一种通过G-四链体DNA二聚检测钾离子浓度的方法

一种通过g-四链体dna二聚检测钾离子浓度的方法
技术领域
1.本技术涉及一种通过g-四链体dna二聚检测钾离子浓度的方法，属于离子检测领域。


背景技术：

2.钾离子是细胞和组织中含量最丰富的阳离子之一，在很多代谢过程中起到非常重要的作用。在健康人类的细胞中，细胞内和细胞外钾离子浓度大约是140mm和10mm。钾离子的紊乱和不平衡可能会产生多种疾病。例如，癌症细胞外的钾离子浓度可以提高到40mm。因此，检测钾离子的浓度对于人体健康以及动植物的生长都具有非常重要的作用。


技术实现要素：

3.根据本技术的一个方面，提供了一种基于g-四链体dna的二聚体的结构检测钾离子浓度的方法，该方法能够在li

,na

,rb

,cs

,mg
2
,ca
2
,sr
2
,ba
2
,cr
3
,mn
2
,co
2
,ni
2
,zn
2
等多种阳离子存在的条件下仍旧适用，同时对于温度高达45℃的条件下仍旧适用。
4.所述的检测钾离子浓度的方法，包括下述步骤：
5.(1)向待测溶液中加入dna，放置时间i后加入氯化血红素，再放置时间ii得到溶液体系i；
6.(2)向溶液体系i加入2，2
’‑
联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(abts)，最后加入双氧水(h2o2)，反应得到溶液体系ii；
7.(3)测量所述溶液体系ii在414nm处的吸光度，根据吸光度计算反应活性，根据绘制的标准曲线计算待测溶液中钾离子的浓度。
8.可选地，步骤(3)中所述的标准曲线包括钾离子浓度与反应活性的标准曲线；
9.可选地，所述钾离子浓度与反应活性的标准曲线是采用至少4个已知钾离子浓度缓冲溶液作为样品，检测荧光强度后计算反应活性，绘制得到。
10.可选地，所述计算反应活性所用的公式为：
[0011]v0
＝(|dc|)/dt＝(|da|)/(dt
×b×
ε)；
[0012]
其中，c为产物的实际浓度，t为反应时间，b是光路长度，ε是摩尔消光系数。
[0013]
可选地，所述缓冲溶液为羟乙基哌啶乙磺酸(hepes)溶液。
[0014]
可选地，所述羟乙基哌啶乙磺酸(hepes)溶液的ph＝7～8。
[0015]
优选地，所述羟乙基哌啶乙磺酸(hepes)溶液的ph＝7.5。
[0016]
可选地，所述dna为单链。
[0017]
可选地，所述单链dna的序列是5
’‑
ttaggg-3’。
[0018]
可选地，所述单链dna可以形成g-四链体dna的二聚体。
[0019]
可选地，所述的单链dna浓度为4～100μm。
[0020]
优选地，所述的单链dna浓度为4μm。
[0021]
可选地，所述氯化血红素的浓度为0.1～200μm。
[0022]
优选地，所述氯化血红素的浓度为0.1μm。
[0023]
可选地，所述氯化血红素所述单链dna的摩尔比为1:40～1:2。
[0024]
优选地，所述氯化血红素所述单链dna的摩尔比为1:40。
[0025]
可选地，所述溶液体系i中还含有曲拉通x-100。
[0026]
可选地，所述曲拉通x-100的溶液体积分数为0.01～0.1％。
[0027]
优选地，所述曲拉通x-100的溶液体积分数为0.05％。
[0028]
可选地，所述2，2
’‑
联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(abts)的浓度为0.1-10mm。
[0029]
优选地，所述2，2
’‑
联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(abts)的浓度为2mm。
[0030]
可选地，所述2，2
’‑
联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(abts)与所述氯化血红素的摩尔比为1000:1～100000:1。
[0031]
优选地，所述2，2
’‑
联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(abts)与所述氯化血红素的摩尔比为2000:1。
[0032]
可选地，所述h2o2的浓度为0.1～10mm。优选地，所述h2o2的浓度为1mm。所述h2o2与氯化血红素的摩尔比为1000:1～100000:1。
[0033]
优选地，所述h2o2与氯化血红素的摩尔比为10000:1。
[0034]
可选地，所述时间i为1～48h，所述时间ii为0.5～24h。
[0035]
优选地，所述时间i为24h，所述时间ii为0.5h。
[0036]
可选地，所述反应时间为0.5～5min。
[0037]
优选地，所述反应时间为1min。
[0038]
可选地，所述反应的温度为20～45℃。
[0039]
优选地，所述反应的温度为25℃。
[0040]
可选地，所述钾离子的检测范围在10～200mm。
[0041]
本技术中，所述钾离子来源于氯化钾。
[0042]
本技术中，所述待测样品可为人或动物的血液或细胞内液等。
[0043]
本技术中，形成所述g-四链体dna二聚体的序列是：5
’‑
ttaggg-3’；所述溶液体系i为g-四链体dna体系；所述溶液体系ii为g-四链体-氯化血红素dna酶的体系；
[0044]
本技术中，所述g-四链体dna体系的配置时间为一天，g-四链体-氯化血红素dna酶的体系的配置时间为0.5h，反应时间为1min，计算反应速率选取反应前10s。
[0045]
本技术能产生的有益效果包括：
[0046]
1)本技术所提供的通过g-四链体dna二聚检测钾离子浓度的方法，利用了g-四链体dna二聚体的特殊结构，具有创新性。
[0047]
2)本技术所提供的通过g-四链体dna二聚检测钾离子浓度的方法，可以根据构筑的dna酶的活性对应检测出10～200mm范围内的钾离子浓度，具有更广的钾离子检测范围。
[0048]
3)本技术所提供的通过g-四链体dna二聚检测钾离子浓度的方法，能够在li

