一种用于降低牛乳中乳清蛋白致敏性的酶解方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，涉及生物酶解技术降低乳清蛋白潜在致敏性的方法。


背景技术：

2.牛乳过敏是由牛乳中的蛋白质所引起不良免疫反应，可引起哮喘、湿疹、过敏性鼻炎、胃肠出血、腹泻等症状。因此，牛乳被认定为八大类主要过敏食物之一。牛乳富含30多种蛋白质，热加工容易导致乳蛋白变性，功能改变，营养成分流失；而非热加工处理可避免这些缺点，较好地能维持乳蛋白原有的感官品质和营养成分。在非热加工中，生物酶法水解工艺简单，技术成熟，可行性强。
3.生产低致敏奶粉采用的最多的方法是酶解法，该法对过敏原的作用主要是通过断裂蛋白肽键，将过敏蛋白水解成小分子肽段，降低其分子量，或是通过改变过敏原表位的三级结构和切除过敏原蛋白表面的一些表位作用，从而达到降低其致敏性的目的。目前此类配方奶粉的来源为国外乳品公司，我国尚未见低致敏乳产品销售。因此，国内消费者购买水解配方奶粉依赖于进口，且价格昂贵。所以，生产属于我国自己的低致敏配方奶粉已经是非常有必要了。


技术实现要素：

4.本发明的目的是建立一种用于降低乳清蛋白潜在致敏性的单一酶解方法。准确地对酶解后过敏原蛋白致敏性进行评估，实现精准降低乳清蛋白致敏性的技术。
5.本发明是通过以下技术方案实现的。
6.本发明建立了降低配方奶粉潜在致敏性的一种单一酶解方法。提供一种通过酶解条件的变化作用于乳清蛋白溶液，从而引起乳清蛋白中主要过敏原的结构变化，导致其潜在致敏性降低的方法。酶解过程包括酶解条件的优化及产物的致敏性评估。
7.本发明所述的一种用于降低乳清蛋白潜在致敏性的单一酶解方法，是通过以下步骤来实现：
8.(1)单一蛋白酶水解乳清粉溶液的制备：称取乳清粉以超纯水配成5％的乳清溶液，吸取乳清溶液于锥形瓶中，选取了木瓜蛋白酶对乳清进行水解。
9.(2)单因素实验摸索木瓜蛋白酶的最适酶解条件的选择，其单因素实验条件设计如下：
10.木瓜蛋白酶选取酶底比(％w/w)为：4％、6％、8％和10％；选取的时间梯度为0min、10min、20min、40min、80min、120min、180min和240min；温度t＝50℃，ph＝7.2。
11.通过对其产物进行tricine-sds-page，获得单一酶解最佳的水解条件，选择最适条件为e/s＝6％，ph＝7.2，t＝20min，t＝50℃。如表1所示。
12.表1木瓜蛋白酶水解乳清粉的最适条件及其水解度
13.14.(3)测定酶解后乳清的致敏性。
15.本发明采用酶解技术，通过酶解的方法对蛋白进行特异性位点切割，断裂蛋白肽键，将过敏蛋白水解成小分子肽段，降低其分子量，或是通过改变过敏原表位的三级结构和切除过敏原蛋白表面的一些表位作用，并利用体外特异性抗体和小鼠致敏模型，评估酶解后的蛋白的致敏性。
16.本发明建立的酶解方法，具有如下优点：可特异性切断不同过敏原的位点；致敏性评估首次系统评价酶解降低乳清致敏性的效果，目标准确，评价致敏性全面，确保酶解技术的精准实施。
附图说明
17.图1不同条件下酶解产物的tricine-sds-page；a：e/s＝4％，b：e/s＝6％，c：e/s＝8％，d：e/s＝10％；
18.图2乳清酶解产物的igg和ige结合能力变化；
19.图3小鼠血清中特异性ige、igg水平变化；
20.图4小鼠血清中组胺水平变化；
21.图5小鼠脾细胞中细胞因子il-4、il-5、il-13、ifn-γ水平；
22.具体实施方法
23.本发明通过以下实施例进一步说明，但本发明并不受其限制。
24.木瓜蛋白酶酶解后制备的奶粉的致敏性评估。
25.选取木瓜蛋白酶在e/s＝6％、ph＝7.2、t＝50℃的条件下进行水解20min。通过特异性抗体结合能力、并利用体外特异性抗体和小鼠致敏模型，进行系统评估。
26.具体实施过程包括如下步骤。
27.1、酶解产物制备方案：选择乳清酶解方案为木瓜蛋白酶在e/s＝6％、ph＝7.2、t＝50℃的条件下进行水解20min后，获得酶解产物。不同条件下酶解产物的tricine-sds-page如图1所示。
28.2、elisa检测：通过竞争抑制elisa方法来评价酶解产物的ige、igg结合能力；
29.经过酶解后乳清中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特异性ige、igg结合能力均显著下降。酶解产物的ige、igg结合能力如图2所示
30.3、小鼠致敏模型：建立乳清蛋白小鼠致敏模型，用市售商业化elisa试剂盒检测小鼠体内组胺和il-4、il-5、il-13、ifn-γ的含量；
31.小鼠血清中特异性ige、igg测定显示未水解组与空白组中，igg1存在极显著差异，为p＜0.01，而ige水平存在极特别显著差异，为p＜0.001；水解组与未水解组的igg1水平具有显著性差异，为p＜0.05，ige水平存在极显著差异，为p＜0.01，结果如图3所示。
32.小鼠血清中血清中组胺水平测定结果如图4所示，未水解乳清蛋白组相对于空白组和水解组，其有显著性增加(p＜0.05)；
33.脾细胞分泌细胞因子il-4、il-5、il-13、ifn-γ测定结果显示，水解乳清蛋白组相对于未水解组il-4含量出现了显著性下降(p＜0.05)，il-5、il-13含量出现了极其显著的下降(p＜0.001)；且这三种细胞因子中，未水解乳清蛋白组对比空白组出现，极其著性的升高(p＜0.001)；水解组的il-5、il-13相对于空白组出现了显著性升高，(p＜0.05)，而il-4
无显著性差异。由th1型细胞分泌的细胞因子inf-γ量中，水解组和未水解组相对于空白组都出现了显著性升高，分别为(p＜0.01)和(p＜0.001)，而水解组相对于未水解组呈现了较为显著性差异变化。测定结果如图5所示。
34.综上表明，乳清经过木瓜蛋白酶酶解后，致敏性降低显著。


