一种胶体金法检测尿液中HIV-1和HIV-2抗体的试纸条的制作方法

一种胶体金法检测尿液中hiv-1和hiv-2抗体的试纸条
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，涉及一种检测尿液中hiv抗体的试纸条。


背景技术：

2.艾滋病自我检测，是个体在私下独自或在其信任的人陪伴下，自主采集样本、 检测、读取结果的过程。自我检测是现有艾滋病检测服务的重要补充，尤其对高危 人群，是一种可接受的、安全、准确、有效的方法。市面上的hiv检测试剂盒以血 液样本检测为主，需要专业的人员在专业的实验室采血检测，检测过程有创伤，由 于hiv经血液传播，易交叉感染。
3.目前研究已证实尿液中hiv病毒含量极低，且存在hiv抗体igg。但由于尿液 中抗体含量较低，所以上市的产品不多。葡萄球菌a蛋白(spa蛋白)能与人及多 种哺乳动物血清igg分子中的fc片段结合。能够聚集尿液中的igg是理想的载体。
4.spa蛋白为葡萄球菌表面蛋白，结构简单，分子相对较小，在与胶体金静电吸 附偶连时易脱落，导致标记效率低。据报道尿液中hiv抗体含量只有血液中的千分 之一。含量少，尿液检测相比于血液产品假阳率高。
5.hiv-1和hiv-2两个亚型的核酸相似率(nucleotide sequence identity)有55％,几 个主要蛋白质(gag,pol,env)的氨基序列相似率(amino acid sequence identity)有33％。 在检测时极易相互交叉。目前以上市的快诊试纸以不分型检测为主。


技术实现要素：

6.本发明的目的是克服现有技术中血检带来的感染和创伤，spa蛋白不易偶连胶 体金的难点，不能分型检测hiv-1和hiv-2的缺点，提供一种胶体金法检测尿液中 hiv-1和hiv-2抗体的试纸条，本产品制作简单，使用的葡萄球菌a蛋白胶体金偶 联物为显色物质，不需要独立c线，消除因独立c线引起的交叉和假阳，在提高产 品的特异性，同时减少了制备独立c线系统的操作，表现出了性能优、制作简单的 特点。为实现上述目的，本发明的技术方案是：
7.一种胶体金法检测尿液中hiv-1和hiv-2抗体的试纸条，其特征在于：所述试 纸条包含金标垫，包被有检测线和质控线的硝酸纤维膜，样品垫和滤纸；所述金标 垫，由spa蛋白标记稀释到工作浓度，喷涂到含有tris缓冲液浸泡处理过的聚酯膜 上烘干所得。
8.胶体金的大小和均一性直接影响产品的稳定性和灵敏度，发明人通过大量实验 制备出粒径约为40-60nm的胶体金。
9.为实现上述胶体金，使用了氯金酸、柠檬酸三钠和甘氨酸。甘氨酸起到减缓氯 金酸和柠檬酸三钠的反应速度，使得成型的金颗粒更均匀。同时甘氨酸帮助spa蛋 白稳定的偶连到金颗粒上，不易脱落。
10.spa蛋白标记方法为：以0.01-1m碳酸钾缓冲液调节胶体金ph在7.0-9.0， 10-20μg/ml金的比例加入spa蛋白,搅拌反应10-30分钟后，以0.1％-10％bsa进行 封闭，2-10度
10000rpm离心10-30min分钟，弃上清。沉淀复溶至原体积1-10％， 复溶液为含有磷酸氢二钠、bsa、casein、tween-20的50mm tris-hcl(ph7.0-8.5)缓 冲液。用于保护稳定spa标记液。
11.为了帮助spa胶体金偶联物固化在聚酯膜上，金标垫用于喷金液的聚酯膜使用 含有0.01％-1％bsa和0.1-2.5g/l葡聚糖40000的50mm tris-hcl(ph7.0-8.5)浸泡处理 并烘干。
12.本发明提供三条线的划膜方式，用于hiv-1和hiv-2分型检测的目的。
13.所述硝酸纤维膜的检测线包被能识别hiv-1抗体的gp41重组抗原和能识别 hiv-2抗体gp36抗原，质控线包被鸡抗spa蛋白。
14.hiv-1和hiv-2有33％氨基酸序列相同，因此二者极易交叉，目前上市产品以 二者合一的检测方式。目前hiv病毒以hiv-1型居多，对此本发明在进行划膜时采 用hivgp36在中间，hivgp41在最下面，在划膜浓度使用上尽量的降低二型的使用 量，同时划膜稀释液以含有磷酸氢二钠、bsa、casein、tween-20的50mmtris-hcl(ph7.0-8.5)缓冲液减少二者的非特异性结合。对照线采用鸡抗spa蛋白，划 膜稀释液为pbs。
