预测胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物及其应用

1.本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及预测胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物及其应用，更具体地，涉及hla-b在作为预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物的用途、计算机可读存储介质、电子设备、hla-b的趋异进化指数在预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效中的用途、预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的方法、对人群进行划分的方法、预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的系统、用于预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的试剂盒。


背景技术：

2.免疫检查点抑制剂(icb)，包括靶向程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡配体1(pd-1/pd-l1) 或抗细胞毒t淋巴细胞相关抗原-4的免疫检查点抑制疗法的出现，给晚期转移性肿瘤患者的治疗带来了新的希望和选择。然而，在胃肠肿瘤的icb治疗中，仅有小部分患者对icb治疗应答。在临床实践中，筛选能够预测胃肠肿瘤患者对icb治疗疗效的分子标志物，对制定个体化的胃肠肿瘤免疫治疗策略，提升患者获益具有重要的临床意义和价值。已有研究主要聚焦于肿瘤细胞的内在特性，包括肿瘤突变负荷和微卫星不稳定/错配修复状态，以及反映免疫表型的性质，如pd-l1表达和免疫细胞浸润程度等。然而，针对种系遗传学如何影响icb治疗胃肠道癌的疗效研究较少。
3.理论上，免疫治疗应答的基础是肿瘤免疫原性，肿瘤免疫原性主要取决于肿瘤的抗原性和抗原提呈的效率。人类白细胞抗原i类(hla-i)分子在肿瘤源性新抗原的细胞表面呈递是t细胞识别的关键过程。 hla基因作为人类基因组中最具多态性的基因，具有遗传背景，在宿主免疫应答中起着重要作用。hla 基因的变异可能会塑造新肽序列库，并在它们的持续相互作用中影响t细胞受体序列库。既往研究表明， hla-i基因型和hla-i等位基因之间的序列差异与黑色素瘤和非小细胞肺癌的免疫治疗效果有关。因此，有必要进一步研究hla-i基因型和hla-i等位基因之间的序列差异与肿瘤免疫治疗检查点抑制剂治疗之间的关系。


技术实现要素：

4.本技术是基于发明人对以下问题的发现和认识作出的：
5.已有研究表明，杂合hla-i基因型在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤发展中具有杂合优势， hla的趋异进化指数(hed)可以反映机体hla分子与抗原肽结合域的序列多样性。发明人经过大量实验探索，发现hed指数高的对象体内，能够结合更多的抗原肽提呈给t细胞诱导免疫应答，所以给予免疫治疗后疗效较好，当所述hla-b的hed指数在一定范围内时可以准确预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效。
6.因此，在本发明的第一方面，本发明提出了hla-b在作为预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物的用途。hla是抗原肽呈递过程中非常重要的蛋白分子，t细胞是抗肿瘤免疫的主要介质，当t细胞特异性识别肿瘤细胞上hla i类分子所呈现的抗原肽时，t
细胞被激活并杀死肿瘤细胞，但由于肿瘤部位存在抑制信号，使得肿瘤特异性t细胞功能失调，若待预测对象体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类越多，所述hla-b分子就可将多种抗原肽提呈给t细胞，从而诱导机体的免疫应答，该部分患者通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，即可使t细胞恢复活力，杀死肿瘤细胞，提高临床疗效，若待预测对象体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类较单一，所述hla-b分子仅可将单一抗原肽提呈给t细胞，该部分患者即使通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，也无法使t细胞恢复活力，免疫检查点抑制剂治疗效果不佳。因此，根据本发明的实施例的hla-b分子可以作为标志物用于准确预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
7.在本发明的第二方面，本发明提出了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述程序用于预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效。根据本发明的实施例，该程序被处理器执行时获得 hla-b的趋异进化指数。根据本发明实施例的可读存储介质可以准确获得hla-b的趋异进化指数，所述hla-b的趋异进化指数可以有效预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
8.在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的电子设备。根据本发明的实施例，包括：第二方面所述的计算机可读存储介质；以及一个或者多个处理器，用于执行所述计算机可读存储介质中的程序。根据本发明实施例的电子设备能够利用所述处理器执行所述计算机可读存储介质中的程序，从而准确获得hla-b的趋异进化指数，所述hla-b的趋异进化指数可以有效预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
