匀后离心，取100μl于液相小瓶中，进样检测。
[0190]
6.4数据处理
[0191]
采用spss version 18.0软件进行统计分析，数据以均数
±
标准差表示。采用独立样本t检验分析不同性别、不同民族、不同生活习惯的差异，采用秩和检验分析不同生理状态和不同年龄的受试者血浆中生物碱的含量差异。
[0192]
6.5实验结果
[0193]
阿尔兹海默症患者血浆中har(0.88
±
0.41ng/ml)显著低于健康受试者(1.72
±
2.50ng/ml)(p《0.05)。日常不饮酒的健康受试者血浆中har没有受到影响(p》0.05)。吸烟与否不会影响受试者中har的含量(p》0.05)。
[0194]
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。