一种微孔板的制作方法

1.本实用新型涉及单细胞分离技术领域，具体涉及一种微孔板。


背景技术：

2.在过去的十多年里，高通量测序技术被广泛应用于生物和医学的各种领域，极大促进了相关研究和应用。其中转录测序被广泛应用于测定和描绘各类物种的基因或转录本的表达情况。但传统的转录组测序技术是基于群体细胞，每个样本包含成千上万个细胞，所以最终反映的是基因在群体细胞中平均表达水平，从而掩盖了不同细胞之间的表达异质性。近年来，单细胞转录组测序(技术得到了蓬勃的发展，从而使得可在单细胞水平揭示全基因组范围内所有基因的表达情况，非常有利于研究细胞间的表达异质性。目前单细胞转录组测序技术已经广泛应用于各类物种的不同类型组织和细胞系，包括正常和病变细胞等。自从2009年第一种单细胞转录组测序技术被开发出来，目前已经有几十种不同的单细胞转录组测序技术相继被开发出来，它们都有各自的特点，拥有特定的优势和缺点。
3.进行单细胞测序前，首先需要分离单个细胞，不同类型的单细胞转录组测序技术，使用的细胞分离技术可能不一样。总的来说，目前主要有微吸技术、激光捕获显微切割技术、流式细胞仪技术、微滴技术以及微流体技术。微吸技术和激光捕获显微切割技术主要应用于细胞量较少或者比较珍贵的样品，任何组织都可以采用该技术进行细胞分离，是基于形态或荧光标记可视化进行细胞选择。花费较长的时间。流式细胞仪技术能够分离任何组织较大数量的细胞，根据细胞的大小或荧光标记进行细胞选择，分离速度快。微滴技术可以分离大量细胞，分离速度快，但不能选择细胞。微流体技术能够分离较大量的细胞，不能够进行细胞的选择，但能实现细胞的可视化，可以与流式细胞分离技术结合使用将细胞进行排序。使用微流控技术分选细胞，对细胞来说更加温和且成本低，缺点是需要假定细胞的损失和细胞大小的偏差。