9.在本发明的第四方面，本发明提出了hla-b的趋异进化指数在预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效中的用途。hla是抗原肽呈递过程中非常重要的蛋白分子，当t细胞特异性识别肿瘤细胞上hlai类分子所呈现的抗原肽时，t细胞被激活并杀死肿瘤细胞，但由于肿瘤部位存在抑制信号，使得肿瘤特异性t细胞功能失调，hed指数可以反映机体hla分子与抗原肽结合域的序列多样性，hed指数越高体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类越多，所述hla-b分子就可将多种抗原肽提呈给t细胞，从而诱导机体的免疫应答，该部分患者通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，即可使t细胞恢复活力，杀死肿瘤细胞，提高临床疗效；若待预测对象hed指数较低，体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类较单一，所述hla-b分子仅可将单一抗原肽提呈给t细胞，该部分患者即使通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，也无法使t细胞恢复活力，免疫检查点抑制剂治疗效果不佳。因此，根据本发明的实施例的hla-b的趋异进化指数可以准确预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
10.在本发明的第五方面，本发明提出了一种预测对象免疫检查点抑制剂疗效的方法。根据本发明的实施例，包括：基于待测对象核酸样品的hla-b趋异进化指数，判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效。当t细胞特异性识别肿瘤细胞上hla i类分子所呈现的抗原肽时，t细胞被激活并杀死肿瘤细胞，但由于肿瘤部位存在抑制信号，使得肿瘤特异性t细胞功能失调，hed指数可以反映机体hla 分子与抗原肽结合域的序列多样性，hed指数越高体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类越多，所述 hla-b分子就可将多种抗原肽提呈给t细胞，从而诱导机体的免疫应答，该部分患者通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，即可使t细胞恢复活力，杀死肿瘤细胞，提高临床疗效；若待预测对象 hed指数较低，体内所
述hla-b分子结合的抗原肽种类较单一，所述hla-b分子仅可将单一抗原肽提呈给t细胞，该部分患者即使通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，也无法使t细胞恢复活力，免疫检查点抑制剂治疗效果不佳。因此，根据本发明的实施例的方法可以准确预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
11.在本发明的第六方面，本发明提出了一种对人群进行划分的方法。根据本发明的实施例，包括：基于所述人群中每个个体核酸样品的hla-b趋异进化指数，对人群中适于或不适于免疫检查点抑制剂治疗的个体进行划分。当t细胞特异性识别肿瘤细胞上hla i类分子所呈现的抗原肽时，t细胞被激活并杀死肿瘤细胞，但由于肿瘤部位存在抑制信号，使得肿瘤特异性t细胞功能失调，hed指数可以反映机体hla分子与抗原肽结合域的序列多样性，hed指数越高体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类越多，所述hla-b分子就可将多种抗原肽提呈给t细胞，从而诱导机体的免疫应答，该部分个体通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，即可使t细胞恢复活力，杀死肿瘤细胞，提高临床疗效；若待预测对象hed指数较低，体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类较单一，所述hla-b分子仅可将单一抗原肽提呈给t细胞，该部分个体即使通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，也无法使t细胞恢复活力，免疫检查点抑制剂治疗效果不佳。因此，根据本发明的实施例的方法可以通过所述个体的 hla-b的趋异进化指数准确划分出适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的人群和不适于免疫检查点抑制剂治疗的人群。
12.在本发明的第七方面，本发明提出了一种预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的系统。根据本发明的实施例，包括：确定胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效装置，所述确定胃肠肿瘤免疫检查点抑制疗效装置用于基于待测对象核酸样品的hla-b趋异进化指数，判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效。根据本发明实施例的系统能够利用所述hla-b的趋异进化指数的范围准确判定所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
13.在本发明的第八方面，本发明提出了一种用于预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的试剂盒。根据本发明的实施例，包括用于检测hla-b的趋异进化指数的试剂。根据本发明实施例的试剂盒通过无创检测可以准确获得所述hla-b趋异进化指数，并通过所述hla-b趋异进化指数有效预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效，同时具有灵敏度高、检测成本低等优点。
14.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
15.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
16.图1是根据本发明实施例的系统中确定胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效装置的示意图；
17.图2是根据本发明实施例的系统中确定胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效装置分型装置、氨基酸分析装置、差异指数计算装置、趋异进化指数计算装置的示意图；
18.图3是根据本发明实施例的系统中确定胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效装置分型
