一种多功能磁性纳米复合材料及其制备方法和应用

1.本发明涉及癌症诊断材料技术领域，具体涉及一种多功能磁性纳米复合材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，ctcs)是一类从肿瘤病灶部位脱落进入外周血循环系统的肿瘤细胞，它们能够随血液循环进入其他组织和器官再次形成新的转移病灶，与肿瘤的进展密切相关。研究中发现多种癌症如肺癌，前列腺癌，结肠癌等患者的血液中均能检出ctcs，这说明ctcs可被作为一种理想的生物标志物用于液体活检。因此，通过ctcs计数能够实现对肿瘤治疗效果的评估，提示肿瘤转移复发的风险以及为预后判断提供依据，同时由于ctcs中携带着原发和转移病灶中肿瘤的分子生物学信息，对ctcs进行深入的分子分析，能够帮助优化靶向治疗方案和肿瘤耐药性问题的解决，最终实现精准的个性化的治疗。
3.高活性，高纯度的循环肿瘤细胞样本是对其进行下游分子分析的必要前提，这就要求将捕获到的ctcs从捕获基底上以温和的方式释放，然而，在捕获ctcs的过程中，总是希望ctcs与捕获基底紧密结合以产生强烈的粘附力，这就给ctcs的释放带来了极大的困难，目前所采用的基于物理刺激响应，化学刺激响应，生物刺激响应释放的方法，往往需要经过复杂的制备过程，引入复杂的化学基团，需要额外设备的辅助，且会对肿瘤细胞的微环境和代谢状态产生影响，限制了其在下游分子分析中的应用。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种多功能磁性纳米复合材料及其制备方法和应用，以解决现有技术中ctcs的释放方法存在的制备过程复杂、须引入额外设备、影响肿瘤细胞的活性的问题。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种多功能磁性纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：
6.(1)将六水合氯化铁和柠檬酸三钠加入乙二醇中，加热搅拌28-32min，然后加入乙酸钠，继续加热搅拌58-62min，再升温至180-220℃，反应8-12h，最后冷却至室温，洗涤，制得fe3o4纳米颗粒；
7.(2)将步骤(1)制得的fe3o4纳米颗粒分散在2-甲基咪唑的甲醇溶液中，然后滴加六水合硝酸锌溶液，于室温条件下，避光静置反应50-70min，洗涤，制得fe3o4@zif-8纳米颗粒；
8.(3)将步骤(2)制得的fe3o4@zif-8纳米颗粒分散在tris-hcl缓冲液中，然后加入单宁酸溶液，混合25-35min，再加入过氧化氢溶液和辣根过氧化物酶溶液，于35-40℃条件下，摇床反应50-70min，洗涤，制得多功能磁性纳米复合材料，即fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒。
9.本发明的有益效果为：本发明通过在fe3o4@zif-8核壳结构表面包覆pta涂层，形成fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒，即多功能磁性纳米复合材料，材料表面具有pta(聚单宁酸)涂
层，ta(单宁酸)中富含的没食子酰基，可以与肿瘤细胞的糖萼结构发生强烈的氢键相互作用和疏水相互作用，从而可以高效地捕获ctcs细胞。
10.pta涂层修饰到fe3o4@zif-8核壳结构表面，形成的zif-8-pta结构具有atp响应性，atp作为一种普遍存在于细胞中的供能物质，对细胞友好，当捕获的细胞在富含atp的环境中时，atp可与锌离子产生强竞争配位作用，从而破坏磁性纳米材料的核壳结构，达到温和释放细胞的目的，保证释放细胞的高活性。
11.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
12.进一步，步骤(1)中六水合氯化铁、柠檬酸三钠、乙酸钠和乙二醇的质量体积比为1-1.5g：0.5-1g：2-2.5g：45-55ml。
13.进一步，步骤(1)中加热温度为40-50℃。
14.进一步，步骤(1)中升温速度为4-10℃/min，
15.进一步，步骤(1)中借助磁铁先采用乙醇清洗，然后用ro水清洗，完成洗涤过程。
16.进一步，步骤(2)中fe3o4纳米颗粒、2-甲基咪唑的甲醇溶液和六水合硝酸锌溶液的质量体积比为8-12mg：23-27ml：4-6ml。
17.进一步，步骤(2)中二甲基咪唑的甲醇溶液浓度为30-35g/l。
18.进一步，步骤(2)中六水合硝酸锌溶液浓度为18-22g/l，溶剂为甲醇。
19.进一步，步骤(2)中借助磁铁采用甲醇完成洗涤过程。
20.进一步，步骤(3)中fe3o4@zif-8纳米颗粒、tris-hcl缓冲液、单宁酸溶液，过氧化氢溶液和辣根过氧化物酶溶液的质量体积比为8-12mg：13-17ml：4-6ml：90-110μl：45-55μl。
