高度唾液酸化的多聚体结合分子的制作方法

高度唾液酸化的多聚体结合分子
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年1月6日提交的美国临时专利申请序列号62/957,745的权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。
3.序列表
4.本技术含有序列表，所述序列表以ascii格式以电子方式提交并且由此通过引用以其整体并入。ascii副本创建于2021年1月5日，名为028wo1-sequence-listing，并且大小为92,335字节。


背景技术：

5.可多聚的抗体和抗体样分子，诸如iga和igm抗体，已成为例如免疫肿瘤学和传染病的领域中有前途的药物候选物，从而允许改善的特异性、改善的亲合力和结合至多个结合靶标的能力。参见，例如，美国专利号9,951,134、9,938,347、10,351,631、10,400,038、10,570,191、10,604,559、10,618,978、10,689,449和10,787,520，美国专利申请公开号us 2019-0330374、us 2019-0330360、us 2019-0338040、us 2019-0338041、us 2019-0185570和us 2019-0002566、us 2020-0239572，以及pct公开号wo 2018/187702和wo 2019/165340，所述公开的内容通过引用以其整体并入本文。
6.多价抗体的药代动力学(pk)和药效动力学(pd)是复杂的，并且(翻译与翻译后)取决于单克隆抗体的结构以及其靶向的生理系统。此外，通常通过不同的细胞和生理系统在受试者内处理不同的抗体类别。例如，igg抗体类别的血清半衰期为20天，而igm和iga抗体的半衰期仅为约5-8天(brekke，oh.，和i.sandlie，nature reviews drug discovery 2：52-62(2003))。
7.抗体或其他生物治疗剂的pk的关键决定因素之一是其糖基化的水平和类型(higel，f.等人eur.j.pharm.biopharm.139：123-131(2019))。与抗体上特定残基共价连接的糖部分及其衍生物可以决定它们如何被受体诸如去唾液酸糖蛋白(asgp)受体识别，这继而决定了它们从体循环中清除的速度。每个igm重链恒定区具有五个天冬酰胺-(n-)连接的糖基化位点，并且j链具有一个n连接的糖基化位点。因此，含有j链的五聚体igm含有多达51个聚糖部分，这会导致复杂的糖基化谱(hennicke，j.，等人，anal.biochem.539：162-166(2017))。聚糖的复杂性会使均匀糖基化材料的制造变得困难。
8.尽管在设计多聚体抗体方面取得了进展，但是仍然需要能够操纵这些分子的物理、药代动力学和药效动力学性质。


技术实现要素：

9.本文提供了多聚体结合分子的单克隆群体，所述结合分子各自包含十个或十二个igm衍生的重链，其中igm衍生的重链包含糖基化的igm重链恒定区，所述恒定区各自与特异性结合靶标的结合结构域缔合，其中每个igm重链恒定区包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个天冬酰胺(n)连接的糖基化基序，其中n连接的糖基化基序包括氨
基酸序列n-x
1-s/t，其中n是天冬酰胺，x1是除脯氨酸以外的任何氨基酸，并且s/t是丝氨酸或苏氨酸，其中每个igm重链恒定区上的n连接的糖基化基序中的至少一个、至少两个或至少三个由复合聚糖占据，并且其中结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子至少三十五(35)摩尔唾液酸。
10.在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少124、至少130、至少140或至少146摩尔唾液酸。在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子至少40、至少45、至少50、至少55、至少60或至少65摩尔唾液酸。在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子约40至约70、约40至约60、约40至约55、约40至约50、约50至约70、约60至约70摩尔唾液酸。
11.在一些实施方案中，igm重链恒定区是人igm重链恒定区或其变体，其包括从对应于seq id no：1(等位基因ighm*03)或seq id no：2(等位基因ighm*04)的氨基酸46(基序n1)、氨基酸209(基序n2)、氨基酸272(基序n3)、氨基酸279(基序n4)和氨基酸440(基序n5)的氨基酸位置处开始的五个n连接的糖基化基序n-x
1-s/t。在一些实施方案中，基序n1、n2和n3由复合聚糖占据。
12.在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体通过细胞系修饰、体外糖工程化或其任何组合的方法产生。
13.在一些实施方案中，细胞系修饰包括用编码唾液酸转移酶的基因转染产生结合分子的单克隆群体的细胞系，从而产生过表达唾液酸转移酶的修饰的细胞系。在一些实施方案中，唾液酸转移酶包括人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1)(seq id no：3)。在一些实施方案中，细胞系修饰还包括用编码半乳糖基转移酶的基因转染产生结合分子的单克隆群体的细胞系，从而产生过表达半乳糖基转移酶的修饰的细胞系。在一些实施方案中，半乳糖基转移酶包括人β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)(seq id no：4)。
14.在一些实施方案中，体外糖工程化包括使结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触。在一些实施方案中，唾液酸转移酶包括人β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(st6gal1)(seq id no：3)的可溶性变体。在一些实施方案中，st6gal1的可溶性变体包含seq id no：3的氨基酸x至406，其中x是27至120的整数。在一些实施方案中，st6gal1的可溶性变体包括seq id no：3的氨基酸120至406、115至406、110至406、109至406、105至406、100至406、95至406、90至406、89至406、88至406、87至406、86至406、85至406、84至406、83至406、82至406、81至406、80至406、75至406、70至406、65至406、60至406、55至406、50至406、45至406、40至406、35至406、30至406或27至406。在一些实施方案中，唾液酸底物包括胞苷单磷酸-n-乙酰基-神经氨酸(cmp-nana)。
15.在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸底物的质量比为约1∶4至约40∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约80∶1至约5000∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约500∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比为约500∶62.5∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约2000∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比为约2000∶500∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的摩尔比为约80∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的摩尔比为约80∶500∶1。
16.在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物的接触包括至少30分钟的接触。在一些实施方案中，接触包括至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、24小时、36小时或48小时的接触。在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物的接触发生在约2℃至约40℃。在一些实施方案中，接触发生在15℃至约37℃、15℃至约30℃、或15℃至约25℃。
17.在一些实施方案中，体外糖工程化还包括使结合分子的单克隆群体与半乳糖基转移酶和半乳糖底物接触。在一些实施方案中，半乳糖基转移酶包括人β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)(seq id no：4)的可溶性变体。在一些实施方案中，b4galt4的可溶性变体包括seq id no：4的氨基酸x至344，其中x是39至120的整数。在一些实施方案中，b4galt4的可溶性变体包括seq id no：4的氨基酸120至344、115至344、110至344、105至344、100至344、95至344、90至344、85至344、80至344、75至344、70至344、65至344、60至344、55至344、50至344、45至344、40至344或39至344。在一些实施方案中，半乳糖底物包括尿苷-二磷酸-α-d-半乳糖(udp-gal)。在一些实施方案中，与半乳糖基转移酶和半乳糖底物的接触发生在与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触之前或与其同时发生。
18.在一些实施方案中，每个结合分子是多特异性的，并且与每个结合分子的igm重链恒定区缔合的两个或更多个结合结构域特异性地结合不同的靶标。在一些实施方案中，与每个结合分子的igm重链恒定区缔合的结合结构域特异性地结合相同的靶标。在一些实施方案中，与每个结合分子的igm重链恒定区缔合的结合结构域是相同的。
19.在一些实施方案中，结合结构域是抗体衍生的抗原结合结构域。在一些实施方案中，每个结合分子是分别包含五个或六个二价igm结合单元的五聚体或六聚体igm抗体，其中每个结合单元包含两条igm重链(各自包含位于变体igm恒定区的氨基端的vh)以及两条免疫球蛋白轻链(各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的轻链可变结构域(vl))，并且其中vh和vl组合形成特异性地结合靶标的抗原结合结构域。在一些实施方案中，每个结合分子的每个抗原结合结构域结合相同的靶标。在一些实施方案中，每个结合分子的每个抗原结合结构域是相同的。
20.在一些实施方案中，靶标是靶表位、靶抗原、靶细胞、靶器官或靶病毒。
21.在一些实施方案中，每个结合分子是五聚体并且还包含j链或其功能片段，或其功能变体。在一些实施方案中，j链是成熟人j链，其包含氨基酸序列seq id no：6或其功能片段，或其功能变体。在一些实施方案中，j链包含从对应于seq id no：6的氨基酸49(基序n6)的氨基酸位置处开始的n连接的糖基化基序n-x
1-s/t。
22.在一些实施方案中，j链是功能变体j链，其相对于除了一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外与变体j链相同的参考j链包含一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入，并且其中结合分子的单克隆群体相对于除了变体j链中一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外相同的参考igm衍生的结合分子在施用于受试者动物之后表现出增加的血清半衰期，并且使用相同的方法将j链施用于相同的动物物种。在一些实施方案中，变体j链或其功能片段包含相对于参考j链的一个、两个、三个或四个单一氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体j链或其功能片段在对应于seq id no：6的野生型成熟人j链的氨基酸y102的氨基酸位置处包含氨基酸取代。
23.在一些实施方案中，对应于seq id no：6的y102的氨基酸被丙氨酸(a)取代。在一
些实施方案中，j链包含氨基酸序列seq id no：7。
24.在一些实施方案中，j链或其片段或变体是还包含异源部分的修饰的j链，其中异源部分与j链或其片段或变体融合或缀合。在一些实施方案中，异源部分是与j链或其片段或变体融合的多肽。在一些实施方案中，异源多肽通过肽接头与j链或其片段或变体融合。在一些实施方案中，肽接头包含至少5个氨基酸，但不超过25个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头由ggggsggggsggggs(seq id no：43)组成。
25.在一些实施方案中，异源多肽融合至j链或其片段或变体的n端或融合至j链或其片段或变体的c端。在一些实施方案中，可以相同或不同的异源部分融合至j链或其片段或变体的n端和c端。
26.在一些实施方案中，异源多肽包含结合结构域。在一些实施方案中，异源多肽的结合结构域为抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段为scfv片段。在一些实施方案中，异源scfv片段与cd3ε结合。在一些实施方案中，修饰的j链包含氨基酸序列seq id no：36(v15j)、seq id no：37(v15j*)、seq id no：38(sj*)、seq id no：31(a-55-j*)、seq id no：32(a-56-j*)、seq id no：33(a-57-j*)、seq id no：34的氨基酸20-420(vjh)、seq id no：35的氨基酸20-420(vj*h)、或通过肽接头融合至抗cd3εscfv的seq id no：6或7，所述抗cd3εscfv包含分别包含seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：20和seq id no：21的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列。
27.本文还提供了一种包含本文公开的结合分子的单克隆群体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
28.本文还提供了一种产生本文公开的结合分子的单克隆群体的重组宿主细胞。
29.本文还提供了一种产生本文公开的结合分子的单克隆群体的方法，其包括培养本文公开的宿主细胞，以及恢复结合分子的群体。
30.本文还提供了一种用于产生高度唾液酸化的多聚体结合分子的单克隆群体的方法，其包括提供表达结合分子的单克隆群体的细胞系、培养细胞系以及恢复结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子包含十个或十二个igm衍生的重链，其中igm衍生的重链包含糖基化的igm重链恒定区，所述igm重链恒定区各自与特异性地结合靶标的结合结构域缔合，其中每个igm重链恒定区包含至少三个、至少四个或至少五个天冬酰胺(n)连接的糖基化基序，其中n连接的糖基化基序包含氨基酸序列n-x
1-s/t，其中n是天冬酰胺、x1是除脯氨酸以外的任何氨基酸、并且s/t是丝氨酸或苏氨酸，其中平均群体中每个igm重链恒定区上的n连接的糖基化基序中的至少一个、至少两个或至少三个由复合聚糖占据，并且其中细胞系、培养条件、恢复过程或其组合经优化以富集复合聚糖，所述复合聚糖包含每个聚糖至少一个、两个、三个或四个唾液酸末端单糖。
31.本文还提供了一种用于产生高度唾液酸化的多聚体结合分子的单克隆群体的方法，其包括提供表达结合分子的单克隆群体的细胞系、培养细胞系以及恢复结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子包含十个或十二个igm衍生的重链，其中igm衍生的重链包含糖基化的igm重链恒定区，所述igm重链恒定区各自与特异性地结合靶标的结合结构域缔合，其中每个igm重链恒定区包含至少三个、至少四个或至少五个天冬酰胺(n)连接的糖基化基序，其中n连接的糖基化基序包含氨基酸序列n-x
1-s/t，其中n是天冬酰胺、x1是除脯氨
酸以外的任何氨基酸、并且s/t是丝氨酸或苏氨酸，其中平均群体中每个igm重链恒定区上的n连接的糖基化基序中的至少一个、至少两个或至少三个由复合聚糖占据，并且其中细胞系、恢复过程或其组合经优化以富集复合聚糖，所述复合聚糖包含每个聚糖至少一个、两个、三个或四个唾液酸末端单糖。
32.在一些实施方案中，细胞系、培养条件、恢复过程或其组合经优化以产生结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少124、至少130、至少140或至少146摩尔唾液酸。在一些实施方案中，细胞系、恢复过程或其组合经优化以产生结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50或至少60摩尔唾液酸。在一些实施方案中，细胞系、恢复过程或其组合经优化以产生结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子至少30、至少35、至少40、至少45、至少50或至少60摩尔唾液酸。在一些实施方案中，细胞系、恢复过程或其组合经优化以产生结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子约40至约70、约40至约60、约40至约55、约40至约50、约50至约70、约60至约70摩尔唾液酸。
33.在一些实施方案中，igm重链恒定区衍生自人igm重链恒定区，其包括从对应于seq id no：1(等位基因ighm*03)或seq id no：2(等位基因ighm*04)的氨基酸46(基序n1)、氨基酸209(基序n2)、氨基酸272(基序n3)、氨基酸279(基序n4)和氨基酸440(基序n5)的氨基酸位置处开始的五个n连接的糖基化基序n-x
1-s/t。在一些实施方案中，平均结合分子的群体中基序n1、n2和n3中的一个、两个或所有三个由复合聚糖占据。
34.在一些实施方案中，所提供的细胞系经修饰以过表达唾液酸转移酶。在一些实施方案中，唾液酸转移酶包括人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1，seq id no：3)。
35.在一些实施方案中，恢复过程包括使结合分子的单克隆群体经受体外糖工程化。在一些实施方案中，体外糖工程化包括使结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触。在一些实施方案中，唾液酸转移酶包括人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1)(seq id no：3)的可溶性变体。在一些实施方案中，st6gal1的可溶性变体包含seq id no：3的氨基酸x至406，其中x是27至120的整数。在一些实施方案中，st6gal1的可溶性变体包含seq id no：3的氨基酸120至406、115至406、110至406、109至406、105至406、100至406、95至406、90至406、89至406、88至406、87至406、86至406、85至406、84至406、83至406、82至406、81至406、80至406、75至406、70至406、65至406、60至406、55至406、50至406、45至406、40至406、35至406、30至406或27至406。在一些实施方案中，唾液酸底物包含胞苷单磷酸(cmp)-n-乙酰基-神经氨酸(cmp-nana)。
36.在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸底物的质量比为约1∶4至约40∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约80∶1至约10000∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约500∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比为约500∶62.5∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约2000∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比为约2000∶500∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约80∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸底物的质量比为约80∶500∶1。
37.在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物
的接触包括至少30分钟的接触。在一些实施方案中，接触包括至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、24小时、36小时或48小时的接触。在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物的接触发生在约2℃至约40℃。在一些实施方案中，接触发生在15℃至约37℃、15℃至约30℃、或15℃至约25℃。
38.在一些实施方案中，体外糖工程化还包括使结合分子的单克隆群体与半乳糖基转移酶和半乳糖底物接触。在一些实施方案中，半乳糖基转移酶包括人β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)(seq id no：4)的可溶性变体。在一些实施方案中，半乳糖底物包括尿苷-二磷酸-α-d-半乳糖(udp-gal)。在一些实施方案中，与半乳糖基转移酶和半乳糖底物的接触发生在与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触之前或与其同时发生。
39.附图简述
40.图1a示出了“简单”聚糖的结构。图1b示出了寡甘露糖聚糖的示例性结构。图1c示出了复合聚糖的示例性结构。图1d示出了杂合聚糖的示例性结构。单糖：深色圆圈＝甘露糖；浅色圆圈＝半乳糖；正方形＝n-乙酰氨基葡萄糖；棱形＝n-乙酰神经氨酸(唾液酸或nana)；三角形＝岩藻糖。源自：varki，a.，和schauer，r.，essentials of glycobiology，第3版，第8章，consortium of glycobiology(2009)。
41.图2a示出了n-乙酰神经氨酸(唾液酸或nana)的结构；图2b示出了胞苷单磷酸n-乙酰神经氨酸(cmp-nana)的结构。
42.图3a是人igm重链的空间填充模型，示出了五个n连接的糖基化位点的位置。图3b示出了人igm重链恒定区氨基酸序列(等位基因ighm*04，seq id no：2)与小鼠igm重链恒定区氨基酸序列(genbank：cac20701.1，seq id no：46)和食蟹猴igm重链恒定区氨基酸序列(genbank：ehh62210.1，seq id no：47的氨基酸14至487)的比对。对应于天冬酰胺(n)连接的糖基化基序的氨基酸经加框。
43.图4示出了用不同浓度截短的人α-2，6-唾液酸转移酶(st6)处理而产生的抗cd20 x cd3 igm-a的唾液酸化量。
44.图5示出了两种不同igm抗体抗dr5 igm-b和抗dr5 igm-c的体外唾液酸化。
45.图6示出了小鼠模型中抗cd20 x cd3 igm-a和抗cd20 x cd3 igm-a-gem抗体的药代动力学。
46.图7示出了亚克隆的sna-i凝集素标记。细胞用与异硫氰酸荧光素(fitc)缀合的sna-1凝集素标记。显示了每个亚克隆通过细胞仪测量的来自488em/530ex的信号的几何平均值。
47.图8a示出了根据制造商的说明对来自在2，6-唾液酸转移酶池以及2个亚克隆(25和47)上进行的发酵的纯化蛋白质进行可视化和成像的还原的变性criteriontgx免染预制凝胶。图8b示出了使用生物素化sna-i凝集素的图8a中相同蛋白质的蛋白质印迹。将链霉亲和素辣根过氧化物酶融合物用于印迹。
48.图9a-9b示出了来自3-l生物反应器的抗cd20 x cd3 igm-a生产细胞系的发酵比较数据。其中两条曲线显示了不具有2，6-唾液酸转移酶基因的对照亲代细胞系，而一条曲线显示了具有2，6-唾液酸转移酶基因的亚克隆25的生产运行。图9a示出了运行过程中的活细胞密度(vcd)。图9b示出了细胞系的活力。图9c示出了通过尺寸排阻色谱法(sec)测定的滴度。图9d示出了在纯化的igm上测量的唾液酸比率。
49.图10a示出了在96孔水平筛选用2，6-唾液酸转移酶转染的cho细胞克隆的图。图10b示出了细胞表面2，6-唾液酸水平的基于细胞术分析的图。
50.图1ia和11b分别示出了未转染细胞的2，3-唾液酸和2，6-唾液酸水平。图11c比较了未转染和转染细胞中的2,3-唾液酸和2，6-唾液酸水平。