装置、氨基酸分析装置、差异指数计算装置、趋异进化指数计算装置、dna文库构建装置、测序数据获取装置的示意图；
19.图4是根据本发明实施例的获得实验样本、分离核酸、dna建库、测序、hla基因分型、计算hla 氨基酸的差异指数以及计算hla基因趋异进化指数的流程图；
20.图5-a是根据本发明实施例的84例胃肠肿瘤患者hla-a的hed指数阈值分析的结果图，其中
21.5-a-1中，distribution表示分布，横坐标表示hla-a的hed指数，纵坐标density表示密度，黑色实线左侧为hla-b hed低对象统计数据，右侧为hla-b hed高对象统计数据，
22.5-a-2中，maximally selected rank statistics表示最大选择检验，横坐标表示hla-a的hed指数，纵坐标standardized log-rank statistic表示标准化log-rank统计，cutpoint表示阈值，虚线左侧为hla-b hed低对象统计数据，右侧为hla-b hed高对象统计数据；
23.图5-b是根据本发明实施例的84例胃肠肿瘤患者hla-a的hed指数与总生存期km生存分析的结果图，其中，strata表示分层抽样，横坐标(time)表示时间(月)，纵坐标(survival probability) 表示生存概率，hla-b hed＝high表示hla-b hed高对象统计数据，hla-b hed＝low表示hla-b hed 低对象统计数据，number at risk表示风险数量；
24.图6-a是根据本发明实施例的84例胃肠肿瘤患者hla-b的hed指数阈值分析的结果图，具体参数释义参考图5-a；
25.图6-b是根据本发明实施例的84例胃肠肿瘤患者hla-b的hed指数与总生存期(os)km生存分析的结果图，具体参数释义参考图5-b；
26.图7-a是根据本发明实施例的84例胃肠肿瘤患者hla-c的hed指数阈值分析的结果图，具体参数释义参考图5-a；
27.图7-b是根据本发明实施例的84例胃肠肿瘤患者hla-c的hed指数与总生存期km生存分析的结果图，具体参数释义参考图5-b；
28.图8是根据本发明实施例的84例胃肠肿瘤患者hla-b的hed指数与无进展生存期km生存分析的结果图，其中，具体参数释义参考图5-b；
29.图9-a是根据本发明实施例的84例胃肠肿瘤患者hla-b的hed指数阈值分析的结果图，具体参数释义参考图5-a；以及
30.图9-b是根据本发明实施例的84例胃肠肿瘤患者hla-b的hed指数与总生存期km生存分析的结果图，其中，具体参数释义参考图5-b。
具体实施方式
31.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
32.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
33.术语“趋异进化指数”用来评价基因编码的蛋白质氨基酸序列的趋异进化程度，当
所述趋异进化指数越高，待评价的基因编码的蛋白质氨基酸序列趋异进化程度较高，如本发明中所述的hla-b基因趋异进化指数可以反映机体hla-b分子与抗原肽结合域的序列多样性，当所述hla-b基因趋异进化指数较高时，hla-b的等位基因所编码的氨基酸序列多样性较高，与抗原肽结合的结域种类较多，可以结合多种抗原肽并呈递给t细胞。
34.术语“临床获益”表现为使所述对象生存获益，采用指标检测，表现为无病进展生存期、总生存期和中位生存期等得到显著延长，于本技术中，所述hla hed指数高的患者与hed指数低的患者相比，接受免疫检查点抑制剂临床结局更好，总生存期长，描述为显著临床获益。
35.术语“高通量测序”，是相对于传统的sanger sequencing而言的，以能一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定和一般读长较短等特点为标志。ngs技术目前已经在诊断遗传病、测量基因表达水平、构建进化树、区分形态学上近似物种、对非模式生物进行重头测序头(denovo sequencing)，构建其参考基因组序列等多个领域得到广泛应用。
36.术语“捕获测序”为将感兴趣的基因组区域定制成特异性探针与基因组dna在序列捕获芯片(或溶液)进行杂交，将目标基因组区域的dna片段进行富集后再利用ngs测序技术进行测序的研究策略。
37.在一些实施方案中，本发明提出了hla-b在作为预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物的用途。hla是抗原肽呈递过程中非常重要的蛋白分子，t细胞是抗肿瘤免疫的主要介质，当t细胞特异性识别肿瘤细胞上hla i类分子所呈现的抗原肽时，t细胞被激活并杀死肿瘤细胞，但由于肿瘤部位存在抑制信号，使得肿瘤特异性t细胞功能失调，若待预测对象体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类越多，所述hla-b分子就可将多种抗原肽提呈给t细胞，从而诱导机体的免疫应答，该部分患者通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，即可使t细胞恢复活力，杀死肿瘤细胞，提高临床疗效，若待预测对象体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类较单一，所述hla-b分子仅可将单一抗原肽提呈给t细胞，该部分患者即使通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，也无法使t细胞恢复活力，免疫检查点抑制剂治疗效果不佳。因此，根据本发明的一些具体实施方案的hla-b分子可以作为标志物用于准确预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
38.根据本发明的一些具体实施方案，所述对象包括不患肿瘤的个体或患肿瘤个体。hla基因作为人类基因组中具多态性的基因，具有遗传背景，无法在短期内因机体或外界因素影响而发生改变，同理，hla 基因的多态性不会在短期内因机体发生病变而被干扰，因此，所述hla-b分子在不患肿瘤或患肿瘤的个体内均可准确预测所述对象是否适于免疫检查点抑制剂治疗。
39.根据本发明的一些具体实施方案，所述肿瘤为胃肠肿瘤。根据本发明的具体实施方案，所述hla-b 分子在预测对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗时效果较突出。
