一种多肽及其在促进骨修复中的用途

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种可促进骨修复的人工合成多肽ks32。


背景技术：

2.骨缺损是一种常见的临床疾病，《中国骨质疏松白皮书》数据显示，我国每年新增骨损伤患者约300万人，给公众健康带来了巨大负担。骨缺损可能由多种原因引起，包括创伤、感染、肿瘤和衰老等。虽然骨组织具有强大的自我修复和重建再生能力，但尺寸较大的缺损，往往伴随着骨不连、功能障碍、愈合延迟，甚至不愈合等结局。此时，需要特殊的治疗方法进行干预，以恢复受损骨组织的结构和功能。
3.自体骨移植被认为是修复临界骨缺损的金标准，然而自体骨移植物的应用具有一定的局限性，其受到供体部位发病、供体来源缺乏和感染风险增加等问题的严重限制。异体骨移植(取自其他患者)可部分弥补自体骨的不足，提供一些生长因子，并具有骨诱导特性。但这种方法也面临着来源有限、伦理等一系列问题。目前，采用无机非金属或高分子材料支架的组织工程骨受到广泛关注，通过3d打印等个性化定制的支架材料能够很好的匹配缺损区域，利用其疏松多孔的结构引导细胞血管生成从而实现骨再生。然而组织工程骨高度依赖其搭载的种子细胞和细胞因子，以在体内募集和诱导修复细胞(如骨髓间充质干细胞bmsc)增殖和分化，从而形成新骨组织。目前fda批准的具有促进新骨形成的药物中，甲状旁腺素(pth)在高剂量摄入时可致骨肉瘤形成，骨形成蛋白(bmp2)的半衰期短，可引起异位骨形成、骨溶解和局部炎症反应。因而有效且安全的促进骨形成的因子仍有待开发。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，提供一种可促进骨修复的人工合成多肽。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.本发明提供了一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明的多肽含有32个氨基酸，氨基酸序列为kckchglsgscevktcwwskcrcvfhwccyvs，即lys cys lys cys his gly leu ser gly ser cys glu val lys thr cys trp trp ser lys cys arg cys val phe his trp cys cys tyr val ser，发明人将多肽命名为ks32，以下多肽均用此名。
8.本发明的多肽，其分子量为3758.64da。
9.本发明多肽ks32可采用常规的合成方法，如液相分段合成法、固相合成、生物合成法等，作为本发明所述多肽的优选实施方式，所述多肽采用固相多肽合成工艺合成多肽。进一步的，为确保生物安全性，本发明多肽的纯度≥95％，可使用hplc对产物进行纯化。
10.本发明多肽可用于骨损伤和/或骨修复。进一步的，适用于广泛的骨缺损适应症，如截断性骨缺损、骨相关创伤、肿瘤骨缺损等，可促进骨缺损修复和/或用于修复骨缺损。
11.ks32的设计来源于wnt3a配体蛋白上与细胞膜frizzled受体及lrp5/6共受体结合
的识别区段，该蛋白可激活经典wnt信号通路，激活膜内β-catenin入核，从而启动下游功能基因的转录。大量研究表明经典wnt信号通路参与调控成骨谱系细胞存活、增殖、分化的各个阶段，其主要功能包括：调控成骨前体细胞成骨向分化，促进成骨细胞增殖及提高成骨细胞和骨细胞的存活率。因此，基于ks32的体内实验数据，我们推测其可发挥类似wnt3a重组蛋白的作用，激活经典wnt信号通路所对应的骨修复作用。
12.发明所述多肽应用的优选实施方式，所述多肽应用的浓度为25～150μg/ml，优选100～150μg/ml，进一步优选为100μg/ml。
13.作为优选方案，本发明多肽ks32可与组织工程上可接受的载体联用来治疗骨损伤和/或骨修复。进一步的，本发明所述多肽ks32可以以任何形式负载在骨修复材料上，植入骨缺损部位。例如，多肽ks32可以负载在骨水泥中、也可以与骨修复水凝胶联用注射到骨损伤部位、以及可作为种植体表面涂层等。
14.ks32能够以组织工程支架搭载的作用方式，加速骨缺损区域的修复，促进骨再生。所述组织工程上可接受的载体通常意义上是指组织工程支架，进一步的，可适用于现有所有组织工程支架，包括可生物降解型的骨组织工程支架材料和非生物降解型的骨组织工程支架材料。