51.图12示出了具有一系列唾液酸水平的不同量抗体的t细胞活化。
52.图13a-13b示出了在不同温度下且用不同量的st6和cmp-nana唾液酸化抗cd20 x cd3-igm-a的时间过程。
53.图14示出了在室温下且用不同量的st6和cmp-nana唾液酸化抗-cd20 x cd3-igm-a的时间过程。
54.图15示出了不同抗体的唾液酸水平和所得auc
0-∞
的比较。
55.图16示出了食蟹猴模型中抗cd20 x cd3 igm-f(sa 18)和抗cd20 x cd3 igm-f-gem(sa 51)抗体的药代动力学。
56.图17a示出了在施用抗cd20 x cd3-igm-f(sa 9或18)或抗cd20 x cd3-igm-f-gem(sa 51)之后每个时间点食蟹猴b细胞的相对数量。图17b示出了在施用抗cd20 x cd3-igm-f(sa 9或18)或抗cd20 x cd3-igm-f-gem(sa 51)之后食蟹猴b细胞开始恢复的那一天。
具体实施方式
57.定义
58.如本文所用，术语“一个(a)”或“一种(an)”实体是指该实体中的一者或多者；例如，“结合分子”被理解为表示一种或多种结合分子。因此，术语“一个(a)”(或“一种(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可以互换使用。
59.此外，当在本文使用时，“和/或”应当视为具有或不具有另一者的两种特定特征或组分中的每一者的具体公开。因此，本文在短语中使用的术语“和/或”诸如“a和/或b”旨在包括：“a和b”、“a或b”、“a”(单独)、和“b”(单独)。同样地，如诸如“a、b和/或c”的短语中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一者：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
60.除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，concise dictionary of biomedicine and molecular biology，juo，pei-show，第2版，2002，crc press；the dictionary of cell and molecular biology，第3版，1999，academic press；和the oxford dictionary of biochemistry and molecular biology，修订版，2000，oxford university press为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用字典。
61.单位、前缀和符号以其syst
è
me international de unites(si)可接受的形式表示。数值范围将限定范围的数包括在内。除非另有说明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。本文提供的标题不限制各种实施方案或本公开的实施方案，其可通过整体参考本说明书而得。因此，紧接下文定义的术语通过整体参考本说明书被更详细地定义。
62.如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，而不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白
质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且可以使用术语“多肽”来代替这些术语中的任一者。术语“多肽”也旨在指代多肽的表达后修饰产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、以及通过已知保护/封闭基团、蛋白水解切割或通过非自然存在的氨基酸进行修饰的衍生化。多肽可以衍生自生物来源或通过重组技术产生，但不必需由指定的核酸序列翻译。它可以任何方式产生，包括通过化学合成。
63.如本文所公开的多肽的大小可为约3或更多、5或更多、10或更多、20或更多、25或更多、50或更多、75或更多、100或更多、200或更多、500或更多更多、1,000或更多、或2,000或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，尽管它们不必需具有这样的结构。具有确定的三维结构的多肽称为折叠的，并且不具有确定的三维结构但可以采用许多不同构象的多肽称为未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白是指与至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白质，该碳水化合物部分通过氨基酸例如丝氨酸或天冬酰胺的含氧或含氮侧链与蛋白质附接。在本公开的别处更详细地描述了天冬酰胺(n)连接的聚糖。
[0064]“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不在其自然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以从其天然或自然环境中去除。如本文所公开，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级分离或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽也是如此。
[0065]
如本文所用，术语“非自然存在的多肽”或其任何语法变体是明确排除但仅排除是或可能是由法官或行政或司法机构确定或解释为是“自然存在的”的那些多肽形式的条件定义。
[0066]
本文公开的其他多肽为上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合。如本文所公开的术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留对应天然抗体或多肽的至少一些性质例如特异性结合抗原的任何多肽。除了本文别处讨论的特异性抗体片段之外，多肽的片段包括例如蛋白水解片段以及缺失片段。例如，多肽的变体包括如上所述的片段，并且还包括由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，变体可为非自然存在的。非自然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可以包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是经过改变以表现出原始多肽上没有的附加特征的多肽。实例包括融合蛋白。如本文所用，多肽的“衍生物”还可以指代具有一个或多个通过官能性侧基的反应来在化学上衍生的氨基酸的对象多肽。还包括作为“衍生物”的是那些含有二十种标准氨基酸的一种或多种衍生物的多肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；以及鸟氨酸可以取代赖氨酸。
[0067]“保守的氨基酸取代”是其中一种氨基酸被具有类似侧链的另一种氨基酸替代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸取代酪氨酸为保守取代。在某些实施方案中，本公开的多肽、结合分子和抗体的序列中的保守取代不取消含
有氨基酸序列的多肽、结合分子或抗体与抗体结合抗原的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32：1180-1 187(1993)；kobayashi等人，protein eng.12(10)：879-884(1999)；和burks等人，proc.natl.acad.sci.usa 94：.412-417(1997))。
[0068]
术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸并且指代分离的核酸分子或构建体，例如信使rna(mrna)、cdna或质粒dna(pdna)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，诸如见于肽核酸(pna)中的酰胺键)。术语“核酸”或“核酸序列”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如dna或rna片段。
[0069]“分离的”核酸或多核苷酸意指从其天然环境中分离的任何形式的核酸或多核苷酸。例如，凝胶纯化的多核苷酸或编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸将被认为是“分离的”。此外，经工程改造以具有用于克隆的限制性位点的多核苷酸区段例如pcr产物被认为是“分离的”。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或在非天然溶液诸如缓冲液或盐水中的纯化(部分或基本上)的多核苷酸。分离的rna分子包括多核苷酸的体内或体外rna转录物，其中所述转录物在自然中不可见。分离的多核苷酸或核酸还包括此类以合成方式产生的分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包含调节元件诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
[0070]
如本文所用，术语“非自然存在的多核苷酸”或其任何语法变体是明确排除但仅排除是或可能是由法官或行政或司法机构确定或解释为是“自然存在的”的那些核酸或多核苷酸形式的条件定义。
[0071]
如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，所述核酸由可翻译成氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”(tag、tga或taa)不翻译成氨基酸，但它可以被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中例如在单一载体上，或存在于单独的多核苷酸构建体中例如在单独的(不同的)载体上。此外，任何载体可以含有单个编码区，或可以包含两个或更多个编码区，例如单个载体可以单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，载体、多核苷酸或核酸可以包含与或未与另一个编码区融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于编码特殊元件或基序的那些，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。
[0072]
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是dna。在dna的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包含启动子和/或与一个或多个编码区可操作地缔合的其他转录或翻译控制元件。可操作的缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区与一个或多个调控序列以这样的方式缔合时，使得基因产物的表达处于调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mrna的转录，并且如果两个dna片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰dna模板被转录的能力，则两个dna片段(诸如多肽编码区和与其缔合的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是指导dna在预定细胞中大量转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外的其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。
[0073]
本领域技术人员已知多种转录控制区。这些控制区包括但不限于在脊椎动物细胞
中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子a结合)、猿猴病毒40(早期启动子))和逆转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus))的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源自脊椎动物基因的转录控制区，诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子-诱导型启动子(例如，干扰素或白介素诱导型启动子)。
[0074]
类似地，本领域普通技术人员已知多种翻译控制元件。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及源自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点(或ires)，也称为cite序列)。
[0075]
在其他实施方案中，多核苷酸可以是例如信使rna(mrna)、转移rna或核糖体rna形式的rna。
[0076]
多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的另外的编码区缔合，所述分泌肽或信号肽指导由如本文公开的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦开始将生长的蛋白质链输出穿过粗面内质网，所述信号肽或分泌前导序列就会被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道，脊椎动物细胞分泌的多肽可以具有融合到多肽n端的信号肽，所述信号肽被从完整或“全长”多肽上切割下来，产生分泌的或“成熟的”多肽形式。在某些实施方案中，使用天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的功能衍生物，其保留指导与其可操作地缔合的多肽的分泌的能力。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织纤溶酶原激活剂(tpa)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。
[0077]
如本文所用，术语“结合分子”在其最广泛的意义上是指特异性结合受体或靶标(例如，表位或抗原决定簇)的分子。如本文进一步描述的，结合分子可以包含本文所述的多个“结合结构域”例如“抗原结合结构域”之一。结合分子的非限制性实例为保留抗原特异性结合的如本文详细描述的抗体或抗体样分子。在某些实施方案中，“结合分子”包含如本文详细描述的抗体或抗体样或抗体衍生的分子。
[0078]
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”(可以互换使用)是指结合分子(例如，抗体或抗体样或抗体衍生的分子)区域，其对于特异性结合靶标(例如，表位、多肽、细胞或器官)是必要且充分的。例如，作为两个单独的多肽亚基或作为单链的“fv”(例如，抗体的重链可变区和轻链可变区)被认为是“结合结构域”。其他抗原结合结构域包括但不限于衍生自骆驼科物种的抗体的单个结构域重链可变区(vhh)、或在纤连蛋白支架中表达的六个免疫球蛋白互补决定区(cdr)。如本文所述的“结合分子”或“抗体”可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个“抗原结合结构域”。
[0079]
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文可互换使用。抗体(或如本文公开的其片段、变体或衍生物，例如igm样抗体)至少包含重链可变结构域(例如，来自骆驼科物种)或至少包含重链可变结构域和轻链可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构被相对较好地理解。参见，例如，harlow等人，antibodies：a laboratory manual，(cold spring harbor laboratory press，第2版，1988)。除非另有说明，否则术语“抗体”涵盖从抗体的小
抗原结合片段到全尺寸抗体的任何事物，例如，包含两条完整重链和两条完整轻链的igg抗体、包含四条完整重链和四条完整轻链并且包含j链和/或分泌组分的iga抗体、或包含十条或十二条完整重链和十条或十二条完整轻链并且任选地包含j链或其功能片段或变体的igm衍生的结合分子，例如igm抗体或igm样抗体。
[0080]
术语“免疫球蛋白”包含可在生化上区分的各种广泛的多肽类别。本领域技术人员将理解，重链分类为伽马(gamma)、缪(mu)、阿尔法(alpha)、德尔塔(delta)或伊普西龙(epsilon)(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类别(例如，γ1至γ4或α1至α2))。此链的性质决定了抗体的“同种型”分别为igg、igm、iga、igd或ige。免疫球蛋白亚类别(亚型)，例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2等已被很好地表征，并且已知赋予功能专一性。这些免疫球蛋白中的每一种的修饰版本鉴于本公开内容对于本领域技术人员来说是容易辨别的，并且因此在本公开内容的范围内。
[0081]
轻链分类为卡帕(kappa)或兰姆达(lambda)(κ，λ)。每种重链类别都可以与卡帕或兰姆达轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价键合，并且当免疫球蛋白表达时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫键联或非共价键联彼此键合，例如通过杂交瘤、b细胞或遗传工程改造的宿主细胞。在重链中，氨基酸序列从y构型叉形末端的n端延伸到每条链底部的c端。某些抗体(例如，igg抗体)的基本结构包含通过二硫键共价连接的两个重链亚基和两个轻链亚基，以形成“y”结构(在本文中也称为“h2l2”结构)或“结合单元”。
[0082]
术语“结合单元”在本文中用于指代结合分子例如抗体、抗体样分子、或抗体衍生的分子、其抗原结合片段或其多聚片段的一部分，所述部分对应于标准的“h2l2”免疫球蛋白结构，即，两条重链或其片段和两条轻链或其片段。在例如其中结合分子为二价igg抗体或其抗原结合片段的某些实施方案中，术语“结合分子”和“结合单元”是等效的。在例如其中结合分子是多聚体例如二聚体iga抗体或iga样抗体、五聚体igm抗体或igm样抗体、或六聚体igm抗体或igm样抗体、或任何其衍生物的其他实施方案中，结合分子包含两个或更多个“结合单元”。分别在iga二聚体的情况下为两个，或在igm五聚体或六聚体的情况下为五个或六个。结合单元不需要包含全长抗体重链和轻链，但通常将是二价的，即，将包含两个如上文所定义的“抗原结合结构域”。如本文所用，本公开中提供的某些结合分子为“二聚体”，并且包含两个二价结合单元，所述结合单元包含iga恒定区或其多聚片段。本公开中提供的某些结合分子为“五聚体”或“六聚体”，并且包含五个或六个二价结合单元，所述结合单元包含igm恒定区或其多聚片段或变体。包含两个或更多个例如两个、五个或六个结合单元的结合分子例如抗体或抗体样分子或抗体衍生的结合分子在本文中称为“多聚体”。
[0083]
如本文所用，术语“j链”是指任何动物物种的igm或iga抗体的j链、其任何功能片段、其衍生物、和/或其变体，包括成熟人j链，其氨基酸序列由seq id no：6表示。本文公开了各种j链变体和修饰的j链衍生物。如本领域普通技术人员将认识到的，“功能片段”或“功能变体”包括可以与igm重链恒定区缔合以形成五聚体igm抗体的那些片段和变体。
[0084]
术语“修饰的j链”在本文中用于指代j链多肽的衍生物，其包含异源部分，例如异源多肽，例如，引入或附接至j链序列的外来结合结构域或功能结构域。可以通过任何方式实现引入，所述方式包括异源多肽或其他部分的直接或间接融合或通过经由肽或化学接头的附接。术语“修饰的人j链”涵盖但不限于通过引入异源部分例如异源多肽(例如，外来结合结构域)修饰的seq id no：6的氨基酸序列的天然序列人j链或其功能片段或其功能变
体。在某些实施方案中，异源部分不干扰igm有效聚合成五聚体或iga有效聚合成二聚体，以及此类聚合物与靶标的结合。示例性修饰的j链可见于例如以下中：美国专利号9,951,134、10,400,038和10,618,978以及美国专利申请公开号us-2019-0185570，所述专利中的每一者都通过引用以其整体并入本文。
[0085]
如本文所用，总的来说，术语“igm衍生的结合分子”指代天然igm抗体、igm样抗体、以及包含非抗体结合和/或功能结构域而不是抗体抗原结合结构域或其亚基的其他igm衍生的结合分子，以及任何片段，例如其多聚化片段、变体或衍生物。
[0086]
如本文所用，术语“igm样抗体”通常是指仍保留形成例如与j链缔合的六聚体或五聚体的能力的变体抗体或抗体衍生的结合分子。igm样抗体或其他igm衍生的结合分子通常至少包含igm恒定区的cμ4-tp结构域，但可包含来自源于同一物种或源于不同物种的其他抗体同种型(例如，igg)的重链恒定区结构域。igm样抗体或其他igm衍生的结合分子同样可为其中一个或多个恒定区缺失的抗体片段，只要igm样抗体能够形成六聚体和/或五聚体。因此，igm样抗体或其他igm衍生的结合分子可为例如杂合igm/igg抗体、或可为igm抗体的“多聚片段”。
[0087]
术语“价”、“二价”、“多价”和语法等效物是指给定结合分子(例如，抗体、抗体衍生的或抗体样分子)中或给定结合单元中结合结构域例如抗原结合结构域的数量。因此，关于给定结合分子例如igm抗体、igm样抗体、其他igm衍生的结合分子或其多聚片段，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示存在两个抗原结合结构域、四个抗原结合结构域和六个抗原结合结构域。在每个结合单元为二价的情况下，典型的igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子可具有10或12个价。二价或多价结合分子例如抗体或抗体衍生的分子可为单特异性的(即，所有抗原结合结构域是相同的)或可为双特异性或多特异性的，例如，其中两个或更多个抗原结合结构域是不同的，例如，结合同一抗原上的不同表位、或结合完全不同的抗原。
[0088]
术语“表位”包括能够特异性结合抗体、抗体样或抗体衍生的分子的抗原结合结构域的任何分子决定簇。在某些实施方案中，表位可包括分子的化学活性表面基团诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可具有三维结构特性和或比电荷特性。表位是由抗体的抗原结合结构域结合的靶区域。
[0089]
术语“靶标”在最广泛的意义上用于包括可由结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子结合的物质。靶标可为例如多肽、核酸、碳水化合物、脂质或其他分子、或此种分子上的最小表位。此外，“靶标”可为例如，细胞、器官或生物体(例如，动物、植物、细菌或病毒)，其包含可由结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子结合的表位。
[0090]
抗体、抗体样或抗体衍生的分子的轻链和重链两者分为结构同源和功能同源的区域。术语“恒定”和“可变”在功能上使用。在这方面，应当理解，可变轻链(vl)和可变重链(vh)部分两者的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(cl)和重链的恒定区结构域(例如，ch1、ch2、ch3或ch4)赋予生物学特性，诸如分泌、经胎盘移动性、fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随其离抗体的抗原结合位点或氨基端越来越远而增加。n端部分是可变区，并且c端部分是恒定区；ch3(或例如在igm的情况下为ch4)和cl结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
[0091]“全长igm抗体重链”是多肽，所述多肽在n端至c端方向上包含可包含尾部片段的
抗体重链可变结构域(vh)、抗体重链恒定结构域1(cm1或cμ1)、抗体重链恒定结构域2(cm2或cμ2)、抗体重链恒定结构域3(cm3或cμ3)和抗体重链恒定结构域4(cm4或cμ4)。
[0092]
如上所指出的那样，可变区允许结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子选择性地识别并特异性结合抗原上的表位。即，结合分子(例如，抗体、抗体样或抗体衍生的分子)的vl结构域和vh结构域或互补决定区(cdr)的子集组合以形成抗原结合结构域。更具体地，抗原结合结构域可由每个vh和vl链上的三个cdr定义。某些抗体形成较大的结构。例如，igm可以形成五聚体或六聚体分子，其包含五个或六个h2l2结合单元和任选地通过二硫键共价连接的j链。
[0093]