40.根据本发明的一些具体实施方案，所述胃肠肿瘤为胃腺癌、食管鳞癌、结肠癌或直肠癌中的至少之一。
41.根据本发明的一些具体实施方案，依据所述hla-b趋异进化指数判断所述对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗是否有效。hla是抗原肽呈递过程中非常重要的蛋白分子，当t细胞特异性识别肿瘤细胞上hla i类分子所呈现的抗原肽时，t细胞被激活并杀死肿瘤细
胞，但由于肿瘤部位存在抑制信号，使得肿瘤特异性t细胞功能失调，hed指数可以反映机体hla分子与抗原肽结合域的序列多样性， hed指数越高体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类越多，所述hla-b分子就可将多种抗原肽提呈给t细胞，从而诱导机体的免疫应答，该部分患者通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，即可使 t细胞恢复活力，杀死肿瘤细胞，提高临床疗效；若待预测对象hed指数较低，体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类较单一，所述hla-b分子仅可将单一抗原肽提呈给t细胞，该部分患者即使通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，也无法使t细胞恢复活力，免疫检查点抑制剂治疗效果不佳。因此，根据本发明的具体实施方案的hla-b的趋异进化指数可以准确预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
42.根据本发明的一些具体实施方案，所述hla-b趋异进化指数大于8是所述对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗临床获益的指示。
43.根据本发明的一些具体实施方案，当所述hla-b趋异进化指数达到一定的阈值，如大于8时，所述对象机体机体内hla-b可结合多种抗原肽呈递给t细胞诱导免疫应答，杀死肿瘤，此时，所述对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗效果较佳。
44.在一些实施方案中，本发明提出了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述程序用于预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效，该程序被处理器执行时获得hla-b的趋异进化指数。根据本发明具体实施方案的可读存储介质可以准确获得hla-b的趋异进化指数，所述hla-b的趋异进化指数可以有效预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
45.在一些实施方案中，本发明提出了一种用于预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的电子设备包括：前面所述的计算机可读存储介质；以及一个或者多个处理器，用于执行所述计算机可读存储介质中的程序。根据本发明具体实施例的电子设备能够利用所述处理器执行所述计算机可读存储介质中的程序，从而准确获得hla-b的趋异进化指数，所述hla-b的趋异进化指数可以有效预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
46.在一些实施方案中，本发明提出了hla-b的趋异进化指数在预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效中的用途。hla是抗原肽呈递过程中非常重要的蛋白分子，当t细胞特异性识别肿瘤细胞上hla i 类分子所呈现的抗原肽时，t细胞被激活并杀死肿瘤细胞，但由于肿瘤部位存在抑制信号，使得肿瘤特异性t细胞功能失调，hed指数可以反映机体hla分子与抗原肽结合域的序列多样性，hed指数越高体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类越多，所述hla-b分子就可将多种抗原肽提呈给t细胞，从而诱导机体的免疫应答，该部分患者通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，即可使t细胞恢复活力，杀死肿瘤细胞，提高临床疗效；若待预测对象hed指数较低，体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类较单一，所述hla-b分子仅可将单一抗原肽提呈给t细胞，该部分患者即使通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，也无法使t细胞恢复活力，免疫检查点抑制剂治疗效果不佳。因此，根据本发明的具体实施方案的hla-b的趋异进化指数可以准确预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
47.根据本发明的一些具体实施方案，所述hla-b趋异进化指数是通过以下方式获得的：1)基于6号染色体hla分子的全外显子测序数据，确定hla基因分型；2)基于hla-b等位基因序列，获得hla-b 的氨基酸组成、极性和分子量；3)基于hla-b的氨基酸组成、极性和分子
量，获得hla-b氨基酸的差异指数grantham distance，所述差异指数grantham distance是通过如下公式计算获得的：
48.grantham distance＝∑d
ij
＝∑[α(c
i-cj)2 β(p
i-pj)2 γ(v
i-vj)2]
1/2
，其中，i和j表示不同待分析氨基酸链上的两个氨基酸；d
ij
表示i和j两个氨基酸之间的grantham距离；c表示氨基酸的组成，ci表示i氨基酸的组成，cj表示j氨基酸的组成；p表示氨基酸的极性，pi表示i氨基酸的极性， pj表示j氨基酸的极性；v表示氨基酸的分子量，vi表示i氨基酸的分子量，vj表示j氨基酸的分子量；α、β和γ表示任一常数，4)基于所述hla-b氨基酸链上的差异指数grantham distance的均值，获得 hla-b趋异进化指数。所述hla-b氨基酸的差异指数的计算公式参考文献grantham r.amino aciddifference formula to help explain protein evolution[j].science,1974,185(4154):862-864.；其中，氨基酸的组成反映不同氨基酸组成差别，定义为非碳成分与碳成分原子量的比值，所述hla-b氨基酸链上的差异指数的均值为所述hla-b氨基酸链上的差异指数与机体内所含的hla-b氨基酸链之间可能进行两两组合的次数的比值，需要注意的是，不同机体内，所含hla-b氨基酸链的数目可能不同。