15.进一步地，通过构建大鼠颅骨缺损模型，将ks32植入骨缺损区域，4周及8周后取颅骨组织，使用micro-ct分析缺损区骨修复情况，通过扫描电镜(sem)观察缺损区新生组织断面形貌，使用能谱(eds)分析新生组织断面元素分布并分析各元素重量百分比(wt％)，进一步用组织切片、he及goldner染色观察组织学形态。结合micro-ct、sem、eds、he及goldner染色结果综合分析多肽成骨效果，相比于无效肽，多肽ks32可显著加速颅骨缺损修复，因此，说明其具有作为骨组织工程功能因子治疗骨缺损的潜力。
16.作为优选方案，多肽药物ks32能够吸引募集细胞进入支架材料内，促进矿化程度较高的纤维组织形成，完成缺损连接，从而加速骨缺损的修复和再生，经验证为骨组织工程的有效功能因子。
17.进一步的，本发明还公开了一种骨修复组合物，所述骨修复组合物含有治疗有效剂量的多肽ks32和组织工程上可接受的载体。
18.作为优选方案，本发明还公开了一种多肽支架，其包含多肽ks32。优选地，所述多肽支架为生物陶瓷、金属、碳基和可降解高分子复合材料等。
19.进一步的，所述可降解高分子复合明胶支架优选为：海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸及甲基丙烯酸酐化明胶(gelma)支架。
20.作为优选方案，本发明多肽支架中，ks32均匀分散在甲基丙烯酸酐化明胶(gelma)支架中。
21.作为优选方案，在多肽支架中，多肽ks32的浓度为25～150μg/ml，优选为100～150μg/ml，进一步优选为100μg/ml。
22.甲基丙烯酰化明胶(gelma)是一种光敏性生物材料，其粉末溶于水等液体时，可做到与功能因子均匀混合。gelma具有极好的操作性,可在光引发剂的作用下迅速交联形成三维结构。gelma具有良好的生物相容性，其结构上具有细胞黏附位点，可促进细胞的增殖迁移。
23.ks32修饰的gelma支架还可在模具辅助下或通过3d打印制备成任意外形，以贴合
缺损区形态的。通过改变gelma的取代度和浓度，可以灵活调整固化后的力学性能，使其具备一定的弹性、强度和支撑性，以恢复缺损骨的结构和部分功能。
24.本发明的有益效果:
25.1)本发明提供的多肽类药物ks32能够吸引并募集细胞进入骨修复材料(如支架等)，具有加速骨缺损的修复和再生的作用，可作为骨组织工程的功能因子。
26.2)本发明的多肽ks32可发挥类似wnt3a重组蛋白的作用，可激活经典wnt信号通路所对应的骨修复作用。
27.3)本发明提供的多肽ks32属小分子多肽，制备工艺简单，成本低，产量高，具有较高的转化价值和临床应用前景。
附图说明：
28.图1为多肽植入大鼠颅骨缺损4周及8周后各组micro-ct扫描三维重建图。
29.图2为多肽植入大鼠颅骨缺损4周及8周后各组缺损区热图及四等分截面图。
30.图3为多肽植入大鼠颅骨缺损4周及8周后各组缺损区新生组织骨体积分数(bv/tv)及骨密度(bmd)。
31.图4为多肽植入大鼠颅骨缺损4周后各组缺损区扫描电镜(sem)及能谱(eds)结果。
32.图5为多肽植入大鼠颅骨缺损8周后各组he及goldner染色结果。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。
34.实施例1多肽载体gelma水凝胶支架的制备
35.1.1gelma制备：2g明胶于60℃溶于10ml pbs后，加入125μl甲基丙烯酸酐(ma)搅拌2小时，加入40ml pbs终止反应，将反应液倒入12-14kda透析袋，去离子水透析，冻干机冻干，所得粉末即为gelma。
36.1.2多肽修饰：2g gelma冻干粉于60℃溶于10ml pbs中，按照0.1mg/ml的浓度添加多肽，将ks32与gelma溶液充分混匀，然后加入2.5％光引发剂lap，再次充分混匀。用移液枪吸取20μl上诉混合物注入聚四氟乙烯定制模具上直径为5mm的圆孔中，紫外灯照射1min，待材料固化后，将材料从孔板上分离下来，放置于冰上待用。对照组使用搭载有无效肽(control peptide)的gelma水凝胶支架。其中，ks32采取固相多肽合成工艺合成多肽，使用hplc对产物进行纯化，合成的多肽纯度为98.96％；无效肽的氨基酸序列为seq id no:2所示，即ckplrlskeehplk，无效肽同样采取固相多肽合成工艺合成多肽，使用hplc对产物进行纯化，合成的多肽纯度为96.25％(下述实施例中，如无特别声明，无效肽均为此氨基酸序列)。
37.实施例2多肽植入大鼠颅骨缺损后的骨修复效果