抗体抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或“cdr”是短的非连续氨基酸序列，当抗体假定其在水性环境中呈三维构型时，所述氨基酸序列被特异性定位以形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸称为“框架”区，其示出较小的分子间变异性。框架区主要采用β-片层构象，并且cdr形成环，所述环连接β-片层结构且在一些情形下形成其一部分。因此，框架区起形成支架的作用，所述支架提供通过链间非共价相互作用将cdr定位在正确的方向上。由定位的cdr形成的抗原结合结构域限定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。此互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员可以容易地确定分别构成cdr和框架区的氨基酸，因为它们已经以各种不同的方式定义(参见，
″
sequences of proteins of immunological interest，
″
kabat，e.，等人，u.s.department of health and human services，(1983)；和chothia和lesk，j.mol.biol.，196：901-917(1987)，所述文献通过引用以其整体并入本文)。
[0094]
在本领域内使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，本文使用的术语的定义旨在包括所有这些含义，除非明确说明相反。具体的实例是使用术语“互补决定区”(“cdr”)来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原组合位点。已例如由kabat等人，u.s.dept.of health and human services，
″
sequences of proteins of immunological interest
″
(1983)以及由chothia等人，j.mol.biol.196：901-917(1987)描述了这些特定区域，所述文献通过引用并入本文。当相互比较时，kabat定义和chothia定义包括氨基酸重叠或子集。然而，除非另有说明，否则应用任一定义(或本领域普通技术人员已知的其他定义)来指代抗体或其变体的cdr旨在落入如本文所定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上述引用的参考文献中每一者定义的cdr的适当的氨基酸列于下表1中作为比较。涵盖特定cdr的确切氨基酸数将根据cdr的序列和大小而变化。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以惯例地确定哪些氨基酸包含特定cdr。
[0095]
表1 cdr定义
*
[0096] kabatchothiavh cdr131-3526-32vh cdr250-6552-58vh cdr395-10295-102vl cdr124-3426-32vl cdr250-5650-52vl cdr389-9791-96
[0097]
*
表1中所有cdr定义的编号都是根据kabat等人列出的编号约定(参见下文)。
[0098]
例如，也可使用imgt信息系统(imgt_dot_cines_dot_fr/)(/v-quest)对抗体可变结构域进行分析，以识别可变区区段，包括cdr。(参见，例如，brochet等人，nucl.acids res.36：w503-508，2008)。
[0099]
kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可明确地将此“kabat编号”系统分配给任何可变结构域序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“kabat编号”是指由以下提出的编号系统：kabat等人，u.s.dept.of health and human services，
″
sequence of proteins of immunological interest
″
(1983)。然而，除非明确指出使用kabat编号系统，否则本公开中所有氨基酸序列使用连续编号。
[0100]
用于人igm恒定结构域的kabat编号系统可发现于kabat等人，“tabulation and analysis of amino acid and nucleic acid sequences of precursors，v-regions，c-regions，j-chain，t-cell receptors for antigen，t-cell surface antigens，β-2 microglobulins，major histocompatibility antigens，thy-1，complement，c-reactive protein，thymopoietin，integrins，post-gamma globulin，α-2 macroglobulins，and other related proteins，”u.s.dept.of health and human services(1991)中。igm恒定区可顺序地编号(即，氨基酸#1从恒定区的第一个氨基酸开始)、或通过使用kabat编号方案编号。下文列出了人igm恒定区的两个等位基因顺序地编号(在本文中表示为seq id no：1(等位基因ighm*03)和seq id no：2(等位基因ighm*04))与通过kabat系统编号的比较。加下划线的氨基酸残基不包括在kabat系统中((以下双下划线)可以是丝氨酸(s)(seq id no：1)或甘氨酸(g)(seq id no：2))：
[0101]
igm重链的顺序(seq id no：1或seq id no：2)/kabat编号键
[0102][0103]
结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子、其抗原结合片段、变体或衍生物、和/或其多聚片段包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如fab、fab
′
和f(ab
′
)2、fd、fv、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)、包含vl或vh结构域的片段、由fab表达文库产生的片段。scfv分子在本
领域中已知并且描述于例如美国专利5,892,019中。
[0104]“特异性结合”通常意指结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)通过其抗原结合结构域结合表位，并且意指结合需要抗原结合结构域与表位之间的某种互补性。根据此定义，当与随机的无关表位结合相比，结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子通过其抗原结合结构域更容易地结合一个表位时，可将其判定为“特异性结合”该表位。本文中使用术语“特异性”以限定某个结合分子与某个表位结合的相对亲和力。例如，可认为对于给定的表位，结合分子“a”比结合分子“b”具有更高的特异性，或可将结合分子“a”判定为与表位“c”结合的特异性比与相关表位“d”结合的特异性更高。
[0105]
可将本文公开的结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物判定为以小于或等于以下的解离率(k(off))与靶抗原结合：5x10-2
sec-1
、10-2
sec-1
、5x10-3
sec-1
、10-3
sec-1
、5x10-4
sec-1
、10-4
sec-1
、5x10-5
sec-1
、或10-5
sec-1
、5x10-6
sec-1
、10-6
sec-1
、5x10-7
sec-1
或10-7
sec-1
。
[0106]
可将本文公开的结合分子例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物判定为以大于或等于以下的缔合率(k(on))与靶抗原结合：103m-1
sec-1
、5x103m-1
sec-1
、104m-1
sec-1
、5x104m-1
sec-1
、105m-1
sec-1
、5x105m-1
sec-1
、106m-1
sec-1
、或5x106m-1
sec-1
或107m-1
sec-1
。
[0107]
如果结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物优先结合到给定表位至其(在某种程度上)阻断参考抗体或抗原结合片段与所述表位的结合的程度，则据说所述结合分子竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与所述表位的结合。竞争性抑制可通过本领域已知的任何方法例如竞争elisa测定来确定。可将结合分子判定为竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合达至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
[0108]
如本文所用，术语“亲和力”是指单个表位与例如免疫球蛋白分子的一个或多个抗原结合结构域结合的强度的量度。参见，例如，harlow等人，antibodies：a laboratory manual，(cold spring harbor laboratory press，第2版，1988)，第27-28页。如本文所用，术语“亲合力”是指抗原结合结构域群体与抗原之间的复合物的总体稳定性。参见，例如，harlow，第29至34页。亲和力不仅与群体中单个抗原结合结构域与特定表位的亲和力有关，并且还与免疫球蛋白和抗原的价有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构诸如聚合物的抗原之间的相互作用将是高亲合力的相互作用。二价单克隆抗体与在细胞表面上以高密度存在的受体之间的相互作用也将具有高亲合力。
[0109]
如本文所公开的结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物也可根据其交叉反应性来描述或指定。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物与第二抗原反应的能力；两种不同抗原物质之间相关性的量度。因此，如果结合分子与同诱导其形成的表位不同的表位结合，则结合分子是交叉反应的。交叉反应表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下可以实际上比原始表位更适合。
[0110]
结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物也可以根据它们对抗原的结合亲和力来描述或指定。例如，结合分子可以不大于以下的解离常数或kd与抗原结合：5x10-2
m、10-2
m、5x10-3
m、10-3
m、5x10-4
m、10-4
m、5x10-5
m、10-5
m、5x10-6
m、10-6
m、5x10-7
m、10-7
m、5x10-8
m、10-8
m、5x10-9
m、10-9
m、5x10-10
m、10-10
m、5x10-11
m、10-11
m、5x10-12
m、10-12
m、5x10-13
m、10-13
m、5x10-14
m、10-14
m、5x10-15
m或10-15
m。
[0111]
包括单链抗体或其他抗原结合结构域的“抗原结合抗体片段”可以单独存在或与
以下中的一种或多种组合存在：铰链区、ch1、ch2、ch3或ch4结构域、j链或分泌组分。还包括抗原结合片段，所述抗原结合片段可包括一个或多个可变区与以下中的一个或多个的任何组合：铰链区、ch1、ch2、ch3或ch4结构域、j链或分泌组分。结合分子例如抗体或其抗原结合片段可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。抗体可为例如人、鼠科动物、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在另一个实施方案中，可变区可为软骨鱼(condricthoid)来源的(例如，来自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从针对一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物分离的抗体，并且可在一些情况下表达内源性免疫球蛋白，而在一些情况下不表达，如描述于下文中，并且例如描述于kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中。根据本公开的实施方案，如本文提供的igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子可包括抗体的抗原结合片段例如scfv片段，只要igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子能够形成多聚体例如六聚体或五聚体。如本文所用，这样的片段包括“多聚化片段”。
[0112]
如本文所用，术语“重链亚基”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列，包含重链亚基的结合分子(例如，抗体、抗体样或抗体衍生的分子)可包含以下中的至少一个：vh结构域、ch1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域、ch4结构域或其变体或片段。例如，除了vh结构域之外，结合分子(例如，抗体、抗体样或抗体衍生的分子或片段例如其多聚化片段、变体或衍生物)可包括但不限于：ch1结构域；ch1结构域、铰链和ch2结构域；ch1结构域和ch3结构域；ch1结构域、铰链和ch3结构域；或ch1结构域、铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域。在某些实施方案中，除了vh结构域之外，结合分子(例如，抗体、抗体样或抗体衍生的分子或片段例如其多聚化片段、变体或衍生物)可包括ch3结构域和ch4结构域；或ch3结构域、ch4结构域和j链。此外，用于本公开的结合分子例如抗体或抗体样或抗体衍生的分子可缺乏某些恒定区部分例如ch2结构域的全部或部分。本领域普通技术人员将理解，可修饰这些结构域(例如，重链亚基)，使得其在氨基酸序列上与原始免疫球蛋白分子不同。根据本公开的实施方案，如本文提供的igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子包含igm重链恒定区的足够部分，以允许igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子形成多聚体例如六聚体或五聚体。如本文所用，这样的片段包括“多聚化片段”。
[0113]
如本文所用，术语“轻链亚基”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚基至少包括vl，并且还可包括cl(例如，cκ或cλ)结构域。
[0114]
结合分子(例如，抗体、抗体样分子、抗体衍生的分子、其抗原结合片段、变体或衍生物)可根据其识别或特异性结合的靶标例如靶抗原的一个或多个表位或部分来描述或指定。与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的靶抗原的部分为“表位”或“抗原决定簇”。靶抗原可包含单个表位或至少两个表位，并且可包括任意数量的表位，其取决于抗原的大小、构象和类型。
[0115]
如本文所用，术语“二硫键”包括例如在多肽的半胱氨酸残基中两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。二硫键可以是“链内”，即连接到单个多肽或多肽亚基中的半胱氨酸残基，或者可以是“链间”，即连接两个单独的多肽亚基，例如抗体重链和抗体轻链、或抗体重链、或igm或iga抗体重链恒定区和j链。
[0116]
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫反应区或位点获自或衍生自第一种物种且恒定区(其可以是完整的、部分的或修饰的)获自第二物种的抗体。在一些实施方案中，靶结合区或位点将来自非人来源(例如，小鼠或灵长类动物)，并且恒定区为人来源的。
[0117]
术语“多特异性抗体”或“双特异性抗体”是指在单个抗体分子内具有针对两个或更多个不同表位的抗原结合结构域的抗体、抗体样或抗体衍生的分子。除标准抗体结构外，其他结合分子可以两种结合特异性构建。双特异性或多特异性抗体的表位结合可以是同时的或顺序的。triomas和杂合杂交瘤是可以分泌双特异性抗体的细胞系的两个实例。双特异性抗体还可通过重组方式构建。(和heiss，future oncol.6：1387-94(2010)；mabry和snavely，idrugs.13：543-9(2010))。双特异性抗体还可为双体抗体。
[0118]
如本文所用，术语“工程抗体”是指其中可变结构域、恒定区和/或j链通过一个或多个氨基酸的至少部分替代而改变的抗体。在某些实施方案中，可以将来自已知特异性抗体的完整cdr移植到异源抗体的框架区中。尽管替代的cdr可以衍生自与衍生框架区的抗体相同类别或甚至亚类别的抗体，但cdr也可以衍生自不同类别的抗体例如衍生自来自不同物种的抗体。其中将来自已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”cdr移植到人重链或轻链框架区中的工程化抗体在本文中称为“人源化抗体”。在某些实施方案中，并不是所有的cdr都被来自供体可变区的完整cdr替代，但是供体的抗原结合能力仍然可转移到受体可变结构域。根据在例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中所阐述的解释，通过进行常规实验或通过反复测试来获得功能性工程化抗体或人源化抗体将完全在本领域技术人员的能力范围内。
[0119]
如本文所用，术语“工程化”包括通过合成方式(例如，通过重组技术、体外肽合成、通过肽、核酸或聚糖的酶促或化学偶联、或这些技术的某种组合)对核酸或多肽分子进行操纵。
[0120]
如本文所用，术语“连接”、“融合”或其他语法等效物可互换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组方式在内的任何方式将两个或更多个元件或组分连接在一起。“框内融合”是指以维持原始orf的翻译阅读框的方式连接两个或更多个多核苷酸开放阅读框(orf)以形成连续较长的orf。因此，重组融合蛋白是含有两个或更多个对应于由原始orf编码的多肽的区段的单一蛋白质(所述区段在自然界中通常不会如此连接)。尽管因此使阅读框在整个融合区段中是连续的，但区段可以通过例如框内接头序列在物理上或空间上分离。例如，编码免疫球蛋白可变区的cdr的多核苷酸可在框内融合，但是被编码至少一个免疫球蛋白框架区或另外的cdr区的多核苷酸分离，只要“融合”cdr作为连续多肽的一部分共同翻译。
[0121]
在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是氨基酸在多肽中从氨基端到羧基端方向的顺序，其中序列中彼此紧邻的氨基酸在多肽的初级结构中是连续的。对于多肽的一部分是“氨基端”或“n端”的多肽的另一部分是在顺序多肽链中较早出现的部分。类似地，对于多肽的一部分是“羧基端”或“c端”的多肽的另一部分是在顺序多肽链中较晚出现的部分。例如，在典型的抗体中，对于恒定区，可变结构域是“n端”，而对于可变结构域，恒定区是“c端”。
[0122]
如本文所用，术语“表达”是指基因产生生物化学物质例如多肽的过程。该过程包括细胞内基因功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达两
者。该过程包括但不限于将基因转录成rna例如信使rna(mrna)，以及将这种mrna翻译成多肽。如果最终所需产物是生物化学物质，则表达包括所述生物化学物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸例如通过基因转录产生的信使rna，或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如，聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、脂质的添加、与其他蛋白质亚基的缔合、蛋白水解切割等)的多肽。
[0123]
术语“n连接的寡糖”、“n连接的糖”、“n连接的聚糖”或其他类似或语法变体表示通过天冬酰胺残基与肽骨架连接的寡糖链。所有n连接的寡糖都具有共同的man3glcnac2五糖核心，也称为“简单寡糖”，参见图1a。n连接的聚糖一般可分类为三种类型：(1)寡甘露糖，其中仅甘露糖残基附接至核心(图1b)；(2)复合物，其中由n-乙酰胺基葡萄糖转移酶(glcnact)启动的“触角”附接至核心(图1c)；以及(3)杂合体，其中仅甘露糖残基附接至核心的manα1-6臂且一个或两个触角在manα1-3臂上(图1d)。参见，例如，varki，a.，和schauer，r.，essentials of glycobiology，第3版，第8章，consortium of glycobiology(2009)。
[0124]
术语“糖基转移酶”表示能够将单糖部分从核苷酸糖转移至受体分子诸如寡糖的酶。此类糖基转移酶的实例包括但不限于葡糖基转移酶、甘露糖基转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。这些酶通常是位于细胞高尔基体中的ii型膜蛋白，其中酶的活性部分位于高尔基体管腔中。在糖基转移酶催化中，单糖底物单元葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)、n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)、n-乙酰半乳糖胺(galnac)、葡萄糖醛酸(glcua)、半乳糖醛酸(galua)和木糖被活化为尿苷二磷酸(udp)-α-d衍生物；阿拉伯糖被活化为udp-β-l衍生物；甘露糖(man)和岩藻糖分别被活化为gdp-α-d和gdp-β-l衍生物；并且唾液酸(＝β-d-neu5ac；＝neu5ac；＝sa；＝nana)被活化为唾液酸的cmp衍生物。参见，例如，美国专利申请公开号us 2017/0298405。
[0125]
术语“唾液酸”表示九碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族中最常见的成员是n-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺基-3，5-二脱氧-d-甘油-d-半乳壬酮吡喃糖-1-酮酸(通常缩写为neu5ac、neuac、或nana)。图2a，参见，例如，varki，a.，和schauer，r.，essentials of glycobiology，第3版，第14章，consortium of glycobiology(2009)。
[0126]
唾液酸转移酶(＝“st”)是一种糖基转移酶，其催化唾液酸残基从供体底物转移到例如糖蛋白的n连接的聚糖的末端单糖受体基团。包括人类st物种的哺乳动物唾液酸转移酶使用共同的供体底物，即胞苷-5
′‑
单磷酸-n-乙酰神经氨酸(＝cmp-β-d-neu5ac；＝cmp-neu5ac；＝cmp-nana；＝cmp-唾液酸；＝cmp-sa，图2b)。其他功能等效物是已知的，包括但不限于用于通过“点击”化学进行聚糖标记的叠氮基-cmp-唾液酸。参见，例如，moh，等人，anal.biochem.584：11385(2019)。唾液酸残基(或其功能等效物)到受体位点的转移和共价偶联也称为“唾液酸化(sialylating)”和“唾液酸化(sialylation)”。
[0127]
末端唾液酸残基可以通过各种键联与半乳糖残基偶联，例如，(i)α2
→
3(α2，3)连接至半乳糖或(ii)α2
→
6(α2，6)连接至半乳糖。唾液酸转移酶通常根据其相应的单糖受体底物且根据其催化的糖苷键的位置来命名和分类。示例性真核唾液酸转移酶包括(i)st3gal(例如，见于cho细胞中)和(ii)见于人细胞中的st6gal。“st3”的速记参考特别地涵盖催化α2，3唾液酸化的唾液酸转移酶。“st6”的速记参考特别地涵盖催化α2，6唾液酸化的
唾液酸转移酶。
[0128]
二糖部分β-d-半乳糖基-1，4-n-乙酰基-β-d-葡糖胺(＝galβ1，4glcnac)是糖蛋白的n连接的聚糖触角的常见唾液酸受体。此外，由于半乳糖基转移酶例如人β-1，4-半乳糖基转移酶4(＝”hb4galt4”)的酶活性，可以在某些靶糖蛋白中产生末端galβ1，4glcnac部分。所述酶β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶(＝“st6gal”)能够催化聚糖或聚糖的分支或触角的末端galβ1，4glcnac受体部分的α2，6-唾液酸化。
[0129]
