卡瓦胡椒素A在制备治疗肺纤维化的药物中的用途的制作方法

卡瓦胡椒素a在制备治疗肺纤维化的药物中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种已知药物的新用途，具体而言，涉及卡瓦胡椒素a或其药学上可接受的盐、前药、水合物或溶剂化物在制备用于预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物中的用途。


背景技术：

2.肺纤维化(pulmonaryfibrosis,pf)是以肺泡持续性损伤、成纤维细胞增殖及大量细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)沉积为特征，从而导致肺泡和肺间质出现不同程度的炎症和纤维化，进而导致肺结构破坏和呼吸衰竭的一种疾病，所以也称间质性肺疾病(interstitial lung disease，ild)或弥漫性实质性肺疾病(diffuse parenchymal lung disease,dpld)。
3.引起肺纤维化的病因包括物理性因素、化学性因素、生物性因素等，还包括病因不明的肺纤维化，如特发性肺纤维化；特发性肺纤维化(ipf)是一种病因不明的慢性进行性肺纤维化疾病，特征是成纤维细胞增殖和细胞外基质重塑，导致肺部结构不可逆转的扭曲。虽然疾病进展是可变的，但进行性纤维化最终导致死亡，诊断后ipf患者的中位生存期仅为3-5年。基于对ipf的体外和体内研究，公认吡非尼酮和尼达尼布两种药物可以减缓这种复杂疾病的进展，然而，这些药物并不能改善肺功能，患者的肺功能通常很差，不能延长患者的生存期，因此，迫切需要探索新的治疗药物。
4.卡瓦胡椒素a(flavokavin a)是从卡瓦胡椒植物中提取的一种主要查尔酮(0.46％)，分子式：c
18h18
o5，分子量：314.33，性状：黄色晶体，其结构如下：
[0005][0006]
卡瓦胡椒(piper methysticum forst)，是胡椒科多年生灌木，它在世界各地都有种植，主要集中在太平洋岛屿。南太平洋岛国的居民喜欢用卡瓦胡椒的根茎制作能放松肌体和情绪、改善睡眠和恢复体力的饮料。卡瓦内酯和查耳酮是这种植物中存在的两种主要植物化学成分。查尔酮衍生自黄酮类化合物，其基本分子结构为由不饱和三碳桥连接的两个芳香环。卡瓦植物中的查尔酮可以通过它们的黄色外观来识别，并被命名为flavokawains，卡瓦胡椒素a(flavokavin a)是其中的一种，对于卡瓦胡椒素a(flavokavin a)的相关研究发现，其主要具有抗肿瘤活性，具体地，flavokawain a可通过bax蛋白依赖和线粒体依赖的凋亡途径诱导细胞凋亡，例如诱导膀胱癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。此外，还有文献报道，卡瓦胡椒素a(flavokavin a)有望成为治疗炎症相关疾病的新型治疗剂。


技术实现要素：

[0007]
发明目的
[0008]
针对目前肺纤维化发病率高，中位生存期短且不可逆，并缺乏有效治疗药物的现状，本发明的目的在于提供卡瓦胡椒素a或其药学上可接受的盐、前药、水合物或溶剂化物在制备用于预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物中的用途。
[0009]
解决方案
[0010]
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0011]
结构如下所示的卡瓦胡椒素a或其药学上可接受的盐、前药、水合物或溶剂化物在制备用于预防和/或治疗肺纤维化疾病的药物中的用途：
[0012][0013]
上述用途中，作为优选，所述肺纤维化疾病为特发性肺纤维化；可选地，所述特发性肺纤维化由博来霉素引起。
[0014]
上述用途中，所述治疗肺纤维化疾病包括以下的一项或多项：(1)改善肺功能；(2)降低肺纤维化程度；(3)减小肺纤维化面积。
[0015]
上述用途中，所述预防和/或治疗肺纤维化通过选自以下的机制来实现：
[0016]
i)抑制cxcl12/cxcr4相关的信号通路，