15.优选的，所述硝酸纤维膜检测线包被的gp41重组抗原，使用浓度为0.8-2.5mg/ml； 硝酸纤维膜检测线包被的gp36重组抗原，使用浓度为0.4-2.5mg/ml；硝酸纤维膜控 制线包被鸡抗spa蛋白，使用浓度为0.8-2.5mg/ml。
16.尿液中主要成分为尿素，盐以及药物代谢物，这里面的盐极易破坏胶体金层析 试剂重点偶连胶体金，导致胶体金跑板失败，滞留在nc膜上，形成假阳。药物代 谢物也会阴性胶体金的稳定性，出现跑板失败。样品垫在试纸条中起到处理样本的 作用。本发明中的样品垫能很好的起到调剂ph，过滤大分子，无机盐的重要作用， 减少假阳。
17.所述样品垫处理方法为：玻璃纤维使用含有bsa、tween-20、1％s9和na2co3的50mm tris-hcl(ph7.0-8.5)缓冲液浸泡烘干处理。
18.具体的用量为：100ml 10-50mm ph为8.0tris-hcl缓冲液，tween-20的使用量 为1-10％，s9的使用量为0.1-1g，bsa的使用量为1-10％，0.01-2m na2co3。
19.本发明的样品垫，采用上述缓冲液体系处理，采用45度烘干12-24小时制备。
20.葡萄球菌a蛋白(spa蛋白)是存在于葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，能与 人及多种哺乳动物igg结合，尿液中的hiv抗体是以igg的形式存在，二者能够特 异性的结合，由于spa蛋白与人体尿液非同源，故无非特异性结合，因此无交叉假 阳。通过使用spa蛋白与胶体金偶连，以胶体金标记的spa蛋白制备胶体金结合物 垫，作为显色探针，在硝酸纤维素膜上分开包被gp41抗原和gp36抗原，作为检测 hiv 1型抗体和hiv 2型抗体的检测线。尿液中的hiv抗体与spa蛋白结合经过检 测线时与包被在nc膜中的gp41或gp36结合显色，达到分型检测的目的。同时采 用鸡抗spa作为控制线划膜原料，由于spa蛋白为菌类蛋白，消除了独立c线带 来的交叉和假阳。通过采用tris-hcl缓冲体系，加入s9，tween-20，na2co3处理 玻璃纤维烘干制备样品垫，很好的解决了尿液中盐离子和药物代谢物引起的假阳问 题。减少假阳，提高产品的准确度。
21.与现有技术相比，本发明有以下优势：
22.1.本发明创新性的采用尿液为样本，胶体金法检测尿液中的hiv抗体，避免了 血检带来的感染和创伤。
23.2.本发明创新性的采用葡萄球菌a蛋白作为特异性识别hiv抗体，能够富集尿 液中稀少的hiv抗体igg，提高了灵敏度。
24.葡萄球菌a与hiv包被抗体不同源，减少特异性的结合，降低假阳风险。
25.3.所述金标垫通过使用葡萄球菌a蛋白(spa蛋白)与胶体金偶连形成偶联物。 所述金标垫通过使用葡萄球菌a蛋白(spa蛋白)与胶体金偶连形成偶联物。本发 明创新性的采用鸡抗spa蛋白作为控制线，直接捕获胶体金偶连的spa蛋白，起到 质控作用，丢弃独立c线系统。减少独立c线带来的交叉和假阳，减少操作，降低 成本。
26.4.现有的技术很难做到hiv-1和hiv-2交叉，本发明通过调节划膜稀释液，调 整划膜位置减少二者交叉。
27.5.本发明减少假阳，提高产品的准确度，简化操作，降低成本。本发明不需要 其他设备，灵敏度高，操作简单，15分钟获得结果，使用尿液为样本，可用于大规 模筛查，也可用于个人自测，使用范围广。
28.6.本发明采用样品垫，金标垫，nc膜和滤纸四部分链接，样品垫起到处理样 品的作用，金标垫承载标记好的金标液，nc膜在检测线上包被检测hiv-1的特异性 抗原gp41和检测hiv-2的特异性抗原gp36.控制线上包被鸡抗spa多抗。滤纸其 吸收液体给予层析动力的作用，各部分功能清晰，组成方便。并且，所述样品垫通 过采用tris-hcl缓冲体系，加入s9，tween-20，na2co3处理玻璃纤维烘干制备， 很好的解决了尿液中盐离子和药物代谢物引起的假阳问题。