st6gal酶的活性催化neu5ac残基转移到游离半乳糖残基的c6羟基，所述半乳糖残基是聚糖或聚糖的触角中末端galβ1，4glcnac的一部分，从而在聚糖中形成与galβ1，4glcnac部分的半乳糖残基连接的末端唾液酸残基α2
→
6。
[0130]
人β-半乳糖苷-α-2，6-唾液酸转移酶i(hst6gal-i，uniprotkb/swiss-prot：p15907.1)的野生型多肽呈现为seq id no：3。哺乳动物唾液酸转移酶与其他哺乳动物高尔基体糖基转移酶共享具有胞质n端尾、跨膜区、可变长度的茎区和高尔基体管腔中的c端催化结构域的ii型架构。hst6gal-1的胞质区包括seq id no：3的氨基酸1-9，跨膜区包括seq id no：3的氨基酸10-26，而管腔区包括seq id no：3的氨基酸27-406。hst6gal-i的可溶性变体将至少缺少跨膜区，并且可能还缺少n端胞质区，以及管腔区的一些部分，只要所述酶保留催化活性。在某些实施方案中，st6gal1的可溶性变体可包括seq id no：3的氨基酸x至406，其中x是27至120的整数。例如，st6gal1的可溶性变体可包括seq id no：3的氨基酸120至406、115至406、110至406、109至406、105至406、100至406、95至406、90至406、89至406、88至406、87至406、86至406、85至406、84至406、83至406、82至406、81至406、80至406、75至406、70至406、65至406、60至406、55至406、50至406、45至406、40至406、35至406、30至406、或27至406。美国专利申请号us 2017/0298405报道了在游离cmp存在下，seq id no：3的氨基酸90-109赋予所述酶另外的唾液酸酶活性。
[0131]
人β-1，4-半乳糖基转移酶4(hb4galt4，uniprotkb/swiss-prot：o60513.1)的野生型多肽表示为seq id no：4。这种酶同样具有ii型架构，所述架构具有胞质n端区、跨膜区、可变长度的茎区和高尔基体管腔中的c端催化区。hb4galt4的胞质区包括seq id no：4的氨基酸1-12，跨膜区包括seq id no：4的氨基酸13-38，而管腔区包括seq id no：4的氨基酸39-344。hb4galt4的可溶性变体将至少缺少跨膜区，并且可能还缺少n端胞质区，以及管腔区的一些部分，只要所述酶保留催化活性。在某些实施方案中，hb4galt4的可溶性变体可以包括seq id no：4的氨基酸x至344，其中x是39至120的整数。例如，hb4galt4的可溶性变体可包括seq id no：4的氨基酸120至344、115至344、110至344、105至344、100至344、95至344、90至344、85至344、80至344、75至344、70至344、65至344、60至344、55至344、50至344、45至344、40至344、或39至344。
[0132]
术语诸如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或者“缓解(alleviating)”或“缓解(to alleviate)”是指治愈、减缓、减轻现有诊断出的病理病状或病症的症状和/或停止或减慢现有诊断出的病理病状或病症的进展的治疗措施。术语诸如“防止(prevent)”、“防止(prevention)”、“避免(avoid)”、“阻遏(deterrence)”等是指防止未诊断出的靶向的病理病状或病症的发展的预防或防止措施。因此，“需要治疗的那些”可包括已经患有病症的那些和/或易患病症的那些。
[0133]
如本文所用，术语“血清半衰期”或“血浆半衰期”是指施用后使药物(例如，结合分
子诸如抗体、抗体样或抗体衍生的分子或片段例如其多聚化片段)的血清或血浆浓度降低50％所需的时间(例如，以分钟、小时或天为单位)。可描述两个半衰期：α半衰期、α半衰期或t
1/2
α，其是由于药物从中央室(例如，在静脉内递送情况下的血液)到外周室(例如，组织或器官)的重新分配过程引起的血浆浓度下降速率，以及β半衰期、β半衰期或t
1/2
β，其是由于排泄或代谢过程引起的下降速率。
[0134]
如本文所用，术语“血浆药物浓度-时间曲线下面积”或“auc”反映了在施用一剂药物之后身体对药物的实际暴露，并表示为mg*h/l。此曲线下面积可以测量(例如从时间0(t0)到无穷大(∞))并且取决于药物从体内消除的速率和施用的剂量。
[0135]
如本文所用，术语“平均停留时间”或“mrt”是指药物留在体内的平均时间长度。
[0136]“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指任何受试者。在某些实施方案中，受试者是需要诊断、预后或治疗的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物动物，诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。
[0137]
如本文所用，如术语“将从治疗中受益的受试者”是指所有预期受试者中将受益于施用给定的治疗剂的受试者的子集，所述治疗剂例如，结合分子诸如包含一个或多个抗原结合结构域的抗体。此类结合分子例如抗体可以例如用于诊断程序和/或用于治疗或预防疾病。
[0138]
igm抗体、igm样抗体、其他igm衍生的结合分子和此类分子的群体
[0139]
igm是b细胞响应抗原刺激而产生的第一免疫球蛋白。天然存在的igm天然存在于在血清中，1.5mg/ml左右，半衰期约为5天。igm是五聚体或六聚体分子，因此包含五个或六个结合单元。igm结合单元通常包含两条轻链和两条重链。尽管igg重链恒定区含有三个重链恒定结构域(ch1、ch2和ch3)，但是igm的重(μ)恒定区另外含有第四恒定结构域(ch4)并且包含c端“尾部片段”。人igm恒定区通常包含氨基酸序列seq id no：1(等同于例如genbank登录号pir||s37768、caa47708.1和caa47714.1，等位基因ighm*03)或seq id no：2(等同于例如genbank登录号sp|p01871.4，等位基因ighm*04)。人cμ1区在seq id no：1或seq id no：2的约氨基酸5至约氨基酸102范围内；人cμ2区在seq id no：1或seq id no：2的约氨基酸114至约氨基酸205范围内、人cμ3区在seq id no：1或seq id no：2的约氨基酸224至约氨基酸319范围内、cμ4区在seq id no：1或seq id no：2的约氨基酸329至约氨基酸430范围内，并且尾部片段在seq id no：1或seq id no：2的约氨基酸431至约氨基酸453范围内。
[0140]
存在具有微小序列变化的人igm恒定区的其他形式和等位基因的，包括但不限于genbank登录号cab37838.1和pir||mhhu。在与本公开别处描述和要求保护的seq id no：1或seq id no：2相对应的位置处的氨基酸取代、插入和/或缺失同样可并入替代的人igm序列中，以及并入其他物种的igm恒定区氨基酸序列中。
[0141]
如本文所提供的人igm恒定区以及某些非人灵长类动物igm恒定区通常包含五(5)个天然存在的天冬酰胺(n)连接的糖基化基序或位点。参见图3a和3b。如本文所用，“n连接的糖基化基序”包含氨基酸序列n-x
1-s/t或由其组成，其中n是天冬酰胺、x1是除脯氨酸(p)之外的任何氨基酸、并且s/t是丝氨酸(s)或苏氨酸(t)。聚糖与天冬酰胺残基的氮原子附接。参见，例如，drickamer k，taylor me(2006)，introduction to glycobiology(第2版)
.oxford university press，usa。n连接的糖基化基序出现在seq id no：1或seq id no：2的人igm重链恒定区中，从位置46(“n1”)、209(“n2”)、272(“n3”)、279(“n4”)和440(“n5”)开始。这五个基序在非人灵长类动物igm重链恒定区中是保守的，而五个中的四个在小鼠igm重链恒定区中是保守的。参见，例如，图3b。
[0142]
对重组以及血清衍生的人igm的研究已表明，人igm重链上的n1、n2和n3基序主要但并非总是用复杂型n聚糖来装饰，其中n4和n5基序是主要但并非总是用寡甘露糖型n聚糖来装饰。参见，例如，moh，e.s.x.，等人，j.am.soc.mass spectrom.27：1143-1155(2016)和hennicke，j.，等人，anal.biochem.539：162-166(2017)。
[0143]
每个igm重链恒定区可以与结合结构域例如抗原结合结构域(例如，scfv或vhh)或抗原结合结构域的亚基(例如，vh区)缔合。在某些实施方案中，结合结构域可以是非抗体结合结构域，例如，受体胞外域、配体或其受体结合片段、细胞因子或其受体结合片段、生长因子或其受体结合片段、神经递质或其受体结合片段、肽或蛋白质激素或其受体结合片段、免疫检查点调节剂配体或其受体结合片段、或细胞外基质蛋白的受体结合片段。参见，例如，pct申请公开号wo 2020/086745，所述申请通过引用以其整体并入本文。
[0144]
五个igm结合单元可以与另一小多肽链(j链)、或其功能片段、变体或衍生物形成复合物，以形成五聚体igm抗体或igm样抗体。人j链的前体形式表示为seq id no：5。信号肽从seq id no：5的氨基酸1延伸至约氨基酸22，并且成熟人j链从seq id no：5的约氨基酸23延伸至氨基酸159。成熟人j链包含氨基酸序列seq id no：6。
[0145]
示例性变体和修饰的j链在本文别处提供。在没有j链的情况下，igm抗体或igm样抗体通常组装成六聚体，其包含多至十二个抗原结合结构域。在有j链的情况下，igm抗体或igm样抗体通常组装成五聚体，其包含多至十个抗原结合结构域，或如果所述j链是包含有包含另外的抗原结合结构域的一个或多个异源多肽的修饰的j链时，则包含更多个抗原结合结构域。五个或六个igm结合单元组装成五聚体或六聚体igm抗体或igm样抗体被认为涉及cμ4和尾部片段结构域。参见，例如，braathen，r.，等人，j.biol.chem.277：42755-42762(2002)。因此，本公开中提供的五聚体或六聚体igm抗体通常包含至少cμ4和/或尾部片段结构域(在本文中也统称为cμ4-tp)。因此，igm重链恒定区的“多聚化片段”至少包含cμ4-tp结构域。igm重链恒定区还可以包含cμ3结构域或其片段、cμ2结构域或其片段、cμ1结构域或其片段、和/或其他igm重链结构域。在某些实施方案中，如本文提供的igm衍生的结合分子(例如，igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子)可以包含例如像本文提供的完整的igm重(μ)链恒定结构域，例如seq id no：1或seq id no：2、或其变体、衍生物或类似物。
[0146]
在某些实施方案中，本公开提供了多聚体例如五聚体或六聚体结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子包含十个或十二个igm衍生的重链，并且其中igm衍生的重链包含糖基化的igm重链恒定区，所述恒定区中每一者与特异性结合靶标的结合结构域缔合。这些实施方案在本公开别处详细描述。在某些实施方案中，本公开提供了一种包含五个或六个二价结合单元的igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子，其中每个结合单元包含两个igm或igm样重链恒定区或其多聚化片段或变体，其各自与抗原结合结构域或其亚基缔合。在某些实施方案中，包含在每个结合单元中的两个igm重链恒定区为人重链恒定区。
[0147]
当本公开中提供的igm抗体、igm样抗体、其他igm衍生的结合分子或多聚体结合分子的单克隆群体是五聚体时，igm抗体、igm样抗体、其他igm衍生的结合分子或包含在多聚
体结合分子的单克隆群体中的分子通常还包含j链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，j链为修饰的j链或其变体，其还包含一个或多个与j链附接的异源部分，如本文别处所述。在某些实施方案中，j链可以发生突变以影响例如增强本文提供的igm抗体、igm样抗体、其他igm衍生的结合分子或多聚体结合分子的单克隆群体的血清半衰期，如本公开别处所讨论。在某些实施方案中，j链可以发生突变以影响糖基化，如本公开别处所讨论。
[0148]
igm重链恒定区可以包含一个或多个cμ1结构域或其片段或变体、cμ2结构域或其片段或变体、cμ3结构域或其片段或变体、和/或cμ4结构域或其片段或变体，只要是恒定区可以在igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子中发挥所需功能，例如，与第二igm恒定区缔合以形成具有一个、两个或更多个抗原结合结构域的结合单元，和/或与其他结合单元(并且在五聚体的情况下，j链)缔合以形成六聚体或五聚体。在某些实施方案中，在单个结合单元内的两个igm重链恒定区或其片段或变体各自包含cμ4结构域或其片段或变体、尾部片段(tp)或其片段或变体、或cμ4结构域与tp或其片段或变体的组合。在某些实施方案中，在单个结合单元内的两个igm重链恒定区或其片段或变体各自还包含cμ3结构域或其片段或变体、cμ2结构域或其片段或变体、cμ1结构域或其片段或变体、或其任何组合。
[0149]
修饰的j链
[0150]
在某些实施方案中，如本文提供的五聚体igm衍生的结合分子例如igm抗体或igm样抗体的j链可以例如通过引入异源部分(例如，多肽)或两个或更多个异源部分来修饰，而不干扰igm抗体、igm样抗体、其他igm衍生的结合分子或多聚体结合分子的单克隆群体组装并结合其一个或多个结合靶标的能力。参见美国专利号9,951,134、10,400,038和10,618,978以及美国专利申请公开号us-2019-0185570，所述专利中的每一者都通过引用以其整体并入本文。因此，包含如本文别处所述的多特异性igm或igm样抗体的由本公开提供的igm抗体、igm样抗体，其他igm衍生的结合分子或多聚体结合分子的单克隆群体可以包含修饰的j链或其功能片段或变体，其包含引入(例如，融合或化学上缀合)到j链或其片段或变体中的异源部分，例如异源多肽。在某些实施方案中，异源部分可为与j链框内融合或化学缀合到j链或其片段或变体的肽或多肽序列。在某些实施方案中，异源多肽通过肽接头(例如，由至少5个氨基酸但不超过25个氨基酸组成的肽接头)与j链或其功能片段融合。在某些实施方案中，肽接头由ggggs(seq id no：41)、ggggsggggs(seq id no：42)、ggggsggggsggggs(seq id no：43)、ggggsggggsggggsggggs(seq id no：44)或ggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no：45)组成。在某些实施方案中，异源部分可为与j链缀合的化学部分。与j链附接的异源部分可以包括但不限于结合部分(例如抗体或其抗原结合片段，例如单链fv(scfv)分子)、细胞因子(例如，il-2或il-15)(参见，例如，pct申请公开号wo 2020/086745，所述申请通过引用以其整体并入本文)、可增加igm抗体、igm样抗体、其它igm衍生的结合分子或多聚体结合分子的单克隆群体的半衰期的稳定肽(例如，人血清白蛋白(hsa)或或hsa结合分子)、或异源化学部分诸如聚合物或细胞毒素。
[0151]
在一些实施方案中，修饰的j链可以包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域可包含但不限于能够特异性结合靶抗原的多肽。在某些实施方案中，与修饰的j链缔合的抗原结合结构域可为抗体或其抗原结合片段，如本文别处所述。在某些实施方案中，抗原结合结构域可为例如衍生自骆驼科或软骨鱼抗体的scfv抗原结合结构域或单链抗原结合结构域。可在允许抗原结合结构域与其结合靶标结合的任何位置将抗原结合结构域引入j链中，而
不干扰j链功能或相关igm或iga抗体的功能。插入位置包括但不限于在c端处或其附近、在n端处或其附近、或者在基于j链的三维结构可接近的内部位置处。在某些实施方案中，可将抗原结合结构域引入seq id no：6的半胱氨酸残基92与101之间的seq id no：6的成熟人j链中。在另一实施方案中，可在糖基化位点处或其附近将抗原结合结构域引入seq id no：6的人j链中。在另一实施方案中，可将抗原结合结构域引入seq id no：6的人j链中，其距c端在约10个氨基酸残基内、或距n端在约10个氨基酸内。
[0152]
在某些实施方案中，如本文提供的igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子的j链包含在与成熟野生型人j链的氨基酸y102(seq id no：6)对应的氨基酸位置处的氨基酸取代。“对应于成熟野生型人j链的氨基酸y102的氨基酸”意指与人j链中的y102同源的任何物种的j链的序列中的氨基酸。参见美国专利申请公开号us 2020-0239572，所述专利通过引用以其整体并入本文。与seq id no：6中y102对应的位置在至少43个其他物种的j链氨基酸序列中是保守的。参见美国专利号9,951,134的图4，其通过引用并入本文。在对应于seq id no：6的y102的位置处的某些突变可抑制某些免疫球蛋白受体(例如，人或鼠科动物fcαμ受体、鼠科动物fcμ受体、和/或人或鼠科动物聚合物ig受体(pig受体))与包含突变j链的igm五聚体的结合。当施用于动物时，在对应于seq id no：6的y102的氨基酸处包含突变的igm抗体、igm样抗体、其他igm衍生的结合分子或多聚体结合分子的单克隆群体具有比除了所述取代之外均相同的对应的抗体、抗体样分子、结合分子或结合分子的单克隆群体提高的血清半衰期，并且上述两者以相同的方式施用于相同的物种。在某些实施方案中，与seq id no：6的y102对应的氨基酸可被任何氨基酸取代。在某些实施方案中，与seq id no：6的y102对应的氨基酸可被丙氨酸(a)、丝氨酸(s)或精氨酸(r)取代。在一个特定实施方案中，与seq id no：6的y102对应的氨基酸可被丙氨酸取代。在一个特定实施方案中，j链或其功能片段或变体为在本文中称为“j*”的变体人j链，并且包含氨基酸序列seq id no：7。
[0153]
高度唾液酸化的igm衍生的结合分子的群体
[0154]
本公开提供了多聚体结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子包含十个或十二个igm衍生的重链，所述重链各自包含与特异性结合靶标的结合结构域缔合的糖基化的igm重链恒定区，或其多聚化片段。在某些实施方案中，每个igm重链恒定区包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个天冬酰胺(n)连接的糖基化基序，其中n连接的糖基化基序包含氨基酸序列n-x
1-s/t，其中n是天冬酰胺、x1是除脯氨酸以外的任何氨基酸、并且s/t是丝氨酸或苏氨酸。在某些实施方案中，每个igm重链恒定区上的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个n连接的糖基化基序由如本文别处定义的复合聚糖占据。尽管人或非人灵长类动物igm重链恒定区通常包含五个n连接的糖基化基序n1至n5，但如前所指出，n4和n5通常(但并非总是)由寡甘露糖型寡糖，而不是复合寡糖占据。因此，在某些实施方案中，每个igm重链恒定区上的至少三个n连接的糖基化基序(例如，n1、n2和n3)由复合聚糖占据。
[0155]
在某些实施方案中，由本公开提供的结合分子的单克隆群体包含的唾液酸化水平高于在正常循环中观察或测量的igm抗体的水平，即，所提供的结合分子的单克隆群体包含非天然存在的唾液酸化水平。如由发明人所测量的(参见，例如，实施例4)，从正常循环中分离的人igm抗体的平均唾液酸化水平为每摩尔igm约30-32摩尔唾液酸。因此，本公开提供了如上所指出的多聚体结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子至少三十三(33)、至
少三十四(34)、或至少三十五(35)摩尔唾液酸。唾液酸残基通常是复合聚糖上的末端单糖，并且单个寡糖聚糖可以包含例如一个、两个、三个或四个唾液酸单糖，这取决于寡糖上的触角数量。在某些实施方案中，所提供的结合分子的单克隆群体可以包含更高的唾液酸化水平，例如结合分子的单克隆群体可以包含每摩尔结合分子至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少124、至少130、至少140或146摩尔唾液酸。在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子33-146摩尔唾液酸，诸如每摩尔结合分子33-130、33-120、33-110、33-100、33-90、33-80、33-70、33-60、33-50、35-130、35-120、35-110、35-100、35-90、35-80、35-70、35-60、35-50、45-130、45-120、45-110、45-100、45-90、45-80、45-70、45-60、45-50、50-130、50-120、50-110、50-100、50-90、50-80、50-70或50-60摩尔唾液酸。在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子约35至约40、约35至约45、约35至约50、约35至约55、约35至约60、约35至约65、约35至约70、约40至约45、约40至约50、约40至约55、约40至约60、约40至约65、约40至约70、约45至约50、约45至约55、约45至约60、约45至约65、约45至约70、约50至约55、约50至约60、约50至约65、约50至约70、约55至约60、约55至约65、约55至约70、约60至约65、约60至约70或约65至约70摩尔唾液酸。在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子约40至约55摩尔唾液酸。如本文的实施例中所证明的，与具有较低唾液酸水平的结合分子相比，具有高于每摩尔结合分子35摩尔唾液酸的唾液酸水平的相同结合分子的单克隆群体具有改善的结合分子的药代动力学性质。对于某些情况，可能需要制备和使用结合分子的单克隆群体，其中唾液酸水平不在最大可能水平，诸如每摩尔结合分子约40至约55摩尔唾液酸。此类分子可具有其他所需性质，诸如不同的溶解度、制造容易程度、和/或免疫原性。
[0156]
如由本公开所提供的，所提供的结合分子的群体中的每条igm衍生的重链包含糖基化的igm或igm衍生的重链恒定区或其多聚化片段或衍生物，其可以是与特异性结合感兴趣的靶标的结合结构域(例如，抗体抗原结合结构域)缔合的全长igm重链恒定区、igm重链恒定区的多聚化片段、或包含至少多聚化所需的igm重链恒定区的最小部分的杂合恒定区。在一些实施方案中，igm重链恒定区衍生自人igm重链恒定区，其包含从对应于seq id no：1(等位基因ighm*03)或seq id no：2(等位基因ighm*04)的氨基酸46(基序n1)、氨基酸209(基序n2)、氨基酸272(基序n3)、氨基酸279(基序n4)和氨基酸440(基序n5)的氨基酸位置处开始的多达五个n连接的糖基化基序n-x
1-s/t。结合靶标的结合结构域可以是例如抗原结合结构域或抗原结合结构域的亚基，例如抗体的重链可变区(vh)。本公开涉及结合任何感兴趣的靶标的结合分子。
[0157]
由本公开提供的结合分子的单克隆群体可以多种不同的方式产生，所述方式包括但不限于修饰表达结合分子的群体的细胞系、通过在下游加工期间对结合分子的单克隆群体进行体外糖工程化、或这些的任何组合、或其他方法。
[0158]
在某些实施方案中，所提供的多聚体结合分子的高度唾液酸化的单克隆群体是通过细胞系修饰产生的。如由本公开提供的增加结合分子的单克隆群体的唾液酸化的细胞系修饰包括但不限于用一种或多种编码糖基转移酶例如半乳糖基转移酶(以通过α-2，6和/或α-2，3键联为唾液酸残基提供受体残基，参见，例如，图1c和id)的基因和/或一种或多种唾液酸转移酶转染产生结合分子的单克隆群体的细胞系来产生过表达这些酶(糖基转移酶“敲入”)的细胞系，从而改善和/或增加所述细胞系促进唾液酸单糖从cmp-nana底物或其衍生物转移到相容受体寡糖的能力。其他细胞系修饰包括缺失或“敲除”通常由细胞系产生的唾液酸酶。用于“敲入”各种葡糖基转移酶的方法在实施例中进行了描述，并且除此以外是本领域普通技术人员熟知的。同样地，用于“敲除”编码例如细胞系中的唾液酸酶的基因的方法对于技术人员来说是容易获得的。
[0159]
示例性唾液酸转移酶是人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1，也称为st6gal1(seq id no：3)。其他可以“敲入”的唾液酸转移酶包括人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶-ii(st6galii)和四种β-半乳糖苷α2-3-唾液酸转移酶(st3gal-i-iv)中的任一种。示例性半乳糖基转移酶是人β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)(seq id no：4)。