21.进一步，步骤(3)中单宁酸溶液浓度为1.8-2.2g/l，溶剂为tris-hcl缓冲液。
22.进一步，步骤(3)中tris-hcl缓冲液ph值为8-9，浓度为8-12mmol/l。
23.进一步，步骤(3)中过氧化氢溶液浓度为0.8-1.2mol/l，辣根过氧化物酶溶液浓度为90-110μmol/l。
24.进一步，步骤(3)中借助磁铁采用pbs缓冲液完成洗涤过程。
25.进一步，步骤(2)-(3)中，采用超声分散。
26.本发明还提供上述的多功能磁性纳米复合材料的制备方法制得的多功能磁性纳米复合材料。
27.进一步，该多功能磁性纳米复合材料包括fe3o4@zif-8核壳结构和pta涂层，zif-8生长在fe3o4纳米颗粒表面形成核壳结构，pta涂层包覆在核壳结构表面。
28.本发明还提供上述多功能磁性纳米复合材料在捕获或释放捕获的循环肿瘤细胞方面的应用。
29.本发明具有以下有益效果：
30.1、本发明制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒中zif-8-pta结构具有atp响应性，atp能够竞争配位结合锌离子，打破原有的锌离子与二甲基咪唑和单宁酸的配位，从而能够在atp环境中，实现纳米颗粒核壳结构的降解，由于富含atp的环境对细胞友好，从而达到对捕获细胞温和友好释放的目的。
31.2、本发明通过溶剂热法，一锅法，多酚酶促氧化自聚合反应过程合成的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒，zif-8可通过配位作用在的fe3o4纳米颗粒表面快速生长，加入ta进一步通过配位作用结合后，可在碱性条件下通过酶促氧化聚合反应形成聚合物涂层，本发明制得
的的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒不仅能够实现肿瘤细胞的高效捕获，还能以温和友好的方式释放捕获的细胞，本发明的制备方法操作简单且材料成本低廉，能够在生物材料制备过程中得到广泛实用。
附图说明
32.图1为实施例1制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒的透射电子显微镜图；
33.图2为实施例1制得的纳米颗粒的化学成分分析图；
34.图3为实施例1制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒的atp响应性分析图；
35.图4为实施例1制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒的ctcs释放效率图；
36.图5为实施例1和对比例1制得的纳米颗粒的ctcs释放效率对比图。
具体实施方式
37.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
38.实施例1：
39.一种多功能磁性纳米复合材料，其制备方法包括以下步骤：
40.(1)将1.14g六水合氯化铁和0.74g柠檬酸三钠加入50ml乙二醇中，于45℃条件下，搅拌30min，然后加入2.4g乙酸钠，继续于45℃条件下，搅拌58-62min，制得均一溶液，将均一溶液转移至聚四氟乙烯衬里不锈钢高压反应釜中，在恒温鼓风干燥箱中，以6℃/min的升温速度，缓慢升温至200℃，反应10h，反应结束后，冷却至室温，将产物取出，借助磁铁先采用乙醇清洗，然后用ro水清洗，制得fe3o4纳米颗粒；
41.(2)将10mg步骤(1)制得的fe3o4纳米颗粒加至25ml 2-甲基咪唑的甲醇溶液中，在超声波清洗机中超声15min，使fe3o4纳米颗粒均匀分散，得到黑色的悬浮液，然后边摇动边缓慢滴加5ml六水合硝酸锌溶液，于室温条件下，避光静置反应50-70min，将产物借助磁铁采用甲醇洗涤，制得fe3o4@zif-8纳米颗粒；其中，二甲基咪唑的甲醇溶液浓度为32.8g/l，六水合硝酸锌溶液浓度为20g/l，溶剂为甲醇；
42.(3)将10mg步骤(2)制得的fe3o4@zif-8纳米颗粒加至15ml的tris-hcl缓冲液中，超声分散15min，使纳米颗粒分散均匀，然后加入5ml单宁酸的溶液，涡旋混合30min，再加入100μl过氧化氢溶液和50μl辣根过氧化物酶溶液，于37℃条件下，摇床反应60min，将产物借助磁铁采用pbs缓冲液洗涤，制得多功能磁性纳米复合材料，即fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒；其中，单宁酸溶液浓度为2g/l，溶剂为tris-hcl缓冲液，tris-hcl缓冲液ph值均为8.5，浓度均为10mmol/l，过氧化氢溶液浓度为1mol/l，辣根过氧化物酶溶液浓度为100μmol/l。
43.实施例2：