29.7.本发明采用的是以尿液为样本检测hiv-1和hiv-2抗体，完全采用无损伤检 测hiv，尿样不需要特殊处理，操作简单，判读简单，不需要设备和专业培训就能 完成自我检测。提高艾滋病检测的主动性，增强艾滋病检测的可及性和方便性。可 用于hiv大规模的初筛。
具体实施方式
30.下面通过具体实施方式，对本发明进行进一步的阐述
31.实施例1
32.取1l超纯水于烧杯中，放置到加热磁力搅拌器上中速搅拌，加热至90度时， 加入1ml 10％氯金酸，待溶液沸腾后加入1.45ml 10％柠檬酸三钠，持续加热15分钟 后，室温冷却，制备出60-80纳米的胶体金1。取1l超纯水于烧杯中，放置到加热 磁力搅拌器上中速搅拌，加热至90度时，加入1ml 10％氯金酸后快速加入0.008g甘 氨酸，待溶液沸腾后加入1.45ml 10％柠檬酸三钠，持续加热15分钟后，室温冷却， 制备出60-80纳米的胶体金2。
33.实施例2
34.以0.1m碳酸钾缓冲液调节胶体金1的ph在8.0，20μg/ml金的比例加入spa 蛋白，搅拌反应30分钟后，以10％bsa进行封闭，2-10度10000rpm离心10min分 钟，弃上清，沉淀复溶至原体积1％，复溶液为含有磷酸氢二钠、bsa、casein、tween-20的50mm tris-hcl(ph7.0-8.5)缓冲液。
35.实施例3
36.以0.1m碳酸钾缓冲液调节胶体金2的ph在8.0，20μg/ml金的比例加入spa 蛋白，搅拌反应30分钟后，以10％bsa进行封闭，2-10度10000rpm离心10min分 钟，弃上清，沉淀复溶
至原体积1％，复溶液为含有磷酸氢二钠、bsa、casein、 tween-20的50mm tris-hcl(ph7.0-8.5)缓冲液。
37.实施例4
38.处理聚酯膜使用含有0.01％bsa和2g/l葡聚糖40000的50mm tris-hcl(ph8.0)， 并加入1％(pvp-10)，0.1m络蛋白钠盐浸泡30min，45度烘干18小时。
39.实施例5
40.处理聚酯膜使用含有1％(pvp-10)、0.1m络蛋白钠盐的50mm tris-hcl(ph8.0)， 浸泡30min，45度烘干18小时。
41.实施例6
42.在进行划膜时采用0.5mg/ml hivgp36在中间，0.8mg/ml hivgp41在最下面，划 膜稀释液以含有0.1m磷酸氢二钠、0.01％bsa、0.1mcasein、1％tween-20的50mmtris-hcl(ph 8.0)缓冲液。对照线采用鸡抗spa蛋白，划膜稀释液为pbs。
43.实施例7
44.在进行划膜时采用0.5mg/ml hivgp36在中间，0.8mg/ml hivgp41在最下面。对 照线采用鸡抗spa蛋白。检测线和对照线划膜稀释液均为pbs。
45.实施例8
46.样品垫中的玻璃纤维使用100ml 10-50mm ph为8.0tris-hcl缓冲液，1％ tween-20，1％s9，1％bsa，0.01m na2co3,1％pvp-10,1m络蛋白钠盐缓冲液浸 泡30min后。45度烘干18小时。
47.实施例9
48.样品垫中的玻璃纤维使用100ml 10-50mm ph为8.0tris-hcl缓冲液，1％pvp-10， 1m络蛋白钠盐缓冲液浸泡30min后。45度烘干18小时。
49.实施例10不同胶体金标记效果对比
50.将实施例2.4.6.8组装做成试纸条1使用企业阳性质控品和阴性尿液测试
51.将实施例3.4.6.8组装做成试纸条2使用企业阳性质控品和阴性尿液测试
52.测试结果见表1：
53.样本类型试纸条1色度试纸条2色度hiv-1强阳参考品g10*3g10*3hiv-1中阳参考品g4*1/g4.5*2g5*3hiv-1弱阳参考品g2.5*2/g3*1g4*1/g3.5*2hiv-1重复性参考品g3.5*1/g3*1/g2*1g4*2/g4.5*1hiv-2强阳参考品g10*3g10*3hiv-2中阳参考品g3.5*1/g3*2g4*3hiv-2弱阳参考品g1.5*2/g2*1g3*3hiv-2重复性参考品g3*2/g2*1g3*3n1g0*3g0*3n2g0*3g0*3n3g0*3g0*3n4g0*3g0*3