技术实现要素：

4.本实用新型的目的在于提供一种微孔板，并使用该微孔板以解决背景技术中提到的问题。为实现上述目的，本实用新型提供如下技术方案：一种微孔板，包括l1层板，所述l1层板上安装有l2层板，所述l2层板上安装有芯片；
5.所述l1层板包括板材，所述板材为透明长方形结构，左下角含有倒角结构，所述板材的顶部设有锥形凹孔及方形凹陷，所述方形凹陷的内表面设有u形凸台，所述板材的下方设有梯形凸台，所述板材底部沿轮廓设有半圆形凸台；
6.所述l2层板包括板材ⅰ，所述板材ⅰ的顶部设有凸台，所述凸台上开有液体通道凹槽，所述液体通道凹槽的两端分别开有u型甬道进液孔和出液口，所述出液口为锥形凸台结构，所述板材ⅰ中央设有对称u型甬道，所述u型甬道周围分布有五个等大圆孔，所述板材ⅰ的顶部设有注液口，所述u型甬道与u型甬道进液孔和注液口连通，所述注液口沿圆周设有环形凸起，所述环形凸起内部设有气密橡胶塞卡槽，所述气密橡胶塞卡槽内部安装有橡胶气
密垫，所述注液口位置与锥形凹孔对应，所述板材ⅰ的背面通过四棱锥台凸起安装有芯片，所述芯片位于u型甬道、圆孔、u型甬道进液孔和注液口的下方，所述芯片与板材ⅰ的背面密封接触，所述方形凹陷与凸台结构位置对应。
7.优选地，所述u型甬道周围正反面和液体通道凹槽周围均设有线状凸起。
8.优选地，所述板材底部内轮廓内设有梯形加强筋。
9.优选地，所述芯片为透明长方体结构，设有防呆倒角，所述芯片的工作面利用精密铸造技术压印有规则排布的六边形坑洞，所述芯片上压印有与圆孔位置对应的十字形状标记，所述芯片的非工作面为光滑表面，所述六边形坑洞边长为25微米，中心间距为56.3微米，深度为50微米。
10.优选地，所述l1层板和l2层板材质为abs材料，芯片材质为pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)材料。
11.优选地，所述u型甬道表面积为344.5平方毫米，厚度为2mm，所述u型甬道的内壁为坡形，所述l1层板与l2层板装配后，u型甬道对应空腔高度为0.8mm至1mm。
12.本实用新型的技术效果和优点：本实用新型所公布的微孔板可以用于快速以及无损分离细胞；花费时间短；能够分离较低浓度的细胞；高效柔和地分离细胞；可利用荧光成像实时分析细胞数量。
附图说明
13.图1为本实用新型的微孔板结构示意图前侧视图；
14.图2为本实用新型的微孔板结构示意图后侧视图；
15.图3为本实用新型的微孔板的l1层板前侧视图；
16.图4为本实用新型的微孔板的l1层板后侧视图；
17.图5为本实用新型的微孔板的l2层板前侧视图；
18.图6为本实用新型的微孔板的l2层板后侧视图。
19.图中：1、芯片；2、板材；3、倒角结构；4、锥形凹孔；5、方形凹陷；6、u形凸台；7、梯形加强筋；8、板材ⅰ；9、凸台；10、液体通道凹槽；11、u型甬道进液孔；12、出液口；13、u型甬道；14、圆孔；15、注液口；16、环形凸起；17、气密橡胶垫；18、四棱锥台凸起；19、线状凸起；20、梯形凸台；21、半圆形凸台；22、防呆倒角。
具体实施方式
20.为了使本实用新型的实现技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本实用新型，在本实用新型的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接或是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以两个元件内部的连通。
21.实施例
22.如图1-图6所示一种微孔板，包括l1层板，所述l1层板连接l2层板，所述l2层板上安装有芯片1；
23.所述l1层板材质为abs材料丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物)，包括板材2，所述板材
2为透明长方形结构，左下角含有倒角结构3，所述板材2的顶部设有锥形凹孔4及方形凹陷5，方形凹陷5底部与l2层板接触，所述方形凹陷5的内表面设有u形凸台6，所述板材2的下方设有梯形凸台20，梯形凸台20可以匹配实验用仪器上设有的卡扣抓取凸台，固定位置；所述板材1底部沿轮廓设有半圆形凸台21，模具脱模时，脱模顶针通过挤压半圆形凸台21位置将产品脱模；所述板材2底部内轮廓内设有梯形加强筋7，梯形加强筋7可以增强板材抗形变能力；
