耐超高温多聚半乳糖醛酸酶McPG28A及其制备方法

耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a及其制备方法
技术领域
1.本发明属于基因工程和遗传工程领域，尤其涉及一种耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a及其制备方法。


背景技术：

2.果胶是自然界中结构最复杂的多糖之一，广泛分布于高等植物的根茎叶和果实等细胞壁中。果胶多糖是共价连接的富含半乳糖醛酸（gala）的酸性多糖（d-gala约占果胶总量的70%），所有的果胶多糖均在d-gala 的o-1 和o-4 位置通过α-1,4-糖苷键相连，形成果胶的主链，即同聚半乳糖醛酸。
3.果胶酶是分解果胶多糖的不同种类碳水化合物酶的一个统称，主要通过解聚（水解酶和裂解酶）和脱酯化（酯酶）反应催化果胶多糖的降解，其中多聚半乳糖醛酸酶是研究最多应用最广的果胶酶。多聚半乳糖醛酸酶在植物、真菌、细菌和少数昆虫的生命活动中起着重要作用，其主要来源于真菌，如曲霉属（aspergillus sp.）、青霉属（penicillium sp.）、根霉属（rhizopus sp.）、镰刀菌属（fusarium sp.）和地丝菌属（geotrichum sp.）等。多聚半乳糖醛酸酶属于糖苷水解酶第28 家族（gh28），它可以随机的特异性的切断果胶主链内部（hg）非酯化半乳糖醛酸间的α-1,4-糖苷键，从而使高聚合度的果胶发生解聚，在食品、废水处理、动物饲料、造纸和纸浆、果汁以及纺织工业中应用广泛。然而，现有商业化多聚半乳糖醛酸酶，在温度高于50℃时普遍存在热稳定性差的问题。


技术实现要素：

4.本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a及其制备方法。
5.本发明的技术解决方案是：一种耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a，氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.一种上述耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a的制备方法，将dna序列如seq id no.2所示的基因克隆入重组表达载体，转化入宿主细胞进行培养并筛选提取重组表达质粒；将所提取的重组表达质粒转化入表达菌株内，培养菌株得到菌种；将所收集的菌种进行扩大培养，经博莱霉素诱导后高速离心收集上清液；将上清液浓缩、纯化，收集纯化液，即获得重组表达的耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a。
7.本发明的耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a热稳定性好，经沸水浴15 min仍具有高效降解果胶多糖活性，可有效提高分解果胶多糖的效果。
附图说明
8.图1是本发明实施例耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a诱导表达96 h后的sds-page图。
9.图2是本发明实施例耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a对聚半乳糖醛酸降解产
物的hpaec-pad分析图谱。
10.图3是本发明实施例耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a对聚半乳糖醛酸降解产物的esi-ms分析图谱。
具体实施方式
11.本发明是将来源于卷枝毛霉（mucor circinelloides）的基因序列采用genbank数据库中的basic local alignment search tool (blast )分析，dnaman软件进行多序列比对，vector nti分析序列信息。加his标签和密码子优化，人工合成获得如seq id no.2所示的基因，属于糖苷水解酶第28 家族（gh28）。该基因编码区长1086bp，序列从第1-1065位为编码具有耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a活性的dna序列，1066-1086位为his-tag标签和终止密码子的dna序列。将该基因序列构建到ppiczαa真核表达载体上，在大肠杆菌top10中扩增后提取质粒，用saci进行线性化，胶回收线性化产物，电击转化至毕赤酵母x-33感受态细胞中，涂布在含100 μg/ml博来霉素的固体ypdsz培养基上，30℃培养5天，挑取单克隆，使用真菌通用引物进行菌落pcr验证。pcr反应条件为：94 ℃ 2 min，1个循环；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 5 min，1个循环。挑选验证正确的单菌落菌株划ypdz培养基（300 μg/ml博来霉素），进行高浓度抗生素筛选，挑选单菌落生长较大的菌株按毕赤酵母表达手册方法进行诱导表达。
12.诱导表达96 h后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a的表达及纯化情况，电泳图结果如图1所示，耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a在电泳胶上呈现单一条带。
13.最后将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液，即获得重组表达的耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a。氨基酸序列如seq id no.1所示，从氨基端开始的第1-361位氨基酸残基序列，其中1-355位为具有耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a活性的氨基酸序列，356-361位为his-tag的氨基酸标签序列。该蛋白质理论分子量为37 kda，等电点为7.15。
14.实验：本发明实施例的耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a降解聚半乳糖醛酸的产物分离实验。
15.在35℃的条件下，以500 μl，ph=5.0的0.5 %（w/v）的聚半乳糖醛酸为底物，分别加入50 μl本发明实施例耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a和经过沸水浴15 min的本发明耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a，700 rpm震荡反应21h。对其降解产物进行hpaec-pad和esi-ms分析，其结果分别如图2和图3所示。结果表明：沸水浴15 min的耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a仍可以高效降解聚半乳糖醛酸，其降解产物为寡聚半乳糖醛酸，主要由dp1、dp2、dp3、dp4、dp5、dp6、dp7和dp8组成；在进行esi-ms的阴离子模式分析其降解产物时，同时形成断裂的寡糖碎片，其m/z分别为291、467、643、819。基于以上实验结果说明本发明实施例所得到的多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a为嗜热耐超高温的多聚半乳糖醛酸重组酶。


技术特征：
1.一种耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a，其特征在于氨基酸序列如seq id no.1所示。2. 一种如权利要求1所述耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a的制备方法，其特征在于：将dna序列如seq id no.2所示的基因克隆入重组表达载体，转化入宿主细胞进行培养并筛选提取重组表达质粒；将所提取的重组表达质粒转化入表达菌株内，培养菌株得到菌种；将所收集的菌种进行扩大培养，经博莱霉素诱导后高速离心收集上清液；将上清液浓缩、纯化，收集纯化液，即获得重组表达的耐超高温多聚半乳糖醛酸酶mcpg28a。

技术总结
本发明公开一种耐超高温多聚半乳糖醛酸酶McPG28A，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，制备方法是将DNA序列如SEQ ID NO.2所示的基因克隆入重组表达载体，转化入宿主细胞进行培养并筛选提取重组表达质粒；将所提取的重组表达质粒转化入表达菌株内，培养菌株得到菌种；将所收集的菌种进行扩大培养，经博莱霉素诱导后高速离心收集上清液；将上清液浓缩、纯化，收集纯化液，即获得重组表达的耐超高温多聚半乳糖醛酸酶McPG28A。所制备的耐超高温多聚半乳糖醛酸酶McPG28A热稳定性好，经沸水浴15 min仍具有高效降解果胶多糖活性，可有效提高分解果胶多糖的效果。胶多糖的效果。胶多糖的效果。


技术研发人员：杨国军 王华 丛玉婷 谷晶 王丽 陈炜 卢亚楠
受保护的技术使用者：大连海洋大学
技术研发日：2021.02.22
技术公布日：2022/8/29