[0049]
根据本发明的一些具体实施方案，所述6号染色体hla分子的所述全外显子测序数据是通过如下方式获得：利用所述对象的dna文库进行全外显子测序，以便获得全外显子测序数据；选择所述6号染色体hla分子的所述全外显子测序数据。根据本发明的一些具体实施方案，所述对象的dna文库是基于所述对象的核酸样品构建的。将所述核酸样本进行超声打碎为200bp大小的片段后，采用相关试剂构建片段化的所述dna文库。
[0050]
根据本发明的一些具体实施方案，所述核酸样品来源于所述对象的血液样品。
[0051]
根据本发明的一些具体实施方案，基于所述hla-b趋异进化指数判断所述对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗是否有效。
[0052]
根据本发明的一些具体实施方案，所述hla-b趋异进化指数大于8是所述对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗临床获益的指示。
[0053]
在一些实施方案中，本发明提出了一种预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的方法，包括：基于待测对象核酸样品的hla-b趋异进化指数，判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效。当t细胞特异性识别肿瘤细胞上hla i类分子所呈现的抗原肽时，t细胞被激活并杀死肿瘤细胞，但由于肿瘤部位存在抑制信号，使得肿瘤特异性t细胞功能失调，hed指数可以反映机体hla分子与抗原肽结合域的序列多样性，hed指数越高体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类越多，所述hla-b分子就可将多种抗原肽提呈给t细胞，从而诱导机体的免疫应答，该部分患者通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，即可使t细胞恢复活力，杀死肿瘤细胞，提高临床疗效；若待预测对象hed指数较低，体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类较单一，所述hla-b分子仅可将单一抗原肽提呈给t细胞，该部分患者即使通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，也无法使t细胞恢复活力，免疫检查点抑制剂治疗效果不佳。因此，根据本发明具体实施方案的方法可以准确预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
[0054]
根据本发明的一些具体实施方案，所述hla-b趋异进化指数大于8是所述对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗临床获益的指示。
[0055]
根据本发明的一些具体实施方案，所述hla-b趋异进化指数是通过以下方式获得
的：1)基于6号染色体hla分子的全外显子测序数据，确定hla基因分型；2)基于所述hla-b等位基因序列，获得hla-b的氨基酸组成、极性和分子量；3)基于hla-b的氨基酸组成、极性和分子量，获得hla-b 氨基酸的差异指数grantham distance，所述差异指数grantham distance是通过如下公式计算获得的：
[0056]
grantham distance＝∑d
ij
＝∑[α(c
i-cj)2 β(p
i-pj)2 γ(v
i-vj)2]
1/2
，其中，i和j表示待分析氨基酸链上的两个氨基酸；d
ij
表示i和j两个氨基酸之间的grantham距离；c表示氨基酸的组成， ci表示i氨基酸的组成，cj表示j氨基酸的组成；p表示氨基酸的极性，pj表示j氨基酸的极性；v表示氨基酸的分子量，vi表示i氨基酸的分子量，vj表示j氨基酸的分子量；α、β和γ表示任一常数，4)基于所述hla-b氨基酸链上的差异指数grantham distance的均值，获得hla-b趋异进化指数。所述hla-b 氨基酸的差异指数的计算公式参考文献grantham r.amino acid difference formula to help explain proteinevolution[j].science,1974,185(4154):862-864.；其中，氨基酸的组成反映不同氨基酸组成差别，定义为非碳成分与碳成分原子量的比值，所述hla-b氨基酸链上的差异指数的均值为所述hla-b氨基酸链上的差异指数与机体内所含的hla-b氨基酸链之间可能进行两两组合的次数的比值，需要注意的是，不同机体内，所含hla-b氨基酸链的数目可能不同。
[0057]
根据本发明的一些具体实施方案，所述6号染色体hla分子的所述全外显子测序数据是通过如下方式获得：利用所述对象的dna文库进行全外显子测序，以便获得全外显子测序数据；选择所述6号染色体hla分子的所述全外显子测序数据。
[0058]
根据本发明的一些具体实施方案，所述对象的dna文库是基于所述对象的核酸样品构建的。
[0059]
根据本发明的一些具体实施方案，所述核酸样品来源于所述对象的血液样品。
[0060]
根据本发明的一些具体实施方案，所述对象包括不患肿瘤的个体或肿瘤患者。
[0061]
根据本发明的一些具体实施方案，所述肿瘤为胃肠肿瘤。根据本发明的具体实施方案，所述hla-b 分子在预测对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗时效果较突出。
[0062]
根据本发明的一些具体实施方案，所述胃肠肿瘤为胃腺癌、食管鳞癌、结肠癌或直肠癌中的至少之一。
[0063]