[0160]
在某些实施方案中，所提供的高度唾液酸化的多聚体结合分子的单克隆群体通过糖工程化例如通过在下游加工期间将唾液酸残基添加到结合分子的单克隆群体中产生，以产生例如糖工程化的igm抗体、igm样抗体或igm衍生的结合分子(gem)的单克隆群体。在某些实施方案中，体外糖工程化包括在其中将唾液酸从cmp-nana转移到结合分子的群体上的复合聚糖上的半乳糖残基的条件下，使结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶(或附接至固体支持物的可溶性唾液酸转移酶)和唾液酸底物(例如，包含胞苷单磷酸(cmp)-n-乙酰基-神经氨酸(cmp-nana)的底物)接触。接触可在蛋白质纯化的一个或多个步骤期间发生，之后可通过随后的纯化步骤或通过将结合分子的群体与酶所附接的固体支持物分离来去除可溶性唾液酸转移酶。
[0161]
在某些实施方案中，用于产生gem的唾液酸转移酶变体可以是人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1)(seq id no：3)的可溶性变体。例如，唾液酸转移酶可以是st6gal1的变体，其不包括seq id no：3的跨膜区(例如，不包括seq id no：3的氨基酸10至26)，或不包括seq id no：3的胞质区和跨膜区两者(例如，不包括seq id no：3的氨基酸1至9和seq id no：3的氨基酸10至26)，但维持蛋白质的催化活性。在某些实施方案中，st6gal1的可溶性变体包含seq id no：3的氨基酸x至406，其中x是27至120的整数。例如，st6gal1的可溶性变体可以包含seq id no：3的氨基酸120至406、115至406、110至406、109至406、105至406、100至406、95至406、90至406、89至406、88至406、87至406、86至406、85至406、84至406、83至406、82至406、81至406、80至406、75至406、70至406、65至406、60至406、55至406、50至406、45至406、40至406、35至406、30至406或27至406。在某些实施方案中，唾液酸底物包括胞苷单磷酸(cmp)-n-乙酰基-神经氨酸(＝cmp-β-d-neu5ac；＝cmp-neu5ac；＝cmp-nana；＝cmp-唾液酸；＝cmp-sa，图2b)。功能衍生物包括但不限于用于通过“点击”化学进行聚糖标记的叠氮基-cmp-唾液酸。
[0162]
发明人已经观察到，尽管有大量聚糖(五聚体为51个，六聚体为60个)，但相对于igg抗体的糖工程化所需的较高量，可以用低浓度的st6gal1可溶性变体对igm抗体进行有效和高水平的唾液酸化。例如，igm抗体的有效唾液酸化已经进行，igm抗体与可溶性唾液酸转移酶的质量比约为5000∶1或者2000∶1，唾液酸底物的igm抗体与可溶性唾液酸转移酶的比例约为5000∶2500∶1或者2000∶500∶1(提供过量的唾液酸底物)。这计算出igm抗体与唾液酸转移酶的摩尔比为约200∶1或80∶1或者igm抗体与唾液酸底物与唾液酸转移酶的摩尔比为约200∶2500∶1或80∶500∶1。在某些实施方案中，igm抗体与唾液酸转移酶的摩尔比为至少约50∶1、55∶1、60∶1、65∶1、70∶1、75∶1、80∶1、85∶1、90∶1、95∶1、100∶1、105∶1、110∶1、115∶1、
120∶1、125∶1、130∶1、135∶1、140∶1、145∶1、150∶1、175∶1、或200∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比可以是约80∶1至约5000∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比可以是约80∶1至约100∶1、约80∶1至约250∶1、约80∶1至约500∶1、约80∶1至约750∶1、约80∶1至约1000∶1、约80∶1至约1250∶1、约80∶1至约1500∶1、约80∶1至约1750∶1、约80∶1至约2000∶1、约80∶1至约2500∶1、约80∶1至约3000∶1、约80∶1至约3500∶1、约80∶1至约4000∶1、约80∶1至约4500∶1、约250∶1至约500∶1、约250∶1至约750∶1、约250∶1至约1000∶1、约250∶1至约1250∶1、约250∶1至约1500∶1、约250∶1至约1750∶1、约250∶1至约2000∶1、约250∶1至约2500∶1、约250∶1至约3000∶1、约250∶1至约3500∶1、约250∶1至约4000∶1、约250∶1至约4500∶1、约250∶1至约5000∶1、约500∶1至约750∶1、约500∶1至约1000∶1、约500∶1至约1250∶1、约500∶1至约1500∶1、约500∶1至约1750∶1、约500∶1至约2000∶1、约500∶1至约2500∶1、约500∶1至约3000∶1、约500∶1至约3500∶1、约500∶1至约4000∶1、约500∶1至约4500∶1、约500∶1至约5000∶1、约1000∶1至约1250∶1、约1000∶1至约1500∶1、约1000∶1至约1750∶1、约1000∶1至约2000∶1、约1000∶1至约2500∶1、约1000∶1至约3000∶1、约1000∶1至约3500∶1、约1000∶1至约4000∶1、约1000∶1至约4500∶1、约1000∶1至约5000∶1、约1500∶1至约1750∶1、约1500∶1至约2000∶1、约1500∶1至约2500∶1、约1500∶1至约3000∶1、约1500∶1至约3500∶1、约1500∶1至约4000∶1、约1500∶1至约4500∶1、约1500∶1至约5000∶1、约2000∶1至约2500∶1、约2000∶1至约3000∶1、约2000∶1至约3500∶1、约2000∶1至约4000∶1、约2000∶1至约4500∶1、约2000∶1至约5000∶1、约2500∶1至约3000∶1、约2500∶1至约3500∶1、约2500∶1至约4000∶1、约2500∶1至约4500∶1、约2500∶1至约5000∶1、约3000∶1至约3500∶1、约3000∶1至约4000∶1、约3000∶1至约4500∶1、约3000∶1至约5000∶1、约3500∶1至约4000∶1、约3500∶1至约4500∶1、约3500∶1至约5000∶1、约4000∶1至约4500∶1、或约4000∶1至约5000∶1。这与igg抗体的体外唾液酸化所需的大得多的量的酶形成对比，推荐的igg抗体与唾液酸转移酶的摩尔比为3∶1。参见，例如，malik，s.，和thomann，m.，(2016)in vitro glycoengineering-suitability for biopharma manufacturing，application note，可在custombiotech.roche.com获得。
[0163]
发明人还已经观察到，尽管有大量聚糖(五聚体为51个，六聚体为60个)，但相对于igg抗体的糖工程化所需的较高量，可以用低浓度的唾液酸底物对igm抗体进行有效和高水平的唾液酸化。在一些实施方案中，唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比可以是约1∶4至约3000∶1，诸如约1∶4至约1∶1、约1∶4至约5∶1、约1∶4至约50∶1、约1∶4至约100∶1、约1∶4至约500∶1、约1∶4至约1000∶1、约1∶4至约1500∶1、约1∶4至约2000∶1、约1∶4至约2500∶1、约1∶1至约5∶1、约1∶1至约10∶1、约1∶1至约50∶1、约1∶1至约100∶1、约1∶1至约500∶1、约1∶1至约1000∶1、约1∶1至约1500∶1、约1∶1至约2000∶1、约1∶1至约2500∶1、约1∶1至约3000∶1、约2∶1至约5∶1、约2∶1至约10∶1、约2∶1至约50∶1、约2∶1至约100∶1、约2∶1至约500∶1、约2∶1至约1000∶1、约2∶1至约1500∶1、约2∶1至约2000∶1、约2∶1至约2500∶1、约2∶1至约3000∶1、约5∶1至约10∶1、约5∶1至约50∶1、约5∶1至约100∶1、约5∶1至约500∶1、约5∶1至约1000∶1、约5∶1至约1500∶1、约5∶1至约2000∶1、约5∶1至约2500∶1、约5∶1至约3000∶1、约10∶1至约50∶1、约10∶1至约100∶1、约10∶1至约500∶1、约10∶1至约1000∶1、约10∶1至约1500∶1、约10∶1至约2000∶1、约10∶1至约2500∶1、约10∶1至约3000∶1、约50∶1至约100∶1、约50∶1至约500∶1、约50∶1至约1000∶1、约50∶1至约1500∶1、约50∶1至约2000∶1、约50∶1至约2500∶1、约50∶1至约3000∶1、约100∶1至约500∶1、约100∶1至约1000∶1、约100∶1至约1500∶1、约100∶1至约2000∶1、约100∶1至约
2500∶1、约100∶1至约3000∶1、约500∶1至约1000∶1、约500∶1至约1500∶1、约500∶1至约2000∶1、约500∶1至约2500∶1、约500∶1至约3000∶1、约1000∶1至约1500∶1、约1000∶1至约2000∶1、约1000∶1至约2500∶1、约1000∶1至约3000∶1、约1500∶1至约2000∶1、约1500∶1至约2500∶1、约1500∶1至约3000∶1、约2000∶1至约2500∶1、约2000∶1至约3000∶1或约2500∶1至约3000∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比可以是约80∶1、约100∶1、约250∶1、约500∶1、约750∶1、约1000∶1、约1250∶1、约1500∶1、约1750∶1、约2000∶1、约2500∶1、约3000∶1、约3500∶1、约4000∶1、约4500∶1，或约5000∶1；和/或唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比是约5∶1、约10∶1、约50∶1、约100∶1、约500∶1、约1000∶1、约1500∶1、约2000∶1、约2500∶1或约3000∶1。
[0164]
在一些实施方案中，抗体∶唾液酸底物的质量比可以是约1∶1至约40∶1，诸如约1∶1至约2∶1、约1∶1至约4∶1、约1∶1至约6∶1、约1∶1至约8∶1、约1∶1至约10∶1、约1∶1至约15∶1、约1∶1至约20∶1、约2∶1至约4∶1、约2∶1至约6∶1、约2∶1至约8∶1、约2∶1至约10∶1、约2∶1至约15∶1、约2∶1至约20∶1、约2∶1至约40∶1、约4∶1至约6∶1、约4∶1至约8∶1、约4∶1至约10∶1、约4∶1至约15∶1、约4∶1至约20∶1、约4∶1至约40∶1、约6∶1至约8∶1、约6∶1至约10∶1、约6∶1至约15∶1、约6∶1至约20∶1、约6∶1至约40∶1、约8∶1至约10∶1、约8∶1至约15∶1、约8∶1至约20∶1、约8∶1至约40∶1、约10∶1至约15∶1、约10∶1至约20∶1、约10∶1至约40∶1、约15∶1至约20∶1、约15∶1至约40∶1或约20∶1至约40∶1。
[0165]
本发明人还观察到，与用于igg抗体糖工程化的情况相比，igm抗体的有效且高水平的唾液酸化可以在更大的温度范围和更长的时间段内进行。在一些实施方案中，体外糖工程化包括使结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触至少30分钟，诸如至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时或至少48小时。在一些实施方案中，接触发生持续约30分钟至约48小时，诸如约30分钟至约4小时、约30分钟至约5小时、约30分钟至约6小时、约30分钟至约7小时、约30分钟至约10小时、约30分钟至约12小时、约30分钟至约18小时、约30分钟至约24小时、约30分钟至约36小时、约2小时至约48小时、约3小时至约6小时、约3小时至约10小时、约3小时至约12小时、约3小时至约18小时、约3小时至约24小时、约3小时至约36小时、约3小时至约48小时、约4小时至约10小时、约4小时至约12小时、约4小时至约18小时、约4小时至约24小时、约4小时至约36小时、约4小时至约48小时、约5小时至约10小时、约5小时至约12小时、约5小时至约18小时、约5小时至约24小时、约5小时至约36小时、约5小时至约48小时、约7小时至约10小时、约7小时至约12小时、约7小时至约18小时、约7小时至约24小时、约7小时至约36小时、约7小时至约48小时、约10小时至约18小时、约10小时至约24小时、约10小时至约36小时、约10小时至约48小时、约12小时至约18小时、约12小时至约24小时、约12小时至约36小时、约12小时至约48小时、约18小时至约24小时、约18小时至约36小时、约18小时至约48小时、约24小时至约36小时、约24小时至约48小时或约36小时至约48小时，
[0166]
在一些实施方案中，体外糖工程化包括使结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物在以下温度下接触：约2℃至约40℃，诸如约2℃至约37
°
、2℃至约30℃、2℃至约25℃、2℃至约22℃、2℃至约20℃、2℃至约10℃、约4℃至约40℃、约4℃至约37℃、4℃至约30℃、4℃至约25℃、4℃至约22℃、4℃至约20℃、4℃至约10℃、约10℃至约40
℃、约10℃至约37℃、10℃至约30℃、10℃至约25℃、10℃至约22℃、10℃至约20℃、约20℃至约40℃、约20℃至约37℃、20℃至约30℃、20℃至约25℃、20℃至约22℃、约22℃至约40℃、约22℃至约37℃、22℃至约30℃、22℃至约25℃、约25℃至约40℃、约25℃至约37℃、25℃至约30℃、约30℃至约40℃或约30℃至约37℃。在一些实施方案中，体外糖工程化包括使结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物在约15℃至约25℃的温度下接触。
[0167]
在某些实施方案中，可通过确保在所提供的igm、igm样或igm衍生的结合分子的单克隆群体的复合聚糖上存在足够数量的半乳糖受体残基来增强体外唾液酸化。st6gal1通过α-2，6键联将唾液酸单糖从cmp-nana转移至分子聚糖上的半乳糖受体残基。为了确保存在于结合分子的单克隆群体中的聚糖上的足够数量的受体半乳糖残基，gem的产生还可以包括在与唾液酸转移酶和唾液酸底物接触之前或同时使结合分子的单克隆群体与以下物质接触：半乳糖基转移酶，例如β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)(seq id no：4)的可溶性变体、以及半乳糖底物，例如尿苷-二磷酸-α-d-半乳糖(udp-gal)。例如，唾液酸转移酶可以是b4galt4的变体，其不包含seq id no：4的跨膜区(例如，不包含seq id no：4的氨基酸13至38)、或不包含seq id no：4的胞质区和跨膜区两者(例如，不包含seq id no：4的氨基酸1至12和seq id no：4的氨基酸13至38)，但维持蛋白质的催化活性。在某些实施方案中，b4galt4的可溶性变体包含seq id no：4的氨基酸x至344，其中x是39至120的整数。例如，b4galt4的可溶性变体包含seq id no：4的氨基酸120至344、115至344、110至344、105至344、100至344、95至344、90至344、85至344、80至344、75至344、70至344、65至344、60至344、55至344、50至344、45至344、40至344或39至344。在某些实施方案中，半乳糖底物包含udp-gal。
[0168]
所提供的结合分子的单克隆群体中的igm重链恒定区各自与结合结构域或其亚基缔合，例如抗体抗原结合结构域，例如scfv、vhh或抗体抗原结合结构域的vh亚基，其中结合结构域特异性结合感兴趣的靶标。在某些实施方案中，靶标是靶表位、靶抗原、靶细胞、靶器官或靶病毒。靶标可以包括但不限于肿瘤抗原、其他肿瘤学靶标、免疫肿瘤学靶标(诸如免疫检查点抑制剂)、传染病靶标(诸如在感染的细胞表面上表达的病毒抗原)、参与血脑屏障转运的靶抗原、参与神经退行性疾病和神经炎性疾病的靶抗原、及其任何组合。示例性靶标和与此类靶标结合的结合结构域在本文别处提供，并且可以见于以下中：例如美国专利申请公开号us 2019-0330360、us 2019-0338040、us 2019-0338041、us 2019-0330374、us 2019-0185570、us 2019-0338031或us 2020-0239572；pct公开号wo 2018/017888、wo 2018/017889、wo 2018/017761、wo 2018/017763或wo 2018/187702和wo 2019/165340；或美国专利号9,951,134、9,938,347、8,377,435、9,458,241、9,409,976、10,400,038、10,351,631、10,570,191、10,604,559、10,618,978、10,689,449或10,787,520。这些申请和/或专利各自通过引用以其整体并入本文。
[0169]
在某些实施方案中，所提供的多聚体结合分子的群体是多特异性的，例如双特异性、三特异性或四特异性，其中与每个结合分子的igm重链恒定区缔合的两个或更多个结合结构域特异性结合不同的靶标。在某些实施方案中，所提供的多聚体结合分子的群体的结合结构域全部特异性结合相同的靶标。在某些实施方案中，所提供的多聚体结合分子的群体的结合结构域是相同的。在这种情况下，如果例如具有不同特异性的结合结构域是如本
文别处所述的修饰的j链的一部分，则多聚体结合分子的群体仍然可以是双特异性的。在某些实施方案中，结合结构域是抗体衍生的抗原结合结构域，例如与igm重链恒定区缔合的scfv或与igm重链恒定区缔合的抗体结合结构域的vh亚基。
[0170]
在某些实施方案中，每个结合分子是分别包含五个或六个二价igm结合单元的五聚体或六聚体igm抗体，其中每个结合单元包含两条igm重链(各自包含位于变体igm恒定区的氨基端的vh)以及两条免疫球蛋白轻链(各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的轻链可变结构域(vl))，并且其中vh和vl组合形成特异性地结合靶标的抗原结合结构域。在某些实施方案中，每个结合分子的每个抗原结合结构域结合相同的靶标。在某些实施方案中，每个结合分子的每个抗原结合结构域是相同的。
[0171]
在某些实施方案中，靶标是肿瘤特异性抗原，即仅在肿瘤或癌细胞上大量表达的靶抗原、或仅在成人的正常健康细胞中以不可检测的水平表达的靶抗原。在某些实施方案中，靶标是肿瘤相关抗原，即在健康细胞和癌性细胞上均表达但在癌性细胞上以比在正常健康细胞上高得多的密度表达的靶抗原。示例性的肿瘤特异性或肿瘤相关抗原包括但不限于b细胞成熟抗原(bcma)、cd19、cd20、表皮生长因子受体(egfr)、人表皮生长因子受体2(her2，也称为erbb2)、her3(erbb3)、受体酪氨酸蛋白激酶erbb4、细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla4)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、程序性死亡配体1(pd-l1)、血管内皮生长因子(vegf)、vegf受体-1(vegfr1)、vegfr2、cd52、cd30、前列腺特异性膜抗原(psma)、cd38、神经节苷脂gd2、信号淋巴细胞活化分子家族成员7(slamf7)的自配体受体、血小板衍生生长因子受体a(pdgfra)、cd22、flt3(cd135)、cd123、muc-16、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(ceacam-1)、间皮素、肿瘤相关钙信号转导物2(trop-2)、磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc-3)、人血型h型1型三糖(globo-h)、唾液酸tn抗原(stn抗原)和cd33。技术人员将理解这些靶抗原在文献中以许多不同的名称出现，但是这些治疗性靶标可以使用在线可用的数据库(例如，expasydot_org)容易地鉴定。
[0172]
其他肿瘤相关或肿瘤特异性抗原包括但不限于：dll4、notch1、notch2、notch3、notch4、jag1、jag2、c-met、igf-1r、缝合、刺猬家族多肽、wnt家族多肽、fzd1、fzd2、fzd3、fzd4、fzd5、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9、fzd10、lrp5、lrp6、il-6、tnfα、il-23、il-17、cd80、cd86、cd3、cea、muc16、psca、cd44、c-kit、ddr1、ddr2、rspo1、rspo2、rspo3、rspo4、bmp家族多肽、bmpr1a、bmpr1b或tnf受体超家族蛋白诸如tnfr1(dr1)、tnfr2、tnfr1/2、cd40(p50)、fas(cd95、apo1、dr2)、cd30、4-1bb(cd137、ila)、trailr1(dr4、apo2)、dr5(trailr2)、trailr3(dcr1)、trailr4(dcr2)、opg(ocif)、tweakr(fn14)、lightr(hvem)、dcr3、dr3、edar和xedar。
[0173]
在某些实施方案中，多聚体结合分子的单克隆群体包含五聚体或六聚体igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子的群体，它们各自分别包含五个或六个二价igm结合单元。根据某些实施方案，每个结合单元包含如本文所述的两条igm重链(每条具有位于变体igm恒定区的氨基端的vh)和两条免疫球蛋白轻链(每条具有位于免疫球蛋白轻链恒定区例如卡帕或兰姆达恒定区的氨基端的轻链可变结构域(vl))。所提供的vh和vl结合形成特异性结合感兴趣的靶标的抗原结合结构域。在某些实施方案中，五个或六个igm结合单元是相同的。
[0174]
在其中多聚体igm抗体、igm样抗体或igm衍生的结合分子的群体是五聚体的那些
实施方案中，每个抗体或结合分子还可以包含j链、或其功能片段、或其功能变体，如本文别处描述。例如，j链可以是成熟人j链，其包含氨基酸序列seq id no：6、或其功能片段、或其功能变体。如本领域普通技术人员将认识到的，本文中的“功能片段”或“功能变体”包括可以与igm结合单元例如igm重链恒定区缔合以形成五聚体igm抗体、igm样抗体或igm衍生的结合分子的片段和变体。
[0175]
在某些实施方案中，如本文提供的五聚体igm衍生的结合分子例如igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子的j链是功能变体j链，其包含一个或多个相对于参考j链的单个氨基酸取代、缺失或插入，所述参考j链除了一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入与变体j链相同。例如，某些氨基酸取代、缺失或插入可导致igm衍生的结合分子在施用于受试者动物时后显示出相对于参考igm衍生的结合分子增加的血清半衰期，所述参考igm衍生的结合分子除了变体j链中的一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外是相同的且使用相同的方法施用于相同的动物物种。在某些实施方案中，变体j链相对于参考j链可包含一个、两个、三个或四个单一氨基酸取代、缺失或插入。
[0176]
如本文别处详细描述的，在某些实施方案中，如本文提供的五聚体igm衍生的结合分子例如igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子的变体j链或其功能片段在对应于野生型成熟人j链(seq id no：6)的氨基酸y102的氨基酸位置处包含氨基酸取代。y102可以被任何氨基酸例如丙氨酸取代。在某些实施方案中，变体人j链可以包含氨基酸序列seq id no：7。具有seq id no：7的氨基酸序列的j链在一些情况下可以称为“j*”。
[0177]