44.一种多功能磁性纳米复合材料，其制备方法包括以下步骤：
45.(1)将1g六水合氯化铁和0.5g柠檬酸三钠加入45ml乙二醇中，于40℃条件下，搅拌32min，然后加入2g乙酸钠，继续于40℃条件下，搅拌62min，制得均一溶液，将均一溶液转移至聚四氟乙烯衬里不锈钢高压反应釜中，在恒温鼓风干燥箱中，以4℃/min的升温速度，缓慢升温至180℃，反应12h，反应结束后，冷却至室温，将产物取出，借助磁铁先采用乙醇清
洗，然后用ro水清洗，制得fe3o4纳米颗粒；
46.(2)将8mg步骤(1)制得的fe3o4纳米颗粒加至23ml 2-甲基咪唑的甲醇溶液中，在超声波清洗机中超声15min，使fe3o4纳米颗粒均匀分散，得到黑色的悬浮液，然后边摇动边缓慢滴加4ml六水合硝酸锌溶液，于室温条件下，避光静置反应50min，将产物借助磁铁采用甲醇洗涤，制得fe3o4@zif-8纳米颗粒；其中，二甲基咪唑的甲醇溶液浓度为30g/l，六水合硝酸锌溶液浓度为18g/l，溶剂为甲醇；
47.(3)将8mg步骤(2)制得的fe3o4@zif-8纳米颗粒加至13ml的tris-hcl缓冲液中，超声分散15min，使纳米颗粒分散均匀，然后加入4ml单宁酸的溶液，涡旋混合25min，再加入90μl过氧化氢溶液和45μl辣根过氧化物酶溶液，于35℃条件下，摇床反应70min，将产物借助磁铁采用pbs缓冲液洗涤，制得多功能磁性纳米复合材料，即fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒；其中，单宁酸溶液浓度为1.8g/l，溶剂为tris-hcl缓冲液，tris-hcl缓冲液ph值均为8，浓度均为8mmol/l，过氧化氢溶液浓度为0.8mol/l，辣根过氧化物酶溶液浓度为90μmol/l。
48.实施例3：
49.一种多功能磁性纳米复合材料，其制备方法包括以下步骤：
50.(1)将1.5g六水合氯化铁和1g柠檬酸三钠加入55ml乙二醇中，于50℃条件下，搅拌28min，然后加入2.5g乙酸钠，继续于50℃条件下，搅拌58min，制得均一溶液，将均一溶液转移至聚四氟乙烯衬里不锈钢高压反应釜中，在恒温鼓风干燥箱中，以10℃/min的升温速度，缓慢升温至220℃，反应8h，反应结束后，冷却至室温，将产物取出，借助磁铁先采用乙醇清洗，然后用ro水清洗，制得fe3o4纳米颗粒；
51.(2)将12mg步骤(1)制得的fe3o4纳米颗粒加至27ml 2-甲基咪唑的甲醇溶液中，在超声波清洗机中超声15min，使fe3o4纳米颗粒均匀分散，得到黑色的悬浮液，然后边摇动边缓慢滴加6ml六水合硝酸锌溶液，于室温条件下，避光静置反应70min，将产物借助磁铁采用甲醇洗涤，制得fe3o4@zif-8纳米颗粒；其中，二甲基咪唑的甲醇溶液浓度为35g/l，六水合硝酸锌溶液浓度为22g/l，溶剂为甲醇；
52.(3)将12mg步骤(2)制得的fe3o4@zif-8纳米颗粒加至17ml的tris-hcl缓冲液中，超声分散15min，使纳米颗粒分散均匀，然后加入6ml单宁酸的溶液，涡旋混合35min，再加入110μl过氧化氢溶液和55μl辣根过氧化物酶溶液，于40℃条件下，摇床反应50min，将产物借助磁铁采用pbs缓冲液洗涤，制得多功能磁性纳米复合材料，即fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒；其中，单宁酸溶液浓度为2.2g/l，溶剂为tris-hcl缓冲液，tris-hcl缓冲液ph值均为9，浓度均为12mmol/l，过氧化氢溶液浓度为1.2mol/l，辣根过氧化物酶溶液浓度为110μmol/l。
53.对比例1：
54.一种磁性纳米材料，其制备方法包括以下步骤：
55.将1.14g六水合氯化铁和0.74g柠檬酸三钠加入50ml乙二醇中，于45℃条件下，搅拌30min，然后加入2.4g乙酸钠，继续于45℃条件下，搅拌58-62min，制得均一溶液，将均一溶液转移至聚四氟乙烯衬里不锈钢高压反应釜中，在恒温鼓风干燥箱中，以6℃/min的升温速度，缓慢升温至200℃，反应10h，反应结束后，冷却至室温，将产物取出，借助磁铁先采用乙醇清洗，然后用ro水清洗，制得磁性纳米材料，即fe3o4纳米颗粒；
56.试验例
57.实施例1-3所制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒表征及性能基本一致，下面以实施
例1制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒为例，进行以下检测。
58.一、形貌分析
59.将实施例1制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒采用透射电子显微镜进行观察，结果见图1。由图1可知，本发明制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒具有明显的核壳结构，核壳结构表面有一层浅色衬度的聚合物涂层。