在一些实施方案中，本发明提出了一种对人群进行划分的方法，包括：基于所述人群中每个个体核酸样品的hla-b趋异进化指数，对人群中适于或不适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的个体进行划分。当t细胞特异性识别肿瘤细胞上hla i类分子所呈现的抗原肽时，t细胞被激活并杀死肿瘤细胞，但由于肿瘤部位存在抑制信号，使得肿瘤特异性t细胞功能失调，hed指数可以反映机体hla分子与抗原肽结合域的序列多样性，hed指数越高体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类越多，所述hla-b 分子就可将多种抗原肽提呈给t细胞，从而诱导机体的免疫应答，该部分个体通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，即可使t细胞恢复活力，杀死肿瘤细胞，提高临床疗效；若待预测对象hed指数较低，体内所述hla-b分子结合的抗原肽种类较单一，所述hla-b分子仅可将单一抗原肽提呈给t细胞，该部分个体即使通过免疫检查点抑制剂治疗后去除抑制信号，也无法使t细胞恢复活力，免疫检查点抑制剂治疗效果不佳。因此，根据本发明的一些具体实施方案的方法可以通过所述个体的hla-b的趋异进化指数准确划分出适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的人群和不适
于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的人群。
[0064]
根据本发明的一些具体实施方案，所述hla-b趋异进化指数大于8是人群中所述个体适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的指示。
[0065]
根据本发明的一些具体实施方案，所述hla-b趋异进化指数是通过以下方式获得的：1)基于6号染色体hla分子的全外显子测序数据，确定hla基因分型；2)基于所述hla-b等位基因序列，获得hla-b的氨基酸组成、极性和分子量；3)基于hla-b的氨基酸组成、极性和分子量，获得hla-b 氨基酸的差异指数grantham distance，所述差异指数grantham distance是通过如下公式计算获得的：
[0066]
grantham distance＝∑d
ij
＝∑[α(c
i-cj)2 β(p
i-pj)2 γ(v
i-vj)2]
1/2
，其中，i和j表示不同待分析氨基酸链上的两个氨基酸；d
ij
表示i和j两个氨基酸之间的grantham距离；c表示氨基酸的组成，ci表示i氨基酸的组成，cj表示j氨基酸的组成；p表示氨基酸的极性，pi表示i氨基酸的极性， pj表示j氨基酸的极性；v表示氨基酸的分子量，vi表示i氨基酸的分子量，vj表示j氨基酸的分子量；α、β和γ表示任一常数，4)基于所述hla-b氨基酸链上的差异指数grantham distance的均值，获得 hla-b趋异进化指数。所述hla-b氨基酸的差异指数的计算公式参考文献grantham r.amino aciddifference formula to help explain protein evolution[j].science,1974,185(4154):862-864.；其中，氨基酸的组成反映不同氨基酸组成差别，定义为非碳成分与碳成分原子量的比值，所述hla-b氨基酸链上的差异指数的均值为所述hla-b氨基酸链上的差异指数与机体内所含的hla-b氨基酸链之间可能进行两两组合的次数的比值，需要注意的是，不同机体内，所含hla-b氨基酸链的数目可能不同。
[0067]
在一些具体实施方案，本发明提出了一种预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的系统，如图1 所示，所述系统包括：确定胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效装置700，所述确定胃肠肿瘤免疫检查点抑制疗效装置700用于基于待测对象核酸样品的hla-b趋异进化指数，判断所述对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗是否有效。根据本发明的一些具体实施方案的系统能够利用所述hla-b的趋异进化指数的范围准确预测所述对象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
[0068]
根据本发明的一些具体实施方案，所述hla-b趋异进化指数大于8是所述对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗临床获益的指示。当所述hla-b趋异进化指大于8时，所述系统将确定所述对象适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
[0069]
根据本发明的一些具体实施方案，如图2所示，所述系统进一步包括：基因分型装置300，用于基于6号染色体hla分子的全外显子测序数据，确定hla基因分型；氨基酸分析装置400，所述氨基酸分析装置400与所述基因分型装置300相连，并且用于基于所述hla-b等位基因序列，获得hla-b的氨基酸组成、极性和分子量；差异指数计算装置500，所述差异指数计算装置500与所述氨基酸分析装置400相连，并且用于基于hla-b的氨基酸组成、极性和分子量，获得hla-b氨基酸的差异指数 grantham distance；趋异进化指数计算装置600，所述趋异进化指数计算装置600与所述差异指数计算装置500、确定胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效装置700相连，并用于基于所述hla-b氨基酸链上的差异指数grantham distance的均值，获得hla-b趋异进化指数。
[0070]
根据本发明的一些具体实施方案，所述差异指数grantham distance是通过如下
公式计算获得的：
[0071]
grantham distance＝∑d
ij
＝∑[α(c
i-cj)2 β(p
i-pj)2 γ(v
i-vj)2]
1/2
，其中，i和j表示不同待分析氨基酸链上的两个氨基酸；d
ij
表示i和j两个氨基酸之间的grantham距离；c表示氨基酸的组成，ci表示i氨基酸的组成，cj表示j氨基酸的组成；p表示氨基酸的极性，pi表示i氨基酸的极性， pj表示j氨基酸的极性；v表示氨基酸的分子量，vi表示i氨基酸的分子量，vj表示j氨基酸的分子量；α、β和γ表示任一常数。所述hla-b氨基酸的差异指数的计算公式及各氨基酸的组成、极性、分子量均可参考参考文献grantham r.amino acid difference formula to help explain protein evolution[j].science, 1974,185(4154):862-864.；其中，氨基酸的组成反映不同氨基酸组成差别，定义为非碳成分与碳成分原子量的比值，所述hla-b氨基酸链上的差异指数的均值为所述hla-b氨基酸链上的差异指数与机体内所含的hla-b氨基酸链之间可能进行两两组合的次数的比值，需要注意的是，不同机体内，所含hla-b 氨基酸链的数目可能不同。