具有变体或野生型氨基酸序列的如本文提供的五聚体igm衍生的结合分子例如igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子的j链或片段可以是“修饰的j链”，其还包含异源部分，其中所述异源部分与j链或其片段或变体融合或缀合。示例性但非限制性的异源部分在例如美国专利号9,951,134和10,618,978以及美国专利申请公开号2019/0185570中提供，所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，异源部分是与j链或其片段或变体融合或在其之内的多肽。异源多肽可以在一些情况下通过肽接头与j链或其片段或变体融合或在其之中。可以使用任何合适的接头，例如肽接头可以包含至少5个氨基酸、至少十个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸或更多等。在某些实施方案中，肽接头包含不超过25个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头可由5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸或25个氨基酸组成。在某些实施方案中，肽接头包含甘氨酸和丝氨酸，例如(ggggs)n(seq id no：48)，其中n可以是1、2、3、4、5或更多。在某些实施方案中，肽接头由ggggs(seq id no：41)、ggggsggggs(seq id no：42)、ggggsggggsggggs(seq id no：43)、ggggsggggsggggsggggs(seq id no：44)或ggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no：45)组成。在某些实施方案中，异源多肽可以与j链或其片段或变体的n端融合、与j链或其片段或变体的c端融合、或与j链或其片段或变体的n端和c端两者融合。在某些实施方案中，异源多肽可以内部融合在j链内。在某些实施方案中，异源多肽可以是结合结构域，例如抗原结合结构域。例如，异源多肽可以是抗体、抗体的亚基或抗体的抗原结合片段，例如scfv片段。在某些实施方案中，结合结构域例如scfv片段可以与效应细胞例如t细胞或nk细胞结合。在某些实施方案中，结合结构域例如scfv片段可以与细胞毒性t细胞上的cd3特异性结合，例如与cd3ε特异性结合。在某些具体实施方案中，如本文提供的五聚体igm衍生的结合分子的修饰的j链包含氨基酸序列seq id no：36(v15j)或seq id no：37(v15j*)、或包含抗cd3εscfv
抗原结合结构域的j链(所述抗原结合结构域包含鼠抗体sp34(vh＝seq id no：14、vl＝seq id no：18)的六个互补决定区：vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3(分别地，氨基酸序列seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：20和seq id no：21))，例如，包含氨基酸序列seq id no：39的修饰的j链sj*。其他人源化sp35抗体包含a-55(分别地，seq id no 22、23和24，wo2018208864)、a-56(分别地，seq id no 25、26和27，wo2018208864)或a-57(分别地，seq id no 28、29和30，wo2018208864)的vh和vl或scfv序列，其并入修饰的j链a-55-j*(seq id no：31)、a-56-j*(seq id no：32)和a-57-j*(seq id no：33)。在某些实施方案中，如本文提供的修饰的j链还可以包含附接例如在j链的与抗cd3εscfv结合结构域相反的末端上的另外的异源部分。例如，修饰的j链还可以包含人血清白蛋白。实例包括但不限于vjh(seq id no：34)和vj*h(seq id no：35)。
[0178]
具有延长血清半衰期的igm衍生的结合分子
[0179]
如本文提供的高度唾液酸化的igm抗体、igm样抗体或igm衍生的结合分子的单克隆群体还可以经工程化以具有延长的血清半衰期。可延长igm衍生的结合分子的血清半衰期的示例性igm重链恒定区突变在美国专利申请公开号us 2020-0239572中公开，其通过引用以其整体并入本文。例如，如本文提供的高度唾液酸化的igm抗体、igm样抗体或igm衍生的结合分子的群体的变体igm重链恒定区可以包含在对应于野生型人igm恒定区(例如，seq id no：1或seq id no：2)的氨基酸s401、e402、e403、r344和/或e345的氨基酸位置处的氨基酸取代。“对应于野生型人igm恒定区的氨基酸s401、e402、e403、r344和/或e345的氨基酸”意指与人igm恒定区中s401、e402、e403、r344和/或e345同源的任何物种的igm恒定区序列中的氨基酸。在某些实施方案中，对应于seq id no：1或seq id no：2的s401、e402、e403、r344和/或e345的氨基酸可以被任何氨基酸例如丙氨酸取代。
[0180]
野生型j链通常包含一个n连接的糖基化位点。某些实施方案中，如本文提供的五聚体igm衍生的结合分子的变体j链或其功能片段包含例如从对应于成熟人j链(seq id no：6)或j*(seq id no：7)的氨基酸49(基序n6)的氨基酸位置开始的天冬酰胺(n)连接的糖基化基序n-x
1-s/t内的突变，其中n是天冬酰胺，x1是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且s/t是丝氨酸或苏氨酸，并且其中所述突变阻止了在该基序处的糖基化。如美国专利申请公开号us 2020-0239572中所证明的，在该位点阻止糖基化的突变可导致如本文提供的igm衍生的结合分子例如igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子的群体在施用于受试者动物后相对于参考igm衍生的结合分子表现出增加的血清半衰期，所述参考igm衍生的结合分子除了在变体j链中阻止糖基化的一个或多个突变之外是相同的并且以相同方式施用于相同的动物物种。
[0181]
例如，在某些实施方案中，如本文提供的五聚体igm衍生的结合分子的变体j链或其功能片段可包含在对应于seq id no：6或seq id no：7的氨基酸n49或氨基酸s51的氨基酸位置处的氨基酸取代，条件是对应于s51的氨基酸未被苏氨酸(t)取代，或其中变体j链在对应于seq id no：6或seq id no：7的氨基酸n49和s51两者的氨基酸位置处包含氨基酸取代。在某些实施方案中，对应于seq id no：6或seq id no：7的n49的位置被任何氨基酸例如丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、苏氨酸(t)、丝氨酸(s)或天冬氨酸(d)取代。在一个具体实施方案中，对应于seq id no：6或seq id no：7的n49的位置可被丙氨酸(a)取代。在另一个具体实施方案中，对应于seq id no：6或seq id no：7的n49的位置可被天冬氨酸(d)取代。
[0182]
具有降低的cdc活性的变体人igm恒定区
[0183]
如本文提供的igm衍生的结合分子例如igm抗体、igm样抗体或其他igm衍生的结合分子的单克隆群体可以经工程化以在补体存在下相对于具有对应的除了赋予降低的cdc活性的突变相同的参考人igm恒定区的参考igm抗体或igm样抗体的群体对细胞表现出降低的补体依赖性细胞毒性(cdc)活性。这些cdc突变可以与如本文提供的赋予增加的血清半衰期的任何突变组合。“对应的参考人igm恒定区”意指人igm恒定区或其一部分，例如cμ3结构域，其除了影响cdc活性的恒定区中的一个或多个修饰外与变体igm恒定区相同。在某些实施方案中，相对于如描述于例如pct申请号wo/2018/187702中的野生型人igm恒定区，变体人igm恒定区包含例如cμ3结构域中的一个或多个氨基酸取代，所述申请通过引用以其整体并入本文。用于测量cdc的测定是本领域普通技术人员众所周知的，并且示例性测定描述于例如pct申请号wo/2018/187702中。
[0184]
在某些实施方案中，赋予降低的cdc活性的变体人igm恒定区包含对应于在seq id no：1或seq id no：2的p311位置处的野生型人igm恒定区的氨基酸取代。在其他实施方案中，如本文提供的变体igm恒定区含有对应于在seq id no：1或seq id no：2的p313位置处的野生型人igm恒定区的氨基酸取代。在其他实施方案中，如本文提供的变体igm恒定区含有对应于在seq id no：1或seq id no：2的p311以及seq id no：1或seq id no：2的p313位置处的野生型人igm恒定区的取代的组合。这些脯氨酸残基可以独立地被任何氨基酸取代，例如，被丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸取代。在某些实施方案中，赋予降低的cdc活性的变体人igm恒定区包含对应于在seq id no：22或seq id no：23的k315位置处的野生型人igm恒定区的氨基酸取代。赖氨酸残基可以独立地被任何氨基酸取代，例如，被丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸取代。在某些实施方案中，赋予降低的cdc活性的变体人igm恒定区包含用天冬氨酸进行的对应于在seq id no：22或seq id no：23的k315位置处的野生型人igm恒定区的氨基酸取代。
[0185]
宿主细胞
[0186]
在某些实施方案中，本公开提供了能够产生如本文提供的高度唾液酸化的结合分子的单克隆群体的宿主细胞。在某些方面中，这样的宿主细胞过表达st6gal1和/或b4galt4。本公开还提供了产生如本文提供的结合分子的单克隆群体的方法，其中所述方法包括培养所提供的宿主细胞并且恢复结合分子的群体。
[0187]
用于产生高度唾液酸化的igm抗体、igm样抗体或igm衍生的结合分子的群体的方法
[0188]
本公开还提供了一种用于产生如本公开中详细描述的高度唾液酸化的多聚体结合分子的单克隆群体的方法，其中所述方法包括：提供表达结合分子的单克隆群体的细胞系、培养所述细胞系以及恢复结合分子的单克隆群体。在某些实施方案中，每个结合分子包含十个或十二个igm衍生的重链，其中igm衍生的重链包含糖基化的igm重链恒定区或其多聚化片段，其各自与特异性结合靶标的结合结构域缔合，其中每个igm重链恒定区包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个天冬酰胺(n)连接的糖基化基序，其中n连接的糖基化基序包含氨基酸序列n-x
1-s/t，其中n是天冬酰胺，x1是除脯氨酸以外的任何氨基酸，并且s/t是丝氨酸或苏氨酸。如本文所提供的，群体中每个igm重链恒定区上的n连接的糖基化基序中的平均至少一个、至少两个或至少三个被复合聚糖占据，并且其中优化细
胞系、培养条件、恢复过程或其组合以富集包含每个聚糖至少一个、两个、至少三个或四个唾液酸末端单糖的复合聚糖。
[0189]
在某些实施方案中，细胞系、培养条件、恢复过程或其组合可根据所提供的方法经优化以产生结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少124、至少130、至少140或至少146摩尔唾液酸。在某些实施方案中，细胞系、恢复过程或其组合根据所提供的方法经优化以产生结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子至少35、至少40、至少45、至少50或至少60摩尔唾液酸。在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子约35至约40、约35至约45、约35至约50、约35至约55、约35至约60、约35至约65、约35至约70、约40至约45、约40至约50、约40至约55、约40至约60、约40至约65、约40至约70、约45至约50、约45至约55、约45至约60、约45至约65、约45至约70、约50至约55、约50至约60、约50至约65、约50至约70、约55至约60、约55至约65、约55至约70、约60至约65、约60至约70或约65至约70摩尔唾液酸。在一些实施方案中，结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子约40至约55摩尔唾液酸。根据所提供的方法，igm重链恒定区可以衍生自人igm重链恒定区，其包含从对应于seq id no：1(等位基因ighm*03)或seq id no：2(等位基因ighm*04)的氨基酸46(基序n1)、氨基酸209(基序n2)、氨基酸272(基序n3)、氨基酸279(基序n4)和氨基酸440(基序n5)的氨基酸位置处开始的五个n连接的糖基化基序n-x
1-s/t。在某些实施方案中，结合分子的群体中的基序n1、n2和n3中平均一个、两个或所有三个被可通过所提供的方法唾液酸化的复合聚糖占据。
[0190]
在某些实施方案中，根据所提供的方法培养的细胞系经修饰以过表达唾液酸转移酶。在某些实施方案中，过表达的唾液酸转移酶是2，6-唾液酸转移酶。在某些实施方案中，过表达的唾液酸转移酶是人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1)。在某些实施方案中，过表达的唾液酸转移酶是2，3-唾液酸转移酶。根据所提供的方法培养的细胞系还可以经修饰以过表达半乳糖基转移酶。在某些实施方案中，过表达的半乳糖基转移酶是人β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)。根据所提供的方法培养的细胞系还可以经修饰以过表达udp-glcnac 2-差向异构酶/mannac激酶(gne)(诸如包含r263或r266突变的gne，所述突变诸如q、w或l突变)；α-甘露糖苷酶ii；n-乙酰氨基葡萄糖转移酶-ii(gnt-ii)；n-乙酰氨基葡萄糖转移酶-iv(gnt-iv)；n-乙酰氨基葡萄糖转移酶-v(gnt-v)；cmp-唾液酸合酶(cmp-sas)；cmp-唾液酸转运蛋白(cmp-sat)；或其任何组合。在某些实施方案中，根据所提供的方法培养的细胞系还可以经修饰以阻断某些唾液酸酶的表达。在某些实施方案中，根据所提供的方法培养的细胞系可经修饰以阻断神经氨酸酶的表达。
[0191]
在所提供方法的某些实施方案中，恢复过程包括在下游加工期间使多聚体结合分子的单克隆群体经受糖工程化，以产生例如糖工程化的igm抗体、igm样抗体或igm衍生的结合分子(或“gem”)的单克隆群体。在某些实施方案中，gem是高度唾液酸化的，例如具有每摩尔结合分子至少35摩尔唾液酸。gem的产生在本文别处详细描述，并且gem的产生的任何和所有方面都可以包括在所提供的方法中。在某些实施方案中，gem的产生包括使结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触。在某些实施方案中，可溶性唾液酸转移酶可以是人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1)(seq id no∶3)的可溶性变体。在某些实施方案中，st6gal1的可溶性变体包含seq id no∶3的氨基酸x至406，其中x是
27至120的整数。例如，st6gal1的可溶性变体可以包含seq id no∶3的氨基酸120至406、115至406、110至406、109至406、105至406、100至406、95至406、90至406、89至406、88至406、87至406、86至406、85至406、84至406、83至406、82至406、81至406、80至406、75至406、70至406、65至406、60至406、55至406、50至406、45至406、40至406、35至406、30至406或27至406。在某些实施方案中，唾液酸底物可以包含胞苷单磷酸(cmp)-n-乙酰基-神经氨酸(cmp-nana)或其衍生物。
[0192]
如本文别处所述，本发明人已发现，与用于唾液酸化igg的可比方法相比，高度唾液酸化的igm抗体、igm样抗体或igm衍生的结合分子的产生需要少得多的酶。例如，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比可以是约80∶1至约5000∶1。在一些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的质量比可以是约80∶1至约100∶1、约80∶1至约250∶1、约80∶1至约500∶1、约80∶1至约750∶1、约80∶1至约1000∶1、约80∶1至约1250∶1、约80∶1至约1500∶1、约80∶1至约1750∶1、约80∶1至约2000∶1、约80∶1至约2500∶1、约80∶1至约3000∶1、约80∶1至约3500∶1、约80∶1至约4000∶1、约80∶1至约4500∶1、约80∶1至约5000∶1、约250∶1至约500∶1、约250∶1至约750∶1、约250∶1至约1000∶1、约250∶1至约1250∶1、约250∶1至约1500∶1、约250∶1至约1750∶1、约250∶1至约2000∶1、约250∶1至约2500∶1、约250∶1至约3000∶1、约250∶1至约3500∶1、约250∶1至约4000∶1、约250∶1至约4500∶1、约250∶1至约5000∶1、约500∶1至约750∶1、约500∶1至约1000∶1、约500∶1至约1250∶1、约500∶1至约1500∶1、约500∶1至约1750∶1、约500∶1至约2000∶1、约500∶1至约2500∶1、约500∶1至约3000∶1、约500∶1至约3500∶1、约500∶1至约4000∶1、约500∶1至约4500∶1、约500∶1至约5000∶1、约1000∶1至约1250∶1、约1000∶1至约1500∶1、约1000∶1至约1750∶1、约1000∶1至约2000∶1、约1000∶1至约2500∶1、约1000∶1至约3000∶1、约1000∶1至约3500∶1、约1000∶1至约4000∶1、约1000∶1至约4500∶1、约1000∶1至约5000∶1、约1500∶1至约1750∶1、约1500∶1至约2000∶1、约1500∶1至约2500∶1、约1500∶1至约3000∶1、约1500∶1至约3500∶1、约1500∶1至约4000∶1、约1500∶1至约4500∶1、约1500∶1至约5000∶1、约2000∶1至约2500∶1、约2000∶1至约3000∶1、约2000∶1至约3500∶1、约2000∶1至约4000∶1、约2000∶1至约4500∶1、约2000∶1至约5000∶1、约2500∶1至约3000∶1、约2500∶1至约3500∶1、约2500∶1至约4000∶1、约2500∶1至约4500∶1、约2500∶1至约5000∶1、约3000∶1至约3500∶1、约3000∶1至约4000∶1、约3000∶1至约4500∶1、约3000∶1至约5000∶1、约3500∶1至约4000∶1、约3500∶1至约4500∶1、约3500∶1至约5000∶1、约4000∶1至约4500∶1、或约4000∶1至约5000∶1。在某些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的摩尔比可以是约200∶1、175∶1、150∶1、155∶1、140∶1、135∶1、130∶1、125∶1、120∶1、115∶1、110∶1、105∶1、100∶1、95∶1、90∶1、85∶1、80∶1、75∶1、70∶1、65∶1、60∶1、55∶1或50∶1。例如，结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比可以是约2000∶500∶1。在某些实施方案中，结合分子∶唾液酸转移酶的摩尔比可以是约200∶1、175∶1、150∶1、155∶1、140∶1、135∶1、130∶1、125∶1、120∶1、115∶1、110∶1、105∶1、100∶1、95∶1、90∶1、85∶1、80∶1、75∶1、70∶1、65∶1、60∶1、55∶1或50∶1。在某些实施方案中，结合分子与唾液酸转移酶的摩尔比可以是约80∶1。如本文别处所述，gem的产生还可以包括使结合分子的单克隆群体与半乳糖基转移酶(例如人β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)(seq id no：4)的可溶性变体)和半乳糖底物(例如尿苷-二磷酸-α-d-半乳糖(udp-gal))接触。与半乳糖基转移酶和半乳糖底物的接触可以发生在与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触之前或与其同时发生。
[0193]
在一些实施方案中，唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比可以是约5∶1至约3000∶1，诸如约5∶1至约10∶1、约5∶1至约50∶1、约5∶1至约100∶1、约5∶1至约500∶1、约5∶1至约1000∶1、约5∶1至约1500∶1、约5∶1至约2000∶1、约5∶1至约2500∶1、约10∶1至约50∶1、约10∶1至约100∶1、约10∶1至约500∶1、约10∶1至约1000∶1、约10∶1至约1500∶1、约10∶1至约2000∶1、约10∶1至约2500∶1、约10∶1至约3000∶1、约50∶1至约100∶1、约50∶1至约500∶1、约50∶1至约1000∶1、约50∶1至约1500∶1、约50∶1至约2000∶1、约50∶1至约2500∶1、约50∶1至约3000∶1、约100∶1至约500∶1、约100∶1至约1000∶1、约100∶1至约1500∶1、约100∶1至约2000∶1、约100∶1至约2500∶1、约100∶1至约3000∶1、约500∶1至约1000∶1、约500∶1至约1500∶1、约500∶1至约2000∶1、约500∶1至约2500∶1、约500∶1至约3000∶1、约1000∶1至约1500∶1、约1000∶1至约2000∶1、约1000∶1至约2500∶1、约1000∶1至约3000∶1、约1500∶1至约2000∶1、约1500∶1至约2500∶1、约1500∶1至约3000∶1、约2000∶1至约2500∶1、约2000∶1至约3000∶1或约2500∶1至约3000∶1。
[0194]
在一些实施方案中，抗体∶唾液酸底物的质量比可以是约1∶1至约40∶1，诸如约1∶1至约2∶1、约1∶1至约4∶1、约1∶1至约6∶1、约1∶1至约8∶1、约1∶1至约10∶1、约1∶1至约15∶1、约1∶1至约20∶1、约2∶1至约4∶1、约2∶1至约6∶1、约2∶1至约8∶1、约2∶1至约10∶1、约2∶1至约15∶1、约2∶1至约20∶1、约2∶1至约40∶1、约4∶1至约6∶1、约4∶1至约8∶1、约4∶1至约10∶1、约4∶1至约15∶1、约4∶1至约20∶1、约4∶1至约40∶1、约6∶1至约8∶1、约6∶1至约10∶1、约6∶1至约15∶1、约6∶1至约20∶1、约6∶1至约40∶1、约8∶1至约10∶1、约8∶1至约15∶1、约8∶1至约20∶1、约8∶1至约40∶1、约10∶1至约15∶1、约10∶1至约20∶1、约10∶1至约40∶1、约15∶1至约20∶1、约15∶1至约40∶1或约20∶1至约40∶1。
[0195]
在一些实施方案中，所述方法包括使结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触至少30分钟，诸如至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时或至少48小时。在一些实施方案中，接触发生持续约30分钟至约48小时，诸如约30分钟至约4小时、约30分钟至约5小时、约30分钟至约6小时、约30分钟至约7小时、约30分钟至约10小时、约30分钟至约12小时、约30分钟至约18小时、约30分钟至约24小时、约30分钟至约36小时、约2小时至约48小时、约3小时至约6小时、约3小时至约10小时、约3小时至约12小时、约3小时至约18小时、约3小时至约24小时、约3小时至约36小时、约3小时至约48小时、约4小时至约10小时、约4小时至约12小时、约4小时至约18小时、约4小时至约24小时、约4小时至约36小时、约4小时至约48小时、约5小时至约10小时、约5小时至约12小时、约5小时至约18小时、约5小时至约24小时、约5小时至约36小时、约5小时至约48小时、约7小时至约10小时、约7小时至约12小时、约7小时至约18小时、约7小时至约24小时、约7小时至约36小时、约7小时至约48小时、约10小时至约18小时、约10小时至约24小时、约10小时至约36小时、约10小时至约48小时、约12小时至约18小时、约12小时至约24小时、约12小时至约36小时、约12小时至约48小时、约18小时至约24小时、约18小时至约36小时、约18小时至约48小时、约24小时至约36小时、约24小时至约48小时或约36小时至约48小时。
[0196]
在一些实施方案中，所述方法包括使结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物在以下温度下接触∶约2℃至约40℃，诸如约2℃至约37
°
、2℃至约30℃、2℃至约25℃、2℃至约22℃、2℃至约20℃、2℃至约10℃、约4℃至约40℃、约4℃c至约37℃、4℃至约30℃、4℃至约25℃、4℃至约22℃、4℃至约20℃、4℃至约10℃、约10℃至约40℃、约10
℃至约37℃、10℃至约30℃、10℃至约25℃、10℃至约22℃、10℃至约20℃、约20℃至约40℃、约20℃至约37℃、20℃至约30℃、20℃至约25℃、20℃至约22℃、约22℃至约40℃、约22℃至约37℃、22℃至约30℃、22℃至约25℃、约25℃至约40℃、约25℃至约37℃、25℃至约30℃、约30℃至约40℃或约30℃至约37℃。
[0197]