24.所述l2层板材质为abs材料，黑色四棱锥台结构，包括板材ⅰ8，所述板材ⅰ8的顶部设有凸台9，所述凸台9上开有液体通道凹槽10，所述液体通道凹槽10的两端分别开有u型甬道进液孔11和出液口12，所述出液口12为锥形凸台结构，所述板材ⅰ8中央设有对称u型甬道13，所述u型甬道13表面积为344.5平方毫米，厚度为2mm，所述u型甬道13的内壁为坡形，通过调整模具可以控制u形凸台6高度，u形凸台6嵌入u型甬道13中起定位作用，同时可利用u形凸台6的高度调整u型甬道13形成的空腔高度，达到控制甬道体积的目的，所述l1层板与l2层板装配后，u型甬道13形成的对应空腔高度为0.8mm至1mm；所述u型甬道13周围分布有五个等大圆孔14，所述板材ⅰ8的顶部设有注液口15；所述u型甬道13与u型甬道进液孔11和注液口15连通，液体通道凹槽10可以阻止u型甬道13内液体自流出并阻止空气进入u型甬道13，只有在注液量超过甬道体积时，甬道内液体抬升至高处才可以流出；当空气从出液口12进入时，会停留在凸台9上的液体通道凹槽10内；所述注液口15处沿圆周设有环形凸起16，所述环形凸起16内部设有气密橡胶塞卡槽，所述气密橡胶塞卡槽内部安装有橡胶气密垫17，气密橡胶垫17与锥形凹孔4底部接触，所述板材ⅰ8的背面通过四棱锥台凸起18固定限位有芯片1，所述芯片1位于u型甬道13、圆孔14、u型甬道进液孔11和注液口15的下方；所述u型甬道13周围正反面和液体通道凹槽10周围均设有线状凸起19，使用超声波焊接技术将线状凸起19融化，进行紧密焊接，可实现l1层板与l2层板、l2层板与芯片1的气密效果；所述芯片1与板材ⅰ8的背面密封接触，所述方形凹陷5与凸台9结构位置对应；
25.所述芯片1材质为pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)材料，为高透明长方体结构，设有防呆倒角22，防呆倒角22可以帮助辨认芯片1正反面以及安装方向；所述芯片1的工作面利用精密铸造技术压印有规则排布的六边形坑洞，所述芯片1上压印有与圆孔位置对应的十字形状标记，所述芯片1的非工作面为光滑表面，所述六边形坑洞边长为25微米，中心间距为56.3微米，深度为50微米。
26.一种基于微孔板的单细胞分离工艺，具体包括以下内容：
27.将微孔板安装至工作台上，在出液口12下方放置废液回收缸；实验用仪器通过卡扣抓取凸台抓取l1层板的板材1下方的梯形凸台20，固定位置；
28.用移液枪将buffer从注液口打入冲洗u型甬道13和液体通道凹槽10，浸润芯片1表面；实验时，移液枪枪头扎入橡胶气密垫17中心圆孔，橡胶垫卡槽附近倒角可提供扩充空间，通过手动压力挤压橡胶气密垫17与枪头紧密贴合，同时橡胶垫卡槽孔径可阻止枪头深入接触芯片1表面，实现液密效果并保证试剂可以打入u型甬道13中，不会因为枪头抵住芯片1而无法注液；
29.用移液枪将细胞组织从注液口打入u型甬道13，并等待细胞落进孔内；u型甬道13内壁为坡形，l1层板和l2层板装配后空腔高度约为0.8mm至1mm，细胞和磁珠缓缓下降，落入芯片1表面的六边形坑洞内；液体注入后，u型甬道13通过u型结构利用液体冲刷弯道时产生
的反冲力将细胞组织更均匀铺设于u型甬道13内，减少双细胞率；
30.将微孔板置于扫片机内，通过l1层板的板材1长方形轮廓和左下角含有倒角结构3，匹配实验仪器卡槽形状，仪器运行时，弹舱有勾爪对倒角结构3位置施加推力，将微孔板推至卡槽右上方，进行微孔板方位矫正和锁定；扫片时，仪器通过u型甬道13周围分布的五个等大圆孔14位置观察芯片1上的十字形状标记，仪器通过光学系统观察圆孔内部十字形状标记，并利用显微镜物镜对焦时z轴高度进行芯片1z坐标记录，建立对焦地图，保证高速扫描拍照时的对焦清晰度；
31.对u型甬道13位置进行高速拍照和荧光照射拍照，对落入芯片1六边形坑洞底部的细胞通过观察绿色荧光点数计算细胞活率；此时由于对焦面为六边形坑洞底部，只有落入六边形坑洞内的细胞才可以被清晰观察并被计数，荧光照射时，只有活性细胞才会反射荧光，通过观察绿色荧光点数计算细胞活率；
32.用移液枪将磁珠从注液口15打入u型甬道13，静置3分钟，等待磁珠落入孔内；芯片1表面六边形空洞边长为25微米，中心间距为56.3微米，深度为50微米；作用为捕捉细胞，捕捉磁珠，并作为裂解反应皿容纳rna组织吸附于磁珠。六边形坑洞深度可刚好容纳一个磁珠落入，第二枚磁珠落入时，会高于六边形坑洞边缘，冲洗u型甬道13时，第二颗磁珠不会被六边形坑洞壁阻拦，被顺利冲走，实现一坑一珠；
33.将磁铁置于微孔板下方，将磁珠吸引在六边形坑洞底部，用移液枪将buffer从注液口15打入，冲洗u型甬道13内部，没有沉降于六边形坑洞内的磁珠和落进六边形坑洞的第二颗磁珠被冲走落入废液缸内；将微孔板置于扫片机内，进行扫片，观察和记录磁珠落孔情况；
34.用移液枪将裂解液从注液口15打入u型甬道13，静置2分钟，等待六边形坑洞内细胞裂解；裂解后，细胞rna附着于磁珠上；将微孔板置于扫片机内，进行扫片，观察和记录细胞裂解情况；
35.将磁铁置于微孔板上方，此时磁珠受磁力影响，从六边形坑洞内移出，将收集缸放置于出液口12下方，用移液枪将buffer从注液口15打入，冲洗u型甬道13内部，将磁珠收集于收集缸内；将板材置于扫片机内，进行扫片，观察和记录u型甬道13情况。
36.最后应说明的是：以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已，并不用于限制本实用新型，尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。