[0072]
根据本发明的一些具体实施方案，如图3所示，所述系统进一步包括：dna文库构建装置100，用于基于所述对象的核酸样品构建所述对象的dna文库；测序数据获取装置200，所述测序数据获取装置200与所述dna文库构建装置100和所述基因分型装置300相连，并用于利用所述对象的dna文库进行全外显子测序，以便获得全外显子测序数据并选择所述6号染色体hla分子的所述全外显子测序数据。根据本发明一些具体实施方案，所述hla分子的全外显子测序数据的获取方式不受获得特别限制，只要是能获得所述hla分子的所述全外显子测序数据的方法均可以施用，如获得全外显子测序数据后先选择所述6号染色体的所述全外显子测序数据后，再从其中选择所述hla分子的全外显子测序数据，或获得全外显子测序数据后直接选择所述hla分子的全外显子测序数据。
[0073]
在一些实施方案中，本发明提出了一种用于预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的试剂盒，包括用于检测hla-b的趋异进化指数的试剂。根据本发明一些具体实施方案的试剂盒通过无创检测可以准确获得所述hla-b趋异进化指数，并通过所述hla-b趋异进化指数有效预测对象胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效，同时具有灵敏度高、检测成本低等优点。
[0074]
根据本发明的一些具体实施方案，包括以下中的至少之一：dna提取试剂、建库试剂或全外显子测序试剂。
[0075]
根据本发明的一些具体实施方案，所述试剂盒进一步包括：一组参考数据集，所述参考数据集用来作为hla-b基因的参考。
[0076]
根据本发明的一些具体实施方案，所述试剂盒还包括第一计算机程序产品，所述第一计算机程序产品用来执行前面所述的预测对象免疫检查点抑制剂疗效的方法。
[0077]
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
[0078]
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0079]
实施例1 hla趋异进化指数预测胃肠肿瘤患者免疫检查点抑制剂治疗疗效(puch临床队列)
[0080]
本实施例基于84例接受免疫检查点抑制剂治疗的胃肠肿瘤临床队列，通过评估hla趋异进化指数hed对胃肠肿瘤患者免疫治疗疗效进行预测，本实验的操作流程图如图4所示。具体实验操作步骤如下：
[0081]
1.1分离核酸样本
[0082]
(1)采集84例接受免疫检查点抑制剂治疗的胃肠肿瘤患者外周血，分离患者的外周血单个核细胞(pbmc)。
[0083]
(2)基因组dna提取：采用血液基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，dp348)对血细胞中的dna进行提取。使用qubitdnahs试剂盒(赛默飞世尔，q33230)对血细胞dna的含量进行测定，使用labchipgxtouchht(铂金埃尔莫，cls138162、cls760672)检测对血细胞dna进行质控，血细胞dna应≥50ng。
[0084]
1.2全外显子文库构建
[0085]
采用非接触式超声波破碎仪(covaris，m220)将提取的基因组dna采用超声打碎为200bp大小的片段，采用文库构建试剂盒(kapahtplibrarypreparationkit)构建dna文库，包括末端修复、接头连接、文库富集步骤。所构建文库使用agencourtampurexp磁珠(贝克曼库尔特，a63882)纯化后，使用qubitdnahs试剂盒(赛默飞世尔，q33230)以及labchipgxtouchht(珀金埃尔默，cls138162、cls760672)进行浓度检测和质控。文库总量应≥500ng。
[0086]
1.3探针捕获杂交
[0087]
使用罗氏全外显子捕获测序探针(nimblegen)进行文库捕获。后续用agencourtampurexp磁珠(贝克曼库尔特，a63882)进行纯化，使用qubitdnahs试剂盒(赛默飞世尔，q33230)以及labchipgxtouchht(珀金埃尔默，cls138162、cls760672)进行浓度测定。
[0088]
1.4高通量测序
[0089]
使用novaseq6000(因美纳)测序仪，以双端模式进行测序。
[0090]
构建后的dna文库，采用罗氏全外显子捕获测序探针(nimblegen)杂交富集外显子区域，采用高通量测序仪illuminanovaseq测序。
[0091]
1.5测序数据分析
[0092]
(1)hla分型：对血细胞dna样本全外显子测序数据，选择6号染色体hla分子全外显子测序数据，参考hla参考公共数据库imgt/hla，采用opitype软件对hlai型基因进行分型，采用hla-vbseq工具进一步对hla分型结果进行确认分析。
[0093]
(2)hla趋异进化指数hed计算：对hla等位基因序列分析，根据氨基酸组成、极性、分子量计算获得氨基酸的差异指数granthamdistance；根据氨基酸的差异指数granthamdistance的均值，分别评估每位患者hla-a、hla-b、hla-c基因趋异进化指数hed。所述差异指数granthamdistance是通过如下公式计算获得的：
[0094]
granthamdistance＝∑d
ij
＝∑[α(c
i-cj)2 β(p
i-pj)2 γ(v
i-vj)2]
1/2
，其中，i和j表示不同待分析氨基酸链上的两个氨基酸；d
ij
表示i和j两个氨基酸之间的grantham距离，c表示氨基酸的组成，ci表示i氨基酸的组成，cj表示j氨基酸的组成，p表示氨基酸的极性，pi表示i氨基酸的极性，pj表示j氨基酸的极性，v表示氨基酸的分子量，vi表示i氨基酸的分子量，vj表示j氨基酸的分子量，α、β和γ表示任一常数；所述hla-b氨基酸的差异指数的计算
公式及各氨基酸的组成、极性、分子量(表1) 均参考如下文献：grantham r.amino acid difference formula to help explain protein evolution[j].science,1974, 185(4154):862-864.；其中，氨基酸的组成反映不同氨基酸组成差别，定义为非碳成分与碳成分原子量的比值，本实施例所使用氨基酸的组成、极性、分子量的数值参考表1，所述hla-b氨基酸链上的差异指数的均值为所述hla-b氨基酸链上的差异指数与机体内所含的hla-b氨基酸链之间可能进行两两组合的次数的比值，需要注意的是，不同机体内，所含hla-b氨基酸链的数目可能不同。