除非另外指示，否则本公开采用本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术。文献中充分解释了此类技术。参见，例如，green和sambrook，编(2012)molecular cloning a laboratory manual(第4版；cold spring harbor laboratory press)；sambrook等人，编(1992)molecular cloning：a laboratory manual，(cold springs harbor laboratory，ny)；d.n.glover和b.d.hames，编，(1995)dna cloning第2版(irl press)，第1-4卷；gait，编(1990)oligonucleotide synthesis(irl press)；mullis等人美国专利号4，683，195；hames和higgins，编(1985)nucleic acid hybridization(irl press)；hames和higgins，编(1984)transcription and translation(irl press)；freshney(2016)culture of animal cells，第7版(wiley-blackwell)；woodward，j.，immobilized cells and enzymes(irl press)(1985)；perbal(1988)a practical guide to molecular cloning；第2版(wiley-interscience)；miller和calos编(1987)gene transfer vectors for mammalian cells，(cold spring harbor laboratory)；s.c.makrides(2003)gene transfer and expression in mammalian cells(elsevier science)；methods in enzymology，第151-155卷(academic press，inc.，n.y.)；mayer和walker，编(1987)immunochemical methods in cell and molecular biology(academic press，london)；weir和blackwell，编；以及ausubel等人(1995)current protocols in molecular biology(john wiley和sons)。
[0198]
抗体工程的一般原理提出于例如，strohl、w.r.和l.m.strohl(2012)，therapeutic antibody engineering(woodhead publishing)中。蛋白质工程的一般原理提出于例如，park和cochran，编(2009)，protein engineering and design(cdc press)中。免疫学的一般原理提出于例如：abbas和lichtman(2017)cellular and molecular immunology第9版(elsevier)中。此外，可遵循本领域已知的免疫学标准方法，例如，current protocols in immunology(wiley online library)；wild，d.(2013)，the immunoassay handbook第4版(elsevier science)；greenfield，编(2013)，antibodies，a laboratory manual，第2版(cold spring harbor press)；和ossipow和fischer，编(2014)，monoclonal antibodies：methods and protocols(humana press)中的方法。
[0199]
以上引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献均通过引用以其整体并入本文。
[0200]
示例性实施方案
[0201]
所提供的实施方案包括：
[0202]
实施方案1.一种多聚体结合分子的单克隆群体，所述结合分子各自包含十个或十二个igm衍生的重链，其中igm衍生的重链包含糖基化的igm重链恒定区，所述恒定区各自与特异性结合靶标的结合结构域缔合，其中每个igm重链恒定区包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个天冬酰胺(n)连接的糖基化基序，其中n连接的糖基化基序包含氨基酸序列n-x1-s/t，其中n是天冬酰胺，x1是除脯氨酸以外的任何氨基酸，并且s/t是丝
氨酸或苏氨酸，其中每个igm重链恒定区上的n连接的糖基化基序中的至少一个、至少两个或至少三个由复合聚糖占据，并且其中结合分子的单克隆群体包含每摩尔结合分子至少三十五(35)摩尔唾液酸。
[0203]
实施方案2.如实施方案1所述的结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子至少40、至少45、至少50、至少55、至少60或至少65摩尔唾液酸。
[0204]
实施方案3.如实施方案1所述的结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子约40至约70、约40至约60、约40至约55、约40至约50、约50至约70、约60至约70摩尔唾液酸。
[0205]
实施方案4.如实施方案1至3中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中igm重链恒定区是人igm重链恒定区或其变体，其包含从对应于seq id no：1(等位基因ighm*03)或seq id no：2(等位基因ighm*04)的氨基酸46(基序n1)、氨基酸209(基序n2)、氨基酸272(基序n3)、氨基酸279(基序n4)和氨基酸440(基序n5)的氨基酸位置处开始的五个n连接的糖基化基序n-x1-s/t。
[0206]
实施方案5.如实施方案4所述的结合分子的单克隆群体，其中基序n1、n2和n3由复合聚糖占据。
[0207]
实施方案6.如实施方案1至5中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其通过细胞系修饰、体外糖工程化或其任何组合的方法产生。
[0208]
实施方案7.如实施方案6所述的结合分子的单克隆群体，其中所述细胞系修饰包括用编码唾液酸转移酶的基因转染产生所述结合分子的单克隆群体的细胞系，从而产生过表达所述唾液酸转移酶的修饰的细胞系。
[0209]
实施方案8.如实施方案7所述的结合分子的单克隆群体，其中所述唾液酸转移酶包含人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1)(seq id no：3)。
[0210]
实施方案9.如实施方案7或实施方案8所述的结合分子的单克隆群体，其中所述细胞系修饰还包括用编码半乳糖基转移酶的基因转染产生所述结合分子的单克隆群体的细胞系，从而产生过表达所述半乳糖基转移酶的修饰的细胞系。
[0211]
实施方案10.如实施方案9所述的结合分子的单克隆群体，其中所述半乳糖基转移酶包括人β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)(seq id no：4)。
[0212]
实施方案11.如实施方案6至10中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中体外糖工程化包括使所述结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触。
[0213]
实施方案12.如实施方案11所述的结合分子的单克隆群体，其中所述唾液酸转移酶包含人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1)(seq id no：3)的可溶性变体。
[0214]
实施方案13.如实施方案12所述的结合分子的单克隆群体，其中所述st6gal1的可溶性变体包含seq id no：3的氨基酸x至406，其中x是27至120的整数。
[0215]
实施方案14.如实施方案13所述的结合分子的单克隆群体，其中所述st6gal1的可溶性变体包含seq id no：3的氨基酸120至406、115至406、110至406、109至406、105至406、100至406、95至406、90至406、89至406、88至406、87至406、86至406、85至406、84至406、83至406、82至406、81至406、80至406、75至406、70至406、65至406、60至406、55至406、50至406、45至406、40至406、35至406、30至406或27至406。
[0216]
实施方案15.如实施方案11至14中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述唾液酸底物包含胞苷单磷酸-n-乙酰基-神经氨酸(cmp-nana)。
[0217]
实施方案16.如实施方案11至15中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中结合分子：唾液酸底物的质量比为约1∶4至约40∶1。
[0218]
实施方案17.如实施方案11至16中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约80∶1至约5000∶1。
[0219]
实施方案18.如实施方案11至17中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约2000∶1。
[0220]
实施方案19.如实施方案18所述的结合分子的单克隆群体，其中结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比为约2000∶500∶1。
[0221]
实施方案20.如实施方案11至17中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中结合分子∶唾液酸转移酶的摩尔比为约80∶1。
[0222]
实施方案21.如实施方案20所述的结合分子的单克隆群体，其中结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的摩尔比为约80∶500∶1。
[0223]
实施方案22.如实施方案11至17中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约500∶1。
[0224]
实施方案23.如实施方案22所述的结合分子的单克隆群体，其中结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比为约500∶62.5∶1。
[0225]
实施方案24.如实施方案11至23中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述结合分子的单克隆群体与所述可溶性唾液酸转移酶和所述唾液酸底物的接触包括至少30分钟的接触。
[0226]
实施方案25.如实施方案24所述的结合分子的单克隆群体，其中所述接触包括至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、24小时、36小时或48小时的接触。
[0227]
实施方案26.如实施方案11至25中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述结合分子的单克隆群体与所述可溶性唾液酸转移酶和所述唾液酸底物的接触在约2℃至约40℃下发生。
[0228]
实施方案27.如实施方案26所述的结合分子的单克隆群体，其中所述接触在15℃至约37℃、15℃至约30℃或15℃至约25℃下发生。
[0229]
实施方案28.如实施方案11至27中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中体外糖工程化还包括使所述结合分子的单克隆群体与半乳糖基转移酶和半乳糖底物接触。
[0230]
实施方案29.如实施方案28所述的结合分子的单克隆群体，其中所述半乳糖基转移酶包括人β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)(seq id no：4)的可溶性变体。
[0231]
实施方案30.如实施方案29所述的结合分子的单克隆群体，其中所述b4galt4的可溶性变体包含seq id no：4的氨基酸x至344，其中x是39至120的整数。
[0232]
实施方案31.如实施方案30所述的结合分子的单克隆群体，其中所述b4galt4的可溶性变体包含seq id no：4的氨基酸120至344、115至344、110至344、105至344、100至344、95至344、90至344、85至344、80至344、75至344、70至344、65至344、60至344、55至344、50至344、45至344、40至344或39至344。
[0233]
实施方案32.如实施方案28至31中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述半乳糖底物包括尿苷-二磷酸-α-d-半乳糖(udp-gal)。
[0234]
实施方案33.如实施方案28至32中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中与
所述半乳糖基转移酶和所述半乳糖底物的接触发生在与所述可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触之前或与其同时发生。
[0235]
实施方案34.如实施方案1至33中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子是多特异性的，并且其中与每个结合分子的igm重链恒定区缔合的两个或更多个结合结构域特异性结合不同的靶标。
[0236]
实施方案35.如实施方案1至33中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中与每个结合分子的igm重链恒定区缔合的结合结构域特异性结合相同的靶标。
[0237]
实施方案36.如实施方案35所述的结合分子的单克隆群体，其中与每个结合分子的igm重链恒定区缔合的结合结构域是相同的。
[0238]
实施方案37.如实施方案34至36中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述结合结构域是抗体衍生的抗原结合结构域。
[0239]
实施方案38.如实施方案37所述的结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子是分别包含五个或六个二价igm结合单元的五聚体或六聚体igm抗体，其中每个结合单元包含两条igm重链(各自包含位于变体igm恒定区的氨基端的vh)以及两条免疫球蛋白轻链(各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的轻链可变结构域(vl))，并且其中vh和vl组合形成特异性地结合靶标的抗原结合结构域。
[0240]
实施方案39.如实施方案38所述的结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子的每个抗原结合结构域结合相同的靶标。
[0241]
实施方案40.如实施方案39所述的结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子的每个抗原结合结构域是相同的。
[0242]
实施方案41.如实施方案1至40中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述靶标是靶表位、靶抗原、靶细胞、靶器官或靶病毒。
[0243]
实施方案42.如实施方案1至41中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子是五聚体并且还包含j链、或其功能片段、或其功能变体。
[0244]
实施方案43.实施方案42的结合分子的单克隆群体，其中所述j链是成熟人j链，其包含氨基酸序列seq id no：6或其功能片段、或其功能变体。
[0245]
实施方案44.如实施方案43所述的结合分子的单克隆群体，其中所述j链包含从对应于seq id no：6(基序n6)的氨基酸49的氨基酸位置处开始的n连接的糖基化基序n-x1-s/t。
[0246]
实施方案45.如实施方案42至44中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述j链是功能变体j链，其相对于除了一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外与变体j链相同的参考j链包含一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入，并且其中结合分子的单克隆群体相对于除了变体j链中一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外相同的参考igm衍生的结合分子在施用于受试者动物之后表现出增加的血清半衰期，并且使用相同的方法将j链施用于相同的动物物种。
[0247]
实施方案46.如实施方案45所述的结合分子的单克隆群体，其中所述变体j链或其功能片段包含相对于参考j链的一个、两个、三个或四个单一氨基酸取代、缺失或插入。
[0248]
实施方案47.如实施方案45或实施方案46所述的结合分子的单克隆群体，其中所述变体j链或其功能片段在对应于seq id no：6的野生型成熟人j链的氨基酸y102的氨基酸
位置处包含氨基酸取代。
[0249]
实施方案48.如实施方案47所述的结合分子的单克隆群体，其中对应于seq id no：6的y102的氨基酸被丙氨酸(a)取代。
[0250]
实施方案49.如实施方案48所述的结合分子的单克隆群体，其中所述j链包含氨基酸序列seq id no：7。
[0251]
实施方案50.如实施方案42至49中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述j链或其片段或变体是还包含异源部分的修饰的j链，其中所述异源部分与所述j链或其片段或变体融合或缀合。
[0252]
实施方案51.如实施方案50所述的结合分子的单克隆群体，其中所述异源部分是与j链或其片段或变体融合的多肽。
[0253]
实施方案52.如实施方案51所述的结合分子的单克隆群体，其中所述异源多肽通过肽接头与j链或其片段或变体融合。
[0254]
实施方案53.如实施方案52所述的结合分子的单克隆群体，其中所述肽接头包含至少5个氨基酸，但不超过25个氨基酸。
[0255]
实施方案54.如实施方案52或实施方案53所述的结合分子的单克隆群体，其中所述肽接头由ggggsggggsggggs(seq id no：43)组成。
[0256]
实施方案55.如实施方案51至54中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述异源多肽与所述j链或其片段或变体的n端融合或与所述j链或其片段或变体的c端融合。
[0257]
实施方案56.如实施方案51至55中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中可以相同或不同的异源部分与所述j链或其片段或变体的n端和c端融合。
[0258]
实施方案57.如实施方案51至56中任一项所述的结合分子的单克隆群体，其中所述异源多肽包含结合结构域。
[0259]
实施方案58.如实施方案57所述的结合分子的单克隆群体，其中所述异源多肽的结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
[0260]
实施方案59.如实施方案58所述的结合分子的单克隆群体，其中所述抗原结合片段是scfv片段。
[0261]
实施方案60.如实施方案59所述的结合分子的单克隆群体，其中所述异源scfv片段结合cd3ε。
[0262]
实施方案61.如实施方案60所述的结合分子的单克隆群体，其中所述修饰的j链包含通过肽接头融合至抗cd3εscfv的氨基酸序列seq id no：36(v15j)、seq id no：37(v15j*)、seq id no：38(sj*)、seq id no：31(a-55-j*)、seq id no：32(a-56-j*)、seq id no：33(a-57-j*)、seq id no：34的氨基酸20-420(vjh)、seq id no：35的氨基酸20-420(vj*h)、或seq id no：6或7，所述抗cd3εscfv包含分别包含seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：19、seq id no：20和seq id no：21的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列。
[0263]
实施方案62.一种药物组合物，其包含如实施方案1至61中任一项所述的结合分子的单克隆群体和药学上可接受的赋形剂。
[0264]
实施方案63.一种重组宿主细胞，其产生如实施方案1至61中任一项所述的结合分子的单克隆群体。
[0265]
实施方案64.一种产生如实施方案1至61中任一项所述的结合分子的单克隆群体的方法，其包括培养如实施方案62所述的宿主细胞，以及恢复所述结合分子的群体。
[0266]
实施方案65.一种用于产生高度唾液酸化的多聚体结合分子的单克隆群体的方法，其包括提供表达结合分子的单克隆群体的细胞系、培养细胞系以及恢复结合分子的单克隆群体，其中每个结合分子包含十个或十二个igm衍生的重链，其中igm衍生的重链包含糖基化的igm重链恒定区，所述igm重链恒定区各自与特异性地结合靶标的结合结构域缔合，其中每个igm重链恒定区包含至少三个、至少四个或至少五个天冬酰胺(n)连接的糖基化基序，其中n连接的糖基化基序包含氨基酸序列n-x1-s/t，其中n是天冬酰胺、x1是除脯氨酸以外的任何氨基酸、并且s/t是丝氨酸或苏氨酸，其中平均群体中每个igm重链恒定区上的n连接的糖基化基序中的至少一个、至少两个或至少三个由复合聚糖占据，并且其中细胞系、恢复过程或其组合经优化以富集复合聚糖，所述复合聚糖包含每个聚糖至少一个、两个、三个或四个唾液酸末端单糖。
[0267]
实施方案66.如实施方案65所述的方法，其中所述细胞系、恢复过程或其组合经优化以产生结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60或至少65摩尔唾液酸。
[0268]
实施方案67.如实施方案66所述的方法，其中所述细胞系、恢复过程或其组合经优化以产生结合分子的单克隆群体，其包含每摩尔结合分子约40至约70、约40至约60、约40至约55、约40至约50、约50至约70、约60至约70摩尔唾液酸。
[0269]
实施方案68.如实施方案65至67中任一项所述的方法，其中所述igm重链恒定区衍生自人igm重链恒定区，其包括从对应于seq id no：1(等位基因ighm*03)或seq id no：2(等位基因ighm*04)的氨基酸46(基序n1)、氨基酸209(基序n2)、氨基酸272(基序n3)、氨基酸279(基序n4)和氨基酸440(基序n5)的氨基酸位置处开始的五个n连接的糖基化基序n-x1-s/t。
[0270]
实施方案69.如实施方案68所述的方法，其中平均结合分子的群体中基序n1、n2和n3中的一个、两个或所有三个由复合聚糖占据。
[0271]
实施方案70.如实施方案65至69中任一项所述的方法，其中所提供的细胞系经修饰以过表达唾液酸转移酶。
[0272]
实施方案71.如实施方案70所述的方法，其中所述唾液酸转移酶包括人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1，seq id no：3)。
[0273]
实施方案72.如实施方案65至71中任一项所述的方法，其中所述恢复过程包括使所述结合分子的单克隆群体经受体外糖工程化。
[0274]
实施方案73.如实施方案72所述的方法，其中所述体外糖工程化包括使所述结合分子的单克隆群体与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触。
[0275]
实施方案74.如实施方案73所述的方法，其中所述唾液酸转移酶包括人β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(st6gal1)(seq id no：3)的可溶性变体。
[0276]
实施方案75.如实施方案74所述的方法，其中st6gal1的可溶性变体包含seq id no：3的氨基酸x至406，其中x是27至120的整数。
[0277]
实施方案76.如实施方案75所述的方法，其中st6gal1的可溶性变体包含seq id no：3的氨基酸120至406、115至406、110至406、109至406、105至406、100至406、95至406、90