,na

,rb

,cs

,mg
2
,ca
2
,sr
2
,ba
2
,cr
3
,mn
2
,co
2
,ni
2
,zn
2
等多种阳离子存在的条件下仍旧适用，同时对于温度高达45℃的条件下仍旧适用。
附图说明
[0049]
图1为标准溶液样品中钾离子浓度为10～200mm，温度在25℃时，钾离子浓度与反应活性的标准曲线。
[0050]
图2为标准溶液样品中钾离子浓度为10～200mm，温度在20～45℃时，钾离子浓度与反应活性的标准曲线。
具体实施方式
[0051]
下面结合实施例详述本技术，但本技术并不局限于这些实施例。
[0052]
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下列实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]
下述实施例中用于测量吸光度的仪器为岛津(shimadzu)紫外可见分光光度计uv-2450，配备温度控制装置。形成g-四链体的dna购自于上海生工生物科技有限公司。
[0054]
本技术的实施例中反应活性计算如下：
[0055]
反应活性v0＝(|dc|)/dt＝(|da|)/(dt
×b×
ε)
[0056]
式中：c为产物的实际浓度，t为反应时间，b为光路长度(1.0cm)，ε为摩尔消光系数(对于abts作为底物来说，ε＝36000m-1
cm-1
)。
[0057]
实施例1
[0058]
验证钠离子大量存在对钾离子浓度测量无干扰，测量含有100mm氯化钾和140mm氯化钠样品的活性。在本实施例中使用的能够形成二聚g-四链体的dna序列为：5
’‑
ttaggg-3’。
[0059]
(1)配置标准溶液dna酶
[0060]
将dna样品溶解于20μl含有不同氯化钾浓度梯度的超纯水中，配置浓度为400μm的单链dna母液，放置一天形成不同二聚程度的g-四链体结构。向0.8ml的40mm ph＝7.5的hepes缓冲溶液中加入不同体积3m的氯化钾溶液稀释成10～200mm不同浓度梯度钾离子的溶液，分别向每个浓度梯度的钾离子溶液中加入10μl对应钾离子条件下配置的g-四链体溶液，继续向其中加入2μl 100μm的氯化血红素溶液和1μl曲拉通x-100，最后加超纯水定容得到1ml，放置0.5小时，得到一系列含有不同浓度钾离子的g-四链体-氯化血红素dna酶的体系。
[0061]
(2)配置待测溶液dna酶
[0062]
将dna样品溶解于20μl待测液中，本实施例的待测液含有100mm氯化钾和140mm氯化钠，配置浓度为400μm的单链dna母液，放置一天形成不同二聚程度的g-四链体结构。接下来与步骤(1)相同，向0.8ml的40mm ph＝7.5的hepes缓冲溶液中加入33.33μl 3m的氯化钾和33.33μl 3m的氯化钠溶液稀释成100mm钾离子和100mm钠离子，向溶液中加入10μl配置的g-四链体溶液，继续向其中加入2μl 100μm的氯化血红素溶液和1μl曲拉通x-100，最后加超纯水定容得到1ml，放置0.5小时，得到含有100mm钾离子和100mm钠离子的g-四链体-氯化血红素dna酶的体系。
[0063]
(3)标准溶液和待测溶液的配置
[0064]