[0017]
ii)抑制肺成纤维细胞的增殖和迁移，
[0018]
iii)抑制成纤维细胞活化和细胞外基质产生，
[0019]
iv)减弱结缔组织生长因子表达，
[0020]
v)减少胶原蛋白的沉积，和/或
[0021]
vi)抑制α-平滑肌肌动蛋白和纤维粘连蛋白的形成。
[0022]
上述用途中，所述卡瓦胡椒素a的前药为在生物体内能转化成卡瓦胡椒素a的药物。
[0023]
在一些实施方案中，所述卡瓦胡椒素a的药学上可接受的盐为卡瓦胡椒素a的钠盐或钾盐。
[0024]
优选地，所述药物包含预防和/或治疗有效量的卡瓦胡椒素a(flavokavin a)或其药学上可接受的盐、前药、水合物或溶剂化物，或前述任意两项以上的组合，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0025]
优选地，所述药物的给药方式为选自以下的一种或几种：口服、注射、植入、外用、喷雾和/或吸入；
[0026]
优选地，所述药物的剂型为选自以下的一种或几种：注射剂、口服液、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、粉针剂、水针剂、汤剂、酒剂、缓控释制剂、肠溶剂、气雾剂或混悬剂。
[0027]
有益效果
[0028]
本发明的发明人在基于特发性肺纤维化小鼠模型的研究中发现，卡瓦胡椒提取
物——卡瓦胡椒素a可以显著抑制该模型小鼠的肺纤维化，且具有明显的剂量依赖效应，具体表现在：小鼠用力肺活量(fvc)、肺动态顺应性明显增加，同时吸气阻力和呼气阻力都显著降低，这些结果显示卡瓦胡椒素a可有效改善特发性肺纤维化小鼠的肺功能；此外，卡瓦胡椒素a还可在组织水平上影响肺纤维化相关标志物的表达，抑制体内成纤维细胞的增殖和分化，降低肺纤维化程度，缩小肺纤维化面积，抑制肺纤维化发展。
[0029]
进一步地，发明人研究了卡瓦胡椒素a抑制肺纤维化的药理学机制，发现，其可以通过抑制cxcl12/cxcr4相关的jnk信号通路，抑制成纤维细胞活化和ecm产生，降低结缔组织生长因子(ctgf)表达，抑制肺成纤维细胞增殖和迁移，减少胶原蛋白(col-i，或称collagen i)的沉积，抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)和纤维粘连蛋白(fn，或称fibronectin)的形成；以上这些药理学机制为卡瓦胡椒素a在机体内发挥抗肺纤维化效应奠定了基础。
[0030]
上述发现均提示，卡瓦胡椒素a有望成为一种新的治疗肺纤维化的药物，具有很大的临床应用前景和价值。
附图说明
[0031]
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里，专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。在这里，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
[0032]
图1显示不同浓度卡瓦胡椒素a对博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠的肺组织羟脯氨酸水平的影响；其中，横坐标显示了实验组别，其中，nacl表示生理盐水对照组(即，正常对照组)，model表示博来霉素模型组，nintedanib表示尼达尼布药物处理组(即，阳性药物对照组)，fka(15mpk)表示15mg/kg fka药物处理组，fka(30mpk)表示30mg/kg fka药物处理组，fka(60mpk)表示60mg/kg fka药物处理组，并且，纵坐标显示右肺的羟脯氨酸水平(单位为μg/右肺)；其中，*代表p＜0.05，***代表p＜0.001，****代表p＜0.0001。
[0033]