38.2.1动物模型：采用12周龄sd雄性大鼠，每只约320
±
20g，每组3只。使用2％戊巴比妥(按大鼠体重300g/ml比例注射)进行腹腔注射麻醉，取俯卧位，剃毛刀行头部备皮，碘伏消毒术区，一次性无菌孔巾铺在消毒区域。从鼻骨开始沿头顶部正中线纵行皮肤切口1.5-2.0cm，手术刀柄轻轻分离皮下组织，沿颅骨矢状缝整齐切开骨膜，钝性分离骨膜，充分暴露
顶骨、枕骨和部分额骨。颅顶骨中线两侧使用环钻各制备一个直径为5mm的圆形全层骨缺损，植入消毒好的材料。实验组植入搭载有多肽ks32的gelma支架材料，对照组植入搭载有无效肽的gelma支架材料。复位皮肤，缝合，再次消毒。
39.2.2组织取材：4周/8周后处死大鼠，取颅顶骨，4％多聚甲醛浸泡组织于4℃过夜固定，浸泡于pbs中保存。
40.2.3结果验证：使用micro-ct对颅骨游离标本进行扫描，扫描条件：70kvp，200μa，精度10μm。使用micro-ct自带分析软件进行三维重建及缺损区热图制作，使用mimics软件进行缺损区四等分点截面图制作，使用dataviewer和ctan软件分析缺损区新生组织骨体积分数(bv/tv)及骨密度(bmd)。
41.如图1颅骨缺损三维重建图显示：植入材料4周后，无效肽组缺损区几乎无新生组织形成，而多肽ks32显著促进缺损区新生组织形成。8周时，对照组于缺损边缘区域形成少量新生组织，而多肽ks32圆形缺损中形成大量新生组织且几乎覆盖整个缺损区。
42.如图2颅骨缺损区热图及四等分截面图显示：热图中无论4周还是8周，ks32组相比于对照组均有着更显著的新生组织形成，热图中黄色、蓝色、紫色线条分别标记截面位置，黄色、蓝色、紫色方框中图像为对应位置的截面图，蓝色箭头指示ks32成骨肽有明显成骨效果的截面，可见ks32在各个层次的截面上均展示出成骨效果。
43.如图3骨体积分数(bv/tv)及骨密度(bmd)分析结果显示：材料植入4周后，尽管平均值上ks32组有着更高的bv/tv值，但该值相比于无效肽对照组无显著统计学差异，而在8周时，ks32组bv/tv值显著高于对照组。无论是4周还是8周，ks32均显著提高缺损区新生组织骨密度(bmd)，且8周相比于4周进一步提高了骨密度。**p＜0.01。
44.上述实验结果显示，多肽ks32可以促进骨修复，具有加速骨缺损的修复和再生的作用。
45.实施例3多肽植入大鼠颅骨缺损4周后缺损区新生组织形貌和元素分析
46.3.1样品制备：多肽植入大鼠颅骨缺损4周后处死大鼠，取颅顶骨组织，4％多聚甲醛浸泡组织于4℃过夜固定，于pbs中保存。环氧树脂a液b液按照体积比2.5：1均匀混合，将组织样品包埋于环氧树脂中，过夜固化后，置于液氮中速冻，延着缺损中央将包裹组织的环氧树脂连同组织一起脆断，常温送样检测。
47.3.2结果验证：断面用扫描电镜(sem)观察形貌，放大倍数分别为400
×
和8000
×
，使用能谱(eds)进行断面元素分析，分析元素包括c、n、o、ca、p，计算各元素重量百分比(wt％)。
48.如图4的sem及eds结果显示：对照组断面(缺损中央)光滑平整，推测为凝胶支架形貌，即无新生组织形成。而实验组断面(缺损中央)凹凸不平，提示ks32组缺损区有进一步的新生组织(如骨组织)形成。通过eds分析各元素分布发现ks32组黄色标记的ca元素和紫色标记的p元素颜色更深含量更高，计算各元素重量百分比(wt％)，对照组ca元素含量仅为0.1％，而实验组ca含量为15.3％，对照组p元素含量仅为0.5％，而实验组p含量为8.7％，提示多肽ks32可显著促进ca、p元素沉积，能谱中ks32组ca(红色箭头)、p(绿色箭头)元素峰也展现出更高的波峰。
49.本实施例提示ks32多肽可体内促进ca、p元素沉积从而促进骨缺损修复组织的矿化。
50.实施例4多肽植入大鼠颅骨缺损8周后缺损区新生组织形态学观察
51.4.1样品制备：多肽植入大鼠颅骨缺损8周后处死大鼠，取颅顶骨组织，4％多聚甲醛浸泡组织于4℃过夜固定，组织浸泡在ph＝7.0浓度为12％的edta中，浸泡6周脱钙至骨头足够柔软。
52.4.2组织切片：组织脱水、石蜡包埋、切成厚度为6μm的组织切片。
53.4.3结果验证：组织切片在65℃温度下烘烤2小时，二甲苯及梯度乙醇脱蜡水化，he及goldner染色观察缺损区新生组织的组织学形态。
54.如图5的he及goldner染色结果显示：植入材料8周后，与无效肽组相比，多肽ks32可以很好地吸引募集细胞进入支架材料从而加速骨修复，缺损区未见明显支架材料存留，而是由矿化程度较高的纤维组织完成缺损修复。