技术特征：
1.一种用于降低牛乳中乳清蛋白致敏性的酶解方法，其特征是通过以下步骤实现：1)制备蛋白溶液，用超纯水将牛乳乳清粉稀释成5％的均匀乳清蛋白溶液；2)单因素实验确定木瓜蛋白酶的最适酶解条件，其单因素实验条件设计如下：木瓜蛋白酶选取酶底比为：6％(w/w)，ph＝7.2，t＝20min，t＝50℃；3)测定酶解后乳清的致敏性。

技术总结
本发明涉及一种用于降低牛乳中乳清蛋白致敏性的酶解方法，利用酶解技术降低牛乳过敏原α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的潜在致敏性，并借助竞争抑制性ELISA、小鼠致敏模型表征其结果，其特征是通过以下步骤实现：1)制备蛋白溶液；2)单因素实验确定木瓜蛋白酶的最适酶解条件；3)测定酶解后乳清的致敏性。本发明建立的酶解方法，具有如下优点：可特异性切断不同过敏原的位点；致敏性评估首次系统评价酶解降低乳清致敏性的效果，目标准确，评价致敏性全面，确保酶解技术的精准实施。确保酶解技术的精准实施。确保酶解技术的精准实施。


技术研发人员：张亿 胡巍 谭宏凯 熊子奕 黄美佳 黎晶晶 陈红兵 李欣
受保护的技术使用者：张亿
技术研发日：2022.04.30
技术公布日：2022/8/30