图2显示不同浓度卡瓦胡椒素a对博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠的用力肺活量(fvc，图2a)、肺动态顺应性(图2b)、呼气阻力(图2c)和吸气阻力(图2d)的影响；其中，nacl表示生理盐水对照组(即，正常对照组)，blm表示博来霉素模型组，nintedanib表示尼达尼布药物处理组，fka(15mpk)表示15mg/kg fka药物处理组，fka(30mpk)表示30mg/kg fka药物处理组，fka(60mpk)表示60mg/kg fka药物处理组；其中，*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，***代表p＜0.001，****代表p＜0.0001。
[0034]
图3为通过免疫组织化学分析显示，不同浓度卡瓦胡椒素a对博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠的肺组织中α-sma、col-i和fn蛋白的分布和表达水平的影响；其中，nacl表示生理盐水对照组(即，正常对照组)，blm表示博莱霉素模型组，nintedanib表示尼达尼布药物处理组，fka 15mpk表示15mg/kg fka药物处理组，fka 30mpk表示30mg/kg fka药物处理组，fka 60mpk表示60mg/kg fka药物处理组。
[0035]
图4为通过蛋白免疫印迹法显示，不同浓度卡瓦胡椒素a对博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠的肺组织中α-sma、col-i和fn蛋白表达水平的影响；其中，图4a为各处理组小鼠肺组织中α-sma、col-i和fn蛋白的蛋白免疫印迹结果图，上面显示了各实验组别，从左至右分别为：nacl，表示生理盐水对照组(即，正常对照组)；blm，表示博来霉素模型组；
nintedanib，表示尼达尼布药物处理组；fka 15mpk，表示15mg/kg fka药物处理组；fka 30mpk，表示30mg/kg fka药物处理组；fka 60mpk，表示60mg/kg fka药物处理组；左面显示了所检测的蛋白，从上至下分别为：fn，col-i，α-sma以及作为内参的tubulin；图4b、4c、4d为基于蛋白免疫印迹结果图中各条带相对强度制作的条形统计图，其反映了上述各蛋白的相对表达水平。
[0036]
图5为通过he染色和masson染色显示，不同浓度卡瓦胡椒素a对博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠的肺纤维化面积的影响；其中，nacl表示生理盐水对照组(即，正常对照组)，blm表示博来霉素模型组，nintedanib表示尼达尼布药物处理组，fka 15mpk表示15mg/kg fka药物处理组，fka 30mpk表示30mg/kg fka药物处理组，fka 60mpk表示60mg/kg fka药物处理组；上图为各实验组小鼠肺部的he染色结果，下图为各实验组小鼠肺部的masson染色结果。
[0037]
图6为条形统计图，显示了根据图5的各实验组小鼠的肺部染色结果统计的肺纤维化百分比。
[0038]
图7为通过sds-page&银染法显示，卡瓦胡椒素a与cxcl12共孵育后，cxcl12单体和二聚体的含量变化，即，cxcl12二聚体减少，单体增加；其中，左图为sds-page&银染结果图，根据分子量大小，上面的条带表示cxcl12二聚体，下面的条带表示cxcl12单体；右图为基于左图中的条带灰度制作的柱形图，其横坐标为组别，纵坐标为条带灰度，三个柱形图分别反映了cxcl12二聚体的含量、cxcl12单体的含量以及cxcl12二聚体与cxcl12单体含量的比值。
[0039]
图8为通过蛋白免疫印迹法显示，不同浓度卡瓦胡椒素a处理cxcl12诱导下的小鼠肺成纤维细胞(mlg细胞)后，细胞中胶原蛋白(col-i)、α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)和纤维粘连蛋白(fn)的表达水平变化；其中，上面显示了各实验组别，从左至右分别为：无cxcl12诱导 无fka处理组，仅cxcl12(10ng/ml)诱导组，cxcl12(10ng/ml)诱导 1μm fka处理组，cxcl12(10ng/ml)诱导 2μm fka处理组，cxcl12(10ng/ml)诱导 4μm fka处理组；左面显示了所检测的蛋白，从上至下分别为：col-1，fn，α-sma以及作为内参的tubulin。