至406、89至406、88至406、87至406、86至406、85至406、84至406、83至406、82至406、81至406、80至406、75至406、70至406、65至406、60至406、55至406、50至406、45至406、40至406、35至406、30至406或27至406。
[0278]
实施方案77.如实施方案73至75中任一项所述的方法，其中所述唾液酸底物包括胞苷单磷酸(cmp)-n-乙酰基-神经氨酸(cmp-nana)。
[0279]
实施方案78.如实施方案73至77中任一项所述的方法，其中结合分子：唾液酸底物的质量比为约1∶4至约40∶1。
[0280]
实施方案79.如实施方案73至78中任一项所述的方法，其中结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约80∶1至约10000∶1。
[0281]
实施方案80.如实施方案73至79中任一项所述的方法，其中结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约2000∶1。
[0282]
实施方案81.如实施方案80所述的方法，其中结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比为约2000∶500∶1。
[0283]
实施方案82.如实施方案73至79中任一项所述的方法，其中结合分子∶唾液酸转移酶的摩尔比为约80∶1。
[0284]
实施方案83.如实施方案82所述的方法，其中结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的摩尔比为约80∶500∶1。
[0285]
实施方案84.如实施方案73至79中任一项所述的方法，其中结合分子∶唾液酸转移酶的质量比为约500∶1。
[0286]
实施方案85.如实施方案84所述的方法，其中结合分子∶唾液酸底物∶唾液酸转移酶的质量比为约500∶62.5∶1。
[0287]
实施方案86.如实施方案73至85中任一项所述的方法，其中所述结合分子的单克隆群体与所述可溶性唾液酸转移酶和所述唾液酸底物的接触包括至少30分钟的接触。
[0288]
实施方案87.如实施方案86所述的方法，其中所述接触包括至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、24小时、36小时或48小时的接触。
[0289]
实施方案88.如实施方案73至87中任一项所述的方法，其中所述结合分子的单克隆群体与所述可溶性唾液酸转移酶和所述唾液酸底物的接触在约2℃至约40℃下发生。
[0290]
实施方案89.如实施方案88所述的方法，其中所述接触在15℃至约37℃、15℃至约30℃或15℃至约25℃下发生。
[0291]
实施方案90.如实施方案73至77中任一项所述的方法，其中体外糖工程化还包括使所述结合分子的单克隆群体与半乳糖基转移酶和半乳糖底物接触。
[0292]
实施方案91.如实施方案90所述的方法，其中所述半乳糖基转移酶包括人β-1，4-半乳糖基转移酶4(b4galt4)(seq id no：4)的可溶性变体。
[0293]
实施方案92.如实施方案90或实施方案91所述的方法，其中所述半乳糖底物包括尿苷-二磷酸-α-d-半乳糖(udp-gal)。
[0294]
实施方案93.如实施方案90至92中任一项所述的方法，其中与半乳糖基转移酶和半乳糖底物的接触发生在与可溶性唾液酸转移酶和唾液酸底物接触之前或与其同时发生。
[0295]
通过例示性而非通过限制性的方式提供以下实施例。
[0296]
实施例
[0297]
实施例1：材料和方法
[0298]
igm抗体的群体
[0299]
除下文所述外，这些实验是对igm双特异性抗体cd20 x cd3igm-a的单克隆群体进行的，所述抗体包括包含野生型人igm恒定区(例如，seq id no：1或seq id no：2)和seq id no：8的抗cd20vh区的igm重链、包含seq id no：9的抗cd20 vl区的轻链、以及包含seq id no：34的氨基酸20-420的与cd3结合的经修饰的j链。cd20 x cd3 igm-a在美国专利申请公开号us-2018-0265596-a1中详细描述，所述申请通过引用以其整体并入本文。无论糖工程化的方法如何，糖工程化的igm抗体、igm样抗体或igm衍生的结合分子在全部实施例中都称为“gem”。
[0300]
igm抗体群体的糖工程化
[0301]
连同各种对照，将不同量的如下面的实施例所示的人α-2，6唾液酸转移酶的截短形式(“截短的人st6”，可从roche diagnostics，inc.(材料号07012250103或材料号08098174103)或从agilent(部件号gkt-s26)获得)添加到20μl反应溶液中，所述溶液含有部分纯化的igm抗体例如抗cd20 x cd3 igm-a的单克隆群体，并且将不同量的胞苷-5
′‑
单磷酸-n-乙酰神经氨酸钠盐(cmp-nana)溶解在50mm tris-乙酸盐(ph 7.5)中。除非另有说明，否则使反应在37℃下进行持续8小时。通过在-20℃下冷冻来停止反应。在进一步分析之前，st6处理的igm群体例如通过阴离子交换色谱法和/或混合模式色谱法被进一步纯化。
[0302]
总唾液酸定量
[0303]
唾液酸(nana)测定试剂盒(agilent advancebio总唾液酸定量试剂盒)测量来自糖蛋白的游离或释放的唾液酸(n-乙酰神经氨酸(nana))。所述测定使用酶偶联反应，其中游离唾液酸的氧化产生一种中间体，所述中间体与探针发生化学计量反应，产生可通过吸光度(od＝530nm)或荧光(激发/发射(ex/em)＝530/590nm)检测的产物。所述试剂盒在40pmol-1,000pmol的线性范围内测量唾液酸，检测灵敏度为0.15mg/ml，对于igm抗体浓度。根据制造商的建议使用所述试剂盒。简而言之，用唾液酸酶a消化样品持续2小时。牛胎球蛋白对照蛋白用作阳性对照，预期范围为9.6-13.9mol/mol。唾液酸标准品使用以下荧光测量pmol来制备：1,000、500、250和0pmol。然后根据下表2制备转化和显影剂混合物。
[0304]
表2：唾液酸定量测定
[0305][0306]
一旦唾液酸通过唾液酸酶a消化释放，n-乙酰神经氨酸醛缩酶就会催化反应形成丙酮酸。然后反应以丙酮酸氧化酶作为催化剂经过一个额外的步骤，形成过氧化氢，所述过氧化氢与染料形成1∶1复合物以形成荧光报告子染料。该染料可通过荧光检测(ex/em＝530/590nm)来读取，然后将其关联以根据唾液酸标准曲线给出唾液酸水平mol/mol。
[0307]
实施例2：α-2，6唾液酸转移酶浓度对igm抗体群体的唾液酸化的影响
[0308]
如实施例1中所述，将不同量的截短的人st6添加到20μl反应溶液中，所述溶液包含60μg抗cd20 x cd3 igm-a(3mg/ml)和30μg胞苷-5
′‑
单磷酸-n-乙酰神经氨酸钠盐(cmp-nana，1.5mg/ml)。所得唾液酸化如实施例1中所述量化，并且与截短的人st6浓度相比的唾液酸化量示出在图4中。
[0309]
这些结果证明了低至1.5μg/ml(igm与截短的人st6的摩尔比为80∶1)的st6浓度可用于产生40mol/mol的sa水平，并且随着截短的人st6浓度增加到30μg/ml或更高(igm与截短的人st6的摩尔比为约4∶1或更高)，可以产生大于60mol/mol的sa水平。
[0310]
实施例3：其他igm抗体的唾液酸化
[0311]
为了确定以上开发体外唾液酸化程序是否可以应用于其他igm抗体，将表达重组igm抗体(五聚体抗dr5 igm-b(vh：seq id no：10，vl：seq id no：11，参见美国专利号7,521,048)和六聚体抗dr5igm-c(vh：seq id no：12，vl：seq id no：13，参见美国专利号7,790,165))的两种其他cho细胞系唾液酸化并且如实施例1所述进行分析。所述20μl反应液包含0.28μg截短的人st6(终浓度为14μg/ml)、60μg抗dr5 igm-b或抗dr5 igm-c(大约8∶1的igm与截短的人st6的摩尔比)并且使用了30μg cmp-nana。还进行了没有截短的人st6的对照反应。如实施例1所述测定所得唾液酸化，并且每种条件的唾液酸化量示出在图5和表3中。
[0312]
表3：抗dr5抗体的唾液酸化
[0313]
抗体条件sa(mol/mol)抗dr5 igm-b无st616抗dr5 igm-b-gem st652抗dr5 igm-c无st69抗dr5 igm-c-gem st652
[0314]
实施例4：人血清igm的唾液酸化水平
[0315]
人血清igm(得自sigma，目录号i8260-25mg)的唾液酸化水平使用如实施例1中所解释的唾液酸(nana)测定试剂盒(agilent advancebio总唾液酸定量试剂盒)来确定。
[0316]
一旦唾液酸通过唾液酸酶a消化释放，n-乙酰神经氨酸醛缩酶就会催化反应形成丙酮酸。然后反应以丙酮酸氧化酶作为催化剂经过一个额外的步骤形成过氧化氢，所述过氧化氢与染料形成1∶1复合物以形成荧光报告子染料。该染料可通过荧光检测(ex/em＝530/590nm)来读取，然后将其关联以根据唾液酸标准曲线给出唾液酸水平mol/mol。所得唾液酸化量示出在表4中。
[0317]
表4：人血清igm的唾液酸含量
[0318]
抗体sa(mol/mol)人血清igm30
[0319]
实施例5：增加的唾液酸化对igm抗体的影响
[0320]
本实施例的实验中使用的糖工程化的igm cd20 x cd3 igm-a(“抗cd20 x cd3 igm-a-gem”)材料具有约37摩尔唾液酸/摩尔的igm并且如实施例1中所述来制备。非糖工程化的igm cd20 x cd3 igm-a具有约14摩尔唾液酸/摩尔的igm。
[0321]
补体依赖性细胞毒性
[0322]
将cd20表达ramos(atcc目录号crl-1596)细胞培养在补充有10％热灭活的胎牛血清(gibco目录号16140-071)的rpmi(invitrogen)中。将ramos细胞(50,000)以10ul/孔的体积接种在96孔板中。将细胞用如实施例1所述在体外唾液酸化的2个不同批次的抗cd20 x cd3 igm或抗cd20 x cd3 igm-a(“抗cd20 x cd3 igm-a-gem”)的10ul/孔连续稀释液处理。所有抗体稀释液均在补充有10％热灭活的血清的rpmi培养基中进行。将人血清补体(quidel目录号a113)以10ul/孔体积添加到抗体处理的细胞中，终浓度为5％。将反应混合物在37℃下孵育持续4小时。试剂(promega目录号g7572)以体积等于每个孔中存在的培养基的体积添加。将板振摇持续2分钟，在室温下孵育持续10分钟，并且在envision多模式读数器(perkin elmer)上使用每孔0.1s的积分时间测量发光。使用graphpad prism和四参数拟合分析数据，顶部值和底部值分别固定在100％和0％活力。计算每种条件下产生半数最大响应的抗体浓度(ec
50
)，并示出在表5中。体外唾液酸化对补体依赖性细胞毒性没有明显影响。
[0323]
表5：cdc活性
[0324]
样品ec
50
(pm)抗cd20 x cd3 igm-a260抗cd20 x cd3 igm-a-gem230
[0325]
t细胞活化
[0326]
在基于抗原阳性jurkat的报告细胞的存在下，使用基于发光的读数确定由抗cd20 x cd3 igm-a-gem或抗cd20 x cd3 igm-a导致的t细胞活化(tca)。将工程化的jurkat t细胞(promega j1601部件号j131a)和ramos细胞培养在补充有10％热灭活的胎牛血清(gibco目录号16140-071)的rpmi(invitrogen)中。将ramos细胞(7500个细胞/孔，10ul体积)添加到白色384孔测定板中。接下来，将抗cd20 x cd3 igm-a-gem或抗cd20 x cd3 igm-a的连续稀释液以10μl体积添加到ramos细胞中。将工程化的jurkat细胞(25000个细胞/孔，20μl体积)添加到混合物中，终体积为40μl。将混合物在37℃、5％co2下孵育持续16h。然后将细胞混合物与含有荧光素(promega，)的20μl裂解缓冲液混合以测量荧光素酶报告子活性。通过envision读板器测量光输出。ec
50
使用prism软件通过4参数曲线拟合来确定。
[0327]
计算每种条件下的ec
50
并示出在表6中。体外唾液酸化对t细胞活化没有明显影响。
[0328]
表6：t细胞活化
[0329][0330]
体外b细胞杀伤
[0331]
将ramos(cd19 cd20 b细胞系)用细胞示踪染料(oregon green 488，thermofisher，目录号c34555)标记，然后在37℃、5％co2下使用抗cd20 x cd3 igm-a或抗cd20 x cd3 igm-a-gem的连续稀释液与原代人cd8 t细胞(precision for medicine，目录号84300；阴性选择)共培养持续48小时。收获细胞，并将其用7-aad(bd biosciences，目
录号559925)染色并通过流式细胞术分析以评估活b细胞。计算每种条件下的ec
50
并示出在表7中。体外唾液酸化对抗体杀伤b细胞的能力没有明显影响。
[0332]
表7：t细胞依赖性b细胞杀伤
[0333]
样品最大(％)ec
50
(pm)抗cd20 x cd3 igm-a94.56.57抗cd20 x cd3 igm-a-gem94.87.99
[0334]
药代动力学
[0335]
如下测量体内小鼠模型中各种igm抗体的药代动力学参数。通过静脉内输注，balb/c小鼠注射有5mg/kg的抗cd20 x cd3 igm-a或抗cd20 x cd3 igm-a-gem抗体。对于每种抗体，在总共10或12个时间点收集血样，每个时间点2只小鼠。每只小鼠通过面部静脉放血一次(100μl)，然后通过心脏末端穿刺再次放血(最大可获得的，约500μl)。使用标准elisa测定测量每个时间点血液中每种抗体的血清浓度。对所有elisa进行质量指标验证，并且使用标准曲线拟合技术(win non lin，phoenix software)导出pk参数(包括t
1/2-α
、t
1/2-β
)和从时间零到无穷大的浓度曲线下面积(auc
0-∞
，以μg/ml*hr为单位进行测量)。pk结果(包括曲线下面积(auc))呈现在图6中。
[0336]
实施例6：细胞系工程以增加唾液酸化
[0337]
通过标准方法产生包含gacacc kozak序列，编码α-2，6-唾液酸转移酶(st6)seq id 3(ncbi参考序列：sp|p15907.1)的序列和潮霉素标志物选择的载体。将载体电穿孔到表达抗cd20 x cd3 igm-a的稳定cho亚克隆中。在选择和恢复之后，通过有限稀释将所得汇集物亚克隆到384孔板中。通过用与异硫氰酸荧光素(fitc)缀合的sna-1标记亚克隆的细胞来进行表型筛选。sna-1是一种对2，6-唾液酸具有特异性的凝集素。细胞本身在facs缓冲液中洗涤之后直接被标记。检测荧光水平，并且结果示出在图7中。60个亚克隆中仅有4个产生的信号高于用作阳性对照的hek293细胞的信号。挑选出两个亚克隆25和47用于进一步研究。
[0338]
为了检测亚克隆25和47的基因组中st6的存在，使用表8中的引物进行qpcr分析。
[0339]
表8：qpcr测定中使用的引物。
[0340]
引物1gac cga cgt gtg cta cta tta c(seq id no：39)引物2gag gtg ctt cac gag att ctt(seq id no 40)
[0341]
这些引物呈现在st6基因的编码序列(cds)中。两个亚克隆到第38个循环时产生了阳性响应，而cho细胞对照则没有。
[0342]
进行蛋白质印迹以检测从小规模发酵中表达和纯化的抗cd20 x cd3 igm-a抗体中的2，6连接的唾液酸。根据制造商的说明对还原的变性凝胶(criteriontgx免染预制凝胶)进行可视化和成像。所得图像示出在图8a中。然后用生物素化的sna-i凝集素和链霉亲和素辣根过氧化物酶融合蛋白处理凝胶并对其进行成像。所得图像示出在图8b中。
[0343]
选定的亚克隆具有可检测水平的2，6-唾液酸；而亚克隆来源于的稳定cho细胞汇集物则没有。
[0344]
将亚克隆25扩增用于3升生物反应器生产运行，以便针对在没有2，6-唾液酸转移酶基因的细胞中产生的亲代抗cd20 x cd3 igm-a进行比较研究。图9a-d示出了培养物在活
细胞密度(图9a)、细胞活力(图9b)、抗cd20 x cd3 igm-a的产生(图9c)和每摩尔抗cd20 x cd3 igm-a的唾液酸摩尔数(图9d)方面表现如何。到第8天，亚克隆25产生的抗cd20 x cd3 igm-a比亲代细胞系少25％(图9c)，但唾液酸含量增加了不止一倍并保持升高(图9d)。第12天的数据显示，亚克隆25产生了500μg/ml(图9c)，唾液酸含量为igm的37mol/mol(图9d)。
[0345]
实施例7：2，6-唾液酸敲入亲代细胞系
[0346]
用于稳定插入α-2，6-唾液酸转移酶(ncbi参考序列：np_775324.1)和潮霉素标志物选择的载体由商业供应商产生。将载体电穿孔到cho悬浮细胞系中。克隆所得稳定汇集物，并且扩增384个克隆并通过细胞术筛选。基于细胞表面的标记是用与cy5染料化学缀合的2,6-唾液酸特异性凝集素(sna-1)进行的，该测定的结果示出在图10a中。根据筛选，将48个生长良好且具有高凝集素标记水平的克隆扩增到24深孔板，并在37℃、5％co2和80％湿度的孵育箱中以300rpm振摇。在48个克隆在深孔板中扩增之后进行相同的2，6-唾液酸筛选，并将顶部的22个转移到振摇瓶中。
[0347]
当细胞密度在1-4百万个细胞/ml之间时，对选定的22个克隆再次进行筛选。图10b示出了这种情况下的凝集素标记水平以及在测定它们时培养物的对应活力。
[0348]
基于振摇瓶分析，选择六个克隆最初通过用两到四种对照igm转染进行评价。亲代cho细胞系也用相同的四种对照igm转染并用作比较的基础。转染之后，六个选定的克隆中的四个要么无法恢复，要么在转染之后或之前出现生长问题。能够在转染之后存活的两个克隆(2b4和2c2)除了一种情况外的所有情况下都显示出更高的滴度，并且在所有情况下都具有比来自亲代cho细胞系的igm更高的唾液酸含量。表9示出了7天补料批次发酵的结果，比较了亲代细胞系与两个2，6-唾液酸转移酶克隆。唾液酸含量由收获之后纯化的蛋白质确定。四种不同的igm被转染到2b4和亲代细胞系中，并且这些igm中的两种也被转染到2c2中。
[0349]
表9：获得来自收获的发酵的纯化蛋白质的滴度数据和唾液酸水平。
[0350]
[0351][0352]
为了进一步表征克隆，通过细胞术测量细胞表面上的2，6-唾液酸和2，3-唾液酸水平。使用对任一形式的唾液酸具有特异性的荧光缀合凝集素进行测量。在进行标记时，所有活力均超过95％。hek293细胞、cho亲代细胞系、选定的克隆和igm转染的克隆都以相同的方式进行分析。图11a和11b分别示出了未转染细胞的2，3-唾液酸和2,6-唾液酸水平。图11c比较了未转染和igm#4转染的亲代和2b4细胞中的2，3-唾液酸和2，6-唾液酸水平。图11a中所示的数据表明cho亲代细胞具有比hek293细胞或用2，6-唾液酸转移酶转染的克隆更高的2，3-唾液酸水平。图11b中所示的数据表明克隆上的2，6-唾液酸水平升高到远高于cho亲代的水平。图1ic表明igm转染的细胞系保留了高水平的2，6-唾液酸。
[0353]
实施例8：在各种条件下的体外唾液酸化
[0354]
以如表10所示的比率将不同量的截短的人st6添加到包含igm抗体和胞苷-5
′‑
单磷酸-n-乙酰神经氨酸钠盐(cmp-nana，1.5mg/ml)的反应溶液中。每个反应的持续时间和温度，以及所得唾液酸化(如实施例1中所述量化)也在表10中示出。室温(rt)为15至25℃。
[0355]
表10：体外唾液酸化条件和结果
[0356]
[0357]
[0358][0359]
通过尺寸排阻色谱法(sec)、动态光散射(dls)、杂化凝胶、还原凝胶以及实施例3中描述的cdc和tca测定比较来自条件1和2的抗体，并且体外唾液酸化不改变sec谱、动态半径或抗体的迁移率，并且抗体具有类似的活性tca和cdc活性(数据未显示)。
[0360]
还通过实施例3中描述的tca测定比较了来自条件19-23的抗体，并且数据示出在图12中。测定的所有抗体都具有类似的tca活性。
[0361]
在整个反应的设定时间点监测来自条件29-31的抗体的sa水平。超过48小时或超过前15小时的sa水平分别绘制在图13a和13b中。对于100∶50∶1的抗体∶cmp-nana∶st-6质量比，用1小时达到最大唾液酸化并且在37℃与15℃之间观察到的差异很小。
[0362]
在整个反应的设定时间点监测来自条件32-36的抗体的sa水平。超过48小时的sa水平绘制在图14中。100∶50∶1的抗体∶cmp-nana∶st-6质量比在室温下到第18小时实现唾液酸化＞60mol/mol sa，并且在室温下持续长达48小时没有显著下降。250∶125∶1的抗体∶cmp-nana∶st-6质量比导致sa水平上升较慢并在36小时之后达到＞60mol/mol sa。对于所有比率，在室温下长达36小时未观察到显著的脱唾液酸化。在5000∶2500∶1的抗体∶cmp-nana∶st-6质量比下，实现了40mol/mol sa，并且抗体群体没有最大可能程度地唾液酸化。
[0363]
实施例9：具有高唾液酸水平的igm抗体的药代动力学
[0364]
如下测量体内小鼠模型中各种igm抗体的药代动力学参数。通过静脉内输注，balb/c小鼠注射有5mg/kg的抗cd20 x cd3 igm-a、各种唾液酸水平的抗cd20 x cd3 igm-a-gem抗体、抗cd20 x cd3 igm-f、各种唾液酸水平的抗cd20 x cd3 igm-f-gem抗体、或人血清igm。对于每种抗体，在总共10或12个时间点收集血样，每个时间点至少2只小鼠。每只小鼠通过面部静脉放血一次(100μl)，然后通过心脏末端穿刺再次放血(最大可获得的，约500μl)。使用标准elisa测定测量每个时间点血液中每种抗体的血清浓度。对所有elisa进行质量指标验证，并且使用标准曲线拟合技术(win non lin，phoenix software)导出pk参数(包括t
1/2-α
、t
1/2-β
)和从时间零到无穷大的浓度曲线下面积(auc
0-∞
，以μg/ml*hr为单位进行测量)。每种抗体的唾液酸水平和所得auc
0-∞
示出在图15中。
[0365]
实施例10：在食蟹猴中具有高唾液酸水平活性的igm抗体
[0366]
如下测量体内食蟹猴模型中igm抗体的药代动力学参数和细胞标志物。食蟹猴灵长类动物注射有10mg/kg的抗cd20 x cd3 igm-f(sa 18mol/mol)(2只动物)、抗cd20 x cd3 igm-f(sa 9mol/mol)(2只动物)、或抗cd20 x cd3 igm-f-gem(sa 51mol/mol)(4只动物)抗体。对于每种抗体，在总共12个时间点收集血样。使用标准elisa测定测量每个时间点血液中每种抗体的血清浓度。对所有elisa进行质量指标验证，并且使用标准曲线拟合技术(win non lin，phoenix software)导出pk参数(包括t
1/2-α
、t
1/2-β
)和从时间零到无穷大的浓度曲线下面积(auc
0-∞
，以μg/ml*hr为单位进行测量)。流式细胞术用于测量细胞标志物。抗cd20 x cd3 igm-f(sa 18mol/mol)处理的动物与4种抗cd20 x cd3 igm-f-gem(sa 51mol/mol)处理的动物中的2种的pk结果在图16中呈现。高唾液酸抗体的auc
0-∞
是低唾液酸抗体的两倍。各时间点b细胞的相对数量示出在图17a中，并且b细胞开始恢复的日期示出在图17b中。
[0367]
实施例11：用多种酶进行体外唾液酸化
[0368]
将半乳糖基化和唾液酸化的组合与仅唾液酸化进行比较。
[0369]
通过将120μg抗cd20 x cd3 igm-a抗体与1mol/mol sa或21mol/mol sa、60μg cmp nana和20μg st6(igm∶cmp nana∶st6的质量比为6∶3∶1)混合来完成仅唾液酸化。然后将样品在37℃下孵育持续24小时。
[0370]
通过将1μgβ-1，4-半乳糖基转移酶、60μg udp-半乳糖、60μg抗cd20 x cd3 igm-a抗体与1mol/mol sa或21mol/mol sa(igm∶udp-半乳糖∶β-1，4-半乳糖基转移酶的质量比为60∶60∶1)混合来完成半乳糖基化和唾液酸化的组合。将混合物在37℃下孵育持续7小时。然后将30μg cmp nana和1μg st6添加到混合物中，并在37℃下孵育持续20小时。
[0371]
所得唾液酸水平在表11中示出
[0372]
表11：在有或没有半乳糖基化的唾液酸化之后的唾液酸水平
[0373][0374]
本公开的宽度和范围不应限于上述示例性实施方案或实施例中的任一种，而应仅根据所附权利要求及其等效物来界定。
[0375]
表12：本公开中的序列
[0376]
[0377]
[0378]
[0379]
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[0383]
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