n5g0*3g0*3
54.色度数字越大表明显色越强。
55.结果试纸条2是使用含有甘氨酸的胶体金制备的，在测试弱阳性参考品显色色 度更高，说明灵敏度更高。试纸条2在测试重复性参考品时均一性上表现更好。均 一性不好可能原因为金颗粒表面的spa蛋白不均匀，有脱落的可能，含有甘氨酸的 胶体金使spa蛋白与金颗粒结合更稳定，跑板更均匀。
56.实施例11不同聚酯膜处理方式效果对比
57.将实施例3.4.6.8组装做成试纸条3使用企业阳性质控品和阴性尿液测试
58.将实施例3.5.6.8组装做成试纸条4使用企业阳性质控品和阴性尿液测试
59.测试结果见表2：
[0060][0061][0062]
色度数字越大表明显色越强。
[0063]
结果试纸条4，在测试hiv-1阳性参考品时hiv-2出现了显色，二者存在交叉。 试纸条3在测试阳性参考品时没有出现交叉线条。说明实施例4中聚酯膜处理溶液 可以消除两个亚型之间的交叉现象。
[0064]
实施例12不同划膜液效果对比
[0065]
将实施例3.4.6.8组装做成试纸条5使用企业阳性质控品和阴性尿液测试
[0066]
将实施例3.4.7.8组装做成试纸条6使用企业阳性质控品和阴性尿液测试
[0067]
测试结果见表3：
[0068][0069]
色度数字越大表明显色越强。
[0070]
结果试纸条6，在测试hiv-1阳性参考品时hiv-2出现了显色，二者存在交叉。 hiv-2出现了假阳，试纸条5在测试阳性参考品时没有出现交叉线条。说明实施例6 中划膜稀释液可以消除两个亚型之间的交叉现象和假阳。
[0071]
实施例13不同样品垫处理方式效果对比
[0072]
将实施例3.4.6.8组装做成试纸条7使用企业阳性质控品和阴性尿液测试
[0073]
将实施例3.4.6.9组装做成试纸条8使用企业阳性质控品和阴性尿液测试
[0074]
测试结果见表4：
[0075][0076]
色度数字越大表明显色越强。
[0077]
结果试纸条8，在测试hiv-1阳性参考品时hiv-2出现了显色，二者存在交叉。 hiv-1和hiv-2都出现了假阳，试纸条7在测试阳性参考品时没有出现交叉线条。 说明实施例8中玻璃纤维处理液处理的样品垫可以消除两个亚型之间的交叉现象和 假阳。且不影响试纸条的灵敏度。
[0078]
效果确认
[0079]
1.国家参考品测试
[0080]
本发明的制作的试纸条7测试人类免疫缺陷病毒抗体尿液来源于国家参考品中 国食品药品检定研究所批号为220020-2005041502，结果如表5：
[0081][0082]
结果表明试纸条7检测人类免疫缺陷病毒抗体尿液国家参考品灵敏度为100％， 特异性为100％，符合中国食品药品检定研究所检测标准。
[0083]
2.本发明的制作的试纸条7临床样本测试
[0084]
从某hiv定点医院获得经免疫印迹确诊的hiv样本20例(测试结果见表6)， 和本公司内部收集100例阴性尿液样本(体检报告确认为hiv阴性人群，包括免疫 性疾病，感冒等非艾滋人群样本)(测试结果见表7)
[0085]
表6：
[0086]
阳性样本hiv-1hiv-2阳性样本hiv-1hiv-21g10g011g6g02g6g012g5g03g6g013g10g04g7g014g10g05g7g015g8g06g5g016g8g07g8g017g9g08g8g018g7g09g7g019g10g010g8g020g10g0
[0087]
表7：
[0088]
[0089][0090]
[0091]
临床结果汇总见表8：
[0092][0093]
结果显示，小批量的临床样本测试显示，阳性符合率100％，阴性符合率100％， 满足预期要求。也说明了本发明能够有效的消除减少假阳，提高产品的准确度
[0094]
本发明减少假阳，提高产品的准确度，简化操作，降低成本。本发明不需要其 他设备，灵敏度高，操作简单，15分钟获得结果，使用尿液为样本，可用于大规模 筛查，也可用于个人自测，使用范围广。