[0040]
图9为通过细胞划痕法显示，不同浓度卡瓦胡椒素a处理cxcl12诱导下的小鼠肺成纤维细胞(mlg细胞)后，细胞迁移能力的变化；其中，上面显示了各实验组别，从左至右分别为：control，代表无cxcl12诱导 无fka处理组；cxcl12，代表仅cxcl12(10ng/ml)诱导组；fka(1μm) cxcl12，代表cxcl12(10ng/ml)诱导 1μm fka处理组；fka(2μm) cxcl12，代表cxcl12(10ng/ml)诱导 2μm fka处理组；fka(4μm) cxcl12，代表cxcl12(10ng/ml)诱导 4μm fka处理组；其中，图9a显示各实验组在0h、12h、24h时划痕两端的细胞间距，图9b为各实验组的时间-细胞迁移率曲线。
[0041]
图10为通过蛋白免疫印迹法显示，不同浓度卡瓦胡椒素a处理cxcl12诱导下的小鼠肺成纤维细胞(mlg细胞)后，细胞中相关下游信号通路蛋白表达水平的变化；其中，上面显示了各实验组别，从左至右分别为：无cxcl12诱导 无fka处理组，仅cxcl12(10ng/ml)诱导组，cxcl12(10ng/ml)诱导 1μm fka处理组，cxcl12(10ng/ml)诱导 2μm fka处理组，cxcl12(10ng/ml)诱导 4μm fka处理组；左面显示了所检测的蛋白，从上至下分别为：jnk，磷酸化jnk，c-jun，磷酸化c-jun，ctgf，α-sma以及作为内参的tubulin。
具体实施方式
[0042]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0043]
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
[0044]
本发明所使用的试剂、试剂盒、原料和设备等，如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得。本发明中所涉及的实验或检测方法，如无特殊说明，均为本领域常规的实验或检测方法，或参照相应的试剂盒或产品说明书进行。
[0045]
以下，对本发明的实施例进行详述。
[0046]
主要试剂来源：
[0047]
卡瓦胡椒素a购自medchemexpress e,货号：3420-72-2；
[0048]
博来霉素购自nippon kayaku(日本东京)；
[0049]
小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
[0050]
抗tubulin、α-sma、col-i、fn、jnk、p-jnk、c-jun、p-c-jun、ctgf蛋白的单克隆抗体购自affinity(usa)；
[0051]
cxcl12蛋白购自sino biological，货号：50025-mnae；
[0052]
小鼠肺成纤维细胞(mlg细胞)购自上海晶抗生物工程有限公司。
[0053]
实施例1：卡瓦胡椒素a对博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠的肺纤维化的抑制效应
[0054]
1、动物模型制备：
[0055]
用博来霉素进行特发性肺炎造模是目前使用最多的特发性肺纤维化模型。
[0056]
实验小鼠为雄性c57bl/6j野生型小鼠(周龄7-8周)；以质量体积浓度为10％的水合氯醛按0.5ml/100g(体重)给予小鼠腹腔注射麻醉，气管内有创注射2u/kg博来霉素。具体实施方式如下：麻醉小鼠后称重记录，将小鼠固定于操作台，颈部用70％酒精消毒，用手术刀在小鼠颈部垂直划开大约1cm长创口，利用显微镊分离组织暴露气管，将注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，然后按2u/kg的剂量缓慢注入与其体重相适应体积的博来霉素生理盐水溶液，立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。