取600μl步骤(1)和(2)的dna酶溶液，取24μl 50mm的abts底物溶液加入混合后，随后加入0.6μl 1m的h2o2溶液，启动反应，反应1分钟。
[0065]
(4)标准曲线的制备
[0066]
测量所述标准溶液样品在414nm处的吸光度，计算反应前10秒的反应初始速率v0，绘制钾离子浓度与反应初始速率v0的标准曲线，如图1。
[0067]
(5)待测样品检测
[0068]
测试所述待测样品在414nm处的吸光度，计算待测样品的反应前10秒初始速率，与标准曲线中的初始速率v0进行比较，得到实际样品中钾离子的浓度。计算得出反应初始速率为278nm/s,对应标准曲线中钾离子浓度为92mm，与实际溶液中钾离子浓度100mm吻合。
[0069]
实施例2
[0070]
验证锂离子存在对钾离子浓度测量无干扰，测量含有100mm氯化锂和100mm氯化钾样品的活性。
[0071]
实验方法同实施例1，区别仅在于待测溶液中含有100mm氯化锂和100mm氯化钾。实际样品检测得出的初始反应速率为303nm/s,对应标准曲线中钾离子浓度为108mm，与实际浓度中钾离子浓度100mm吻合。
[0072]
实施例3
[0073]
验证铷离子存在对钾离子浓度测量无干扰，测量含有100mm氯化铷和100mm氯化钾样品的活性。
[0074]
实验方法同实施例1，区别仅在于待测溶液中含有100mm氯化铷和100mm氯化钾。实际样品检测得出的初始反应速率为275nm/s,对应标准曲线中钾离子浓度为91mm，与实际浓度中钾离子浓度100mm吻合。
[0075]
实施例4
[0076]
验证镁离子存在对钾离子浓度测量无干扰，测量含有10mm氯化镁和100mm氯化钾样品的活性。
[0077]
实验方法同实施例1，区别仅在于待测溶液中含有10mm氯化镁和100mm氯化钾。实际样品检测得出的初始反应速率为298nm/s,对应标准曲线中钾离子浓度为105mm，与实际浓度中钾离子浓度100mm吻合。
[0078]
实施例5
[0079]
验证锶离子存在对钾离子浓度测量无干扰，测量含有10mm氯化锶和100mm氯化钾样品的活性。
[0080]
实验方法同实施例1，区别仅在于待测溶液中含有10mm氯化锶和100mm氯化钾。实际样品检测得出的初始反应速率为282nm/s,对应标准曲线中钾离子浓度为95mm，与实际浓度中钾离子浓度100mm吻合。
[0081]
实施例6
[0082]
验证锰离子存在对钾离子浓度测量无干扰，测量含有100μm氯化锰和100mm氯化钾样品的活性。
[0083]
实验方法同实施例1，区别仅在于待测溶液中含有100μm氯化锰和100mm氯化钾。实际样品检测得出的初始反应速率为294nm/s,对应标准曲线中钾离子浓度为102mm，与实际浓度中钾离子浓度100mm吻合。
[0084]
以上所述，仅是本技术的几个实施例，并非对本技术做任何形式的限制，虽然本技术以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本技术，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱
离本技术技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。