60.二、化学成分分析
61.将实施例1制得的fe3o4纳米颗粒、fe3o4@zif-8纳米颗粒和fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒分别采用傅里叶变换红外光谱进行表征分析，结果见图2。由图2可知，红外吸收光谱中1630cm-1
，1384cm-1
以及585cm-1
处的吸收峰分别来自fe3o4纳米颗粒中-cooh的伸缩振动和fe-o的特征吸收；500-1350cm-1
，1350-1500cm-1
的吸收峰来自fe3o4@zif-8纳米颗粒中咪唑环的平面弯曲和伸缩振动，1585cm-1
，421cm-1
处的吸收峰分别来自fe3o4@zif-8纳米颗粒中c＝n-，zn-n的伸缩振动；1700cm-1
处c＝o的吸收峰，1622cm-1
，1571cm-1
，1492cm-1
处吸收峰是苯环骨架结构的伸缩振动吸收峰，1351cm-1
，1205cm-1
处c-o的吸收峰，因此，说明pta涂层的成功修饰。
62.三、atp响应性分析
63.将实施例1制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒进行atp响应降解测试，具体测试方法为：采用原子吸收分光光度计(aas)测定fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒中的锌离子的累计释放量，来表征fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒中核壳结构的降解情况，即在atp浓度分别为0mmol/l和4mmol/l的磷酸盐缓冲液中，将fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒分别分散在其中，制成100ug/ml的分散液，置于37℃摇床中，0.5h，1h，1.5h，2h，4h，6h，8h后分别取样，检测上清液中锌离子的浓度，并计算锌离子的累计释放量，结果见图3。
64.由图3可知，当atp加入后，锌离子呈现先快后慢的释放趋势，2h后锌离子的累计释放量为65.9％，随着时间延长，锌离子的释放量只有少量增加，说明2h后fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒中大部分核壳结构已经被破坏，延长处理时间对锌离子释放的影响已较小，8h后锌离子的累计释放量达到78.6％；然而，在没有atp存在时，8h后fe3o4@zif-8-pta中仅有少量锌离子的释放，说明本发明制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒具有atp响应性。
65.四、ctcs的捕获及释放分析
66.将实施例1得到fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒进行ctcs的捕获及释放分析，具体分析方法为：将捕获细胞后的纳米颗粒转移至含有4mmol/l atp的无血清培养基中，在37℃摇床中孵育0.5h，1h，1.5h，2h，4h，6h后，在外加磁场下分离纳米颗粒，用pbs清洗纳米颗粒后，收集全部含有释放细胞的上清液，并采用血细胞计数板计数，计算释放效率(释放效率定义为上清液中释放的细胞数量/捕获细胞数量)，结果见图4。
67.由图4可知，ctcs的释放效率随释放时间的延长而提高，在2h后释放效率达到80.9％，6h后释放效率达到85.4％，这说明结合在ctcs上的纳米颗粒上，随着涂层的降解与ctcs逐渐分离，2h后随着时间的继续延长释放效率没有明显的提高，经过atp处理，2h已经达到较好的释放效果，因此，本发明制得的纳米颗粒能够在atp为4mmol/l的温和环境中，经过2h释放80.9％捕获的ctcs。
68.将对比例1制得的fe3o4纳米颗粒进行ctcs的捕获及释放分析，具体分析方法为：将捕获细胞后的纳米颗粒转移至含有4mmol/l atp的无血清培养基中，在37℃摇床中孵育2h
后，在外加磁场下分离纳米颗粒，用pbs清洗纳米颗粒后，收集全部含有释放细胞的上清液，并采用血细胞计数板计数，计算释放效率(释放效率定义为上清液中释放的细胞数量/捕获细胞数量)。将所得结果和实施例1孵育2h的释放结果作图，结果见图5。
69.由图5可知，同样在atp为4mmol/l的温和环境中，经过2h释放，本发明制得的fe3o4@zif-8-pta纳米颗粒能够释放80.9％捕获的ctcs；而对比例1制得的fe3o4纳米颗粒只能释放很少捕获的ctcs。
70.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。