[0057]
2、实验分组情况：
[0058]
共分为5组，分别是：生理盐水(即，nacl)对照组、博来霉素模型组、阳性药物(即，尼达尼布/nintedanib)对照组、卡瓦胡椒素a低剂量(15mg/kg)处理组、卡瓦胡椒素a中剂量(30mg/kg)处理组和卡瓦胡椒素a高剂量(60mg/kg)处理组，每组5只小鼠。
[0059]
3、小鼠分组给药情况：
[0060]
生理盐水组：给小鼠气管内有创注射生理盐水(0.9％nacl溶液)，并且，在其后第
7-14天，每天腹腔注射与卡瓦胡椒素a处理组小鼠用药相同体积的生理盐水(0.9％nacl溶液)，作为空白对照；
[0061]
博来霉素模型组、阳性药物对照组、卡瓦胡椒素a低剂量处理组、卡瓦胡椒素a中剂量处理组、卡瓦胡椒素a高剂量处理组中的小鼠均采用气管内有创注射2u/kg博来霉素的方法进行造模；其中：卡瓦胡椒素a低剂量处理组、卡瓦胡椒素a中剂量处理组、卡瓦胡椒素a高剂量处理组是在博来霉素处理第7-14天时，每天通过腹腔注射给予小鼠15mg/kg/d(低剂量组)、30mg/kg/d(中剂量组)、60mg/kg/d(高剂量组)的卡瓦胡椒素a溶液；博来霉素模型组小鼠每天腹腔注射与卡瓦胡椒素a处理组小鼠用药相同体积的生理盐水(0.9％nacl溶液)，作为药物处理阴性对照；阳性药物对照组小鼠每天灌胃给予与卡瓦胡椒素a处理组小鼠用药相同体积的100mg/kg/d尼达尼布，作为药物处理阳性对照。
[0062]
4、检测方法
[0063]
4.1羟脯氨酸含量测定
[0064]
羟脯氨酸含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标，因此，本实施例通过测定小鼠肺组织的羟脯氨酸含量，来检测其肺胶原含量及肺纤维化程度。
[0065]
具体地，在博来霉素注射第14天处死小鼠，分离小鼠右肺，放入5ml安培瓶，置于120℃烘箱中烘干，在盐酸作用下水解后调整ph至7.0，过滤残渣，加入pbs调整总体积为10ml，取50μl样品，加入350μl去离子水，加入200μl氯胺t(chloramine t)溶液室温孵育20分钟，加入200μl高氯酸(perchloric acid)室温孵育5分钟，加入200μl对二甲氨基苯甲醛(p-dmab)65℃孵育20分钟。取200μl所得溶液至96孔板中，测定样品于562nm的吸光值，利用标准品读数绘制标准曲线，进而根据标准曲线所得公式求得所测样品羟脯氨酸浓度cs。按以下公式换算为全部右肺所含羟脯氨酸的量w:w＝cs
×
8(所测样品稀释倍数)
×
样品总体积。
[0066]
4.2肺功能检测
[0067]
使用anires2005动物肺功能分析系统评价肺功能，设置小鼠测定时所需的各种参数(负压值:21cm水柱高度；呼吸频率：90次/分钟；呼吸比：20：10；潮气量：5ml/kg)，并在测定前检查系统运行是否正常。
[0068]
在博来霉素注射第14天时，通过腹腔注射10％水合氯醛(0.5ml/100g)麻醉小鼠，取仰卧位将小鼠固定于操作台，剪开颈部皮毛，暴露气管，并钝性分离气管，于气管近头部处剪一切口，将插管的气管接头处插入气管，并用棉线固定，转移小鼠至体描仪平台，连接呼吸机与气管接头，记录小鼠的肺功能指标参数，包括用力肺活量(fvc)、吸气气道阻力(inspiratory resistance)、呼气气道阻力(expiratory resistance)和肺动态顺应性(dynamic compliance)。
[0069]
4.3免疫组化法检测肺纤维化标志物(α-sma、col-i和fn蛋白)在肺组织切片中的分布定位和表达量变化
[0070]
将组织切片于二甲苯中脱蜡，然后进行梯度乙醇脱水(无水乙醇，95％乙醇)，与3％h2o2孵化15min以阻断内源性过氧化物酶活性；之后，进行抗原修复，具体地，采用柠檬酸缓冲盐水(ph值6.0)或专用的edta抗原修复工作液，在小功率电炉上加热，至似沸微沸；室温下自然冷却后取出切片，蒸馏水洗3次，1次3min，血清室温(25℃)下封闭20min；然后与相应的抗体(即，α-sma、col-i或fn蛋白的抗体)在4℃湿盒中孵育过夜；第二天，用蒸馏水洗3