[0095]
表1：
[0096][0097]
所得实验结果如图所示，由图5-a、5-b、7-a和7-b可知，hla-a及hla-c趋异进化指数 hed高的患者与hed指数低的胃肠肿瘤患者，接受免疫检查点抑制治疗后，总生存期无显著差异 (p值》0.05)。图6-a、6-b、图8显示，hla-b趋异进化指数hed高的胃肠肿瘤患者与hed指数低的患者，接受免疫检查点抑制剂治疗后总生存期和无进展生存期均显著延长(p值《0.05)，hed 阈值为8.61。同时，hla-b趋异进化指数hed高的胃肠肿瘤患者从免疫检查点抑制剂治疗中获益，hla-b的hed是作为预测胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的有效生物标志物。
[0098]
实施例2 hla趋异进化指数预测胃肠肿瘤患者免疫检查点抑制剂治疗疗效(msk临床队列)
[0099]
本实施例基于84例接受免疫检查点抑制剂治疗的胃肠肿瘤临床队列，评估hla趋异进化指数hed对胃肠肿瘤患者免疫治疗疗效预测价值，实验操作流程图如图4所示。具体实验操作如下：
[0100]
2.1分离核酸样本
[0101]
(1)采集84例接受免疫检查点抑制剂治疗的胃肠肿瘤患者外周血，分离患者的外周血单个核细胞 (pbmc)。
[0102]
(2)基因组dna提取：采用血液基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，dp348)对血细胞中的dna进行提取。使用qubit dna hs试剂盒(赛默飞世尔，q33230)对血细胞dna的含量进行测定，使用labchip gx touch ht(铂金埃尔莫，cls138162、cls760672)检测对血细胞dna进行质控，血细胞dna应≥50ng。
[0103]
2.2全外显子文库构建
[0104]
采用非接触式超声波破碎仪(covaris，m220)将提取的基因组dna采用超声打碎为200bp大小的片段，采用文库构建试剂盒(kapa htp library preparation kit)构建dna文库，包括末端修复、接头连接、文库富集步骤。所构建文库使用agencourt ampure xp磁珠(贝克曼库尔特，a63882)纯化后，使用qubit dna hs试剂盒(赛默飞世尔，q33230)以及labchip gx touch ht(珀金埃尔默，cls138162、 cls760672)进行浓度检测和质控，文库总量应≥500ng。
[0105]
2.3探针捕获杂交
[0106]
使用罗氏全外显子捕获测序探针(nimblegen)进行文库捕获。后续用agencourt ampure xp磁珠纯化(贝克曼库尔特，a63882)，使用qubit dna hs试剂盒(赛默飞世尔，q33230)以及labchip gx touchht(珀金埃尔默，cls138162、cls760672)进行浓度测定。
[0107]
2.4高通量测序
[0108]
使用novaseq 6000(因美纳)测序仪，以双端模式进行测序。
[0109]
构建后的dna文库，采用罗氏全外显子捕获测序探针(nimblegen)杂交富集外显子区域，采用高通量测序仪illumina novaseq测序。
[0110]
2.5测序数据分析
[0111]
(1)hla分型：对血细胞dna样本全外显子测序数据，选择6号染色体hla分子全外显子测序数据，参考hla参考公共数据库imgt/hla，采用opitype软件对hla i型基因进行分型，采用hla-vbseq工具进一步对hla分型结果进行确认分析。
[0112]
(2)hla趋异进化指数hed计算：对hla等位基因序列分析，根据氨基酸组成，极性，分子量计算获得氨基酸的差异指数grantham distance；根据氨基酸的差异指数grantham distance均值，分别评估每位患者hla-a,hla-b,hla-c基因趋异进化指数hed。
[0113]
其中，所述差异指数grantham distance的计算方式如下： grantham distance＝∑d
ij
＝∑[α(c
i-cj)2 β(p
i-pj)2 γ(v
i-vj)2]
1/2
，其中，i和j表示不同待分析肽链上的两个氨基酸，d
ij
表示i和j两个氨基酸之间的grantham距离，c(composition)表示氨基酸组成，ci表示i氨基酸的组成，cj表示j氨基酸的组成；p(polarity)表示极性，pi表示i氨基酸的极性，pj表示j氨基酸的极性；v(volume)表示分子量，vi表示i氨基酸的分子量，vj表示j氨基酸的分子量；α、β、γ表示任意常数。所述hla-b氨基酸的差异指数的计算公式及各氨基酸的组成、极性、分子量(表1)均参考文献grantham r.amino acid difference formula to help explain protein evolution[j]. science,1974,185(4154):862-864.；氨基酸的组成反映不同氨基酸组成差别，定义为非碳成分与碳成分原子量的比值，本实施例所使用氨基酸的组成、极性、分子量的数值参考表1，所述hla-b氨基酸链上的差异指数的均值为所述hla-b氨基酸链上的差异指数与机体内所含的hla-b氨基酸链之间可能进行两两组合的次数的
比值，需要注意的是，不同机体内，所含hla-b氨基酸链的数目可能不同。
[0114]
2.6结果分析
[0115]
具体结果如图9-a、9-b所示，hla-b趋异进化指数hed高的胃肠肿瘤患者与hed指数低的患者，接受免疫检查点抑制剂治疗后总生存期延长，其中，hla-b趋异进化指数hed阈值为10.19。该实验结果表明，hla-b趋异进化指数hed高的胃肠肿瘤患者从免疫检查点抑制剂治疗中获益，hla-b的hed是作为预测胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的有效生物标志物。
[0116]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0117]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。