次，每次3min，然后加入二抗增强剂孵育30min，再加入相应种属二抗孵育30min，然后用dab和苏木精分别进行染色，后进入下行系统，即梯度乙醇，后二甲苯，封片待观察评分，进行统计学分析。
[0071]
4.4蛋白免疫印迹检测肺纤维化标志物(α-sma、col-i和fn蛋白)在肺组织中的表达
[0072]
提取各实验组小鼠的肺组织蛋白，并通过western-blot分析蛋白；具体地，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析全胞裂解液，将其转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜(意大利米兰)上，用5％无脂牛奶封膜，然后与抗tubulin、α-sma、col-i或fn蛋白的单克隆抗体在4℃下孵育过夜；之后，将膜与相应二抗进一步孵育(亲和力，1:10000)；最后，将膜置于电泳凝胶成像系统(chemiscope 6000,clix，上海，中国)进行成像分析。
[0073]
4.5苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，he)、马松(masson)三色染色法检测肺纤维化面积
[0074]
将组织切片于二甲苯中脱蜡，然后进行梯度乙醇脱水(无水乙醇，95％乙醇)，然后用苏木精—伊红、马松三色染色，后进入下行系统，即梯度乙醇，后二甲苯，封片待观察评分，进行统计学分析。该过程使用德国leica全自动组织染色机，进行自动化he染色和masson染色。
[0075]
5、检测结果
[0076]
5.1)羟脯氨酸含量测定结果如图1所示，由图1可见，与博来霉素模型组相比，卡瓦胡椒素a处理组的羟脯氨酸含量显著降低，并且这种降低具有剂量依赖性，这表明：卡瓦胡椒素a对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺纤维化具有显著的抑制作用，并且这种抑制作用具有明显的剂量依赖性。
[0077]
5.2)肺功能检测结果如图2所示，图2显示：与博来霉素模型组相比，卡瓦胡椒素a处理后的小鼠用力肺活量(fvc，图2a)、肺动态顺应性(图2b)明显增加，而呼气阻力(图2c)和吸气阻力(图2d)均显著降低，并且这种增加或降低均具有明显的剂量依赖性；这些结果表明：卡瓦胡椒素a能够有效改善小鼠的肺功能，缓解肺纤维化。
[0078]
5.3)肺组织的免疫组化结果如图3所示，图3显示：与博来霉素模型组相比，卡瓦胡椒素a处理可以明显降低小鼠肺组织中肺纤维化标志物α-sma、col-i和fn蛋白的表达，这表明：卡瓦胡椒素a可显著抑制体内成纤维细胞的增殖和分化，从而改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。
[0079]
5.4)蛋白免疫印迹结果如图4所示，图4显示：与博来霉素模型(blm)组相比，卡瓦胡椒素a处理可显著降低小鼠肺组织中α-sma(见卡瓦胡椒素a高剂量组)和col-i蛋白(见卡瓦胡椒素a低、中、高剂量组)的表达，这表明：卡瓦胡椒素a可显著抑制体内成纤维细胞的增殖和分化，从而改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。
[0080]
5.5)苏木精—伊红染色、马松三色染色结果如图5、图6所示，由图5、图6可知，卡瓦胡椒素a显著降低了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化程度，缩小了肺纤维化面积，并且这种效应具有明显的剂量依赖性。
[0081]
实施例2：卡瓦胡椒素a可抑制cxcl12蛋白二聚化
[0082]
本实施例中，通过sds-page及银染法，研究了卡瓦胡椒素a与cxcl12的相互作用方式。
[0083]
具体地，取45μl 4μm的卡瓦胡椒素a的pbs溶液(母液是用dmso溶解的，要保证稀释完的终浓度中dmso的含量不超过5％)与5μl 1μg/μl的cxcl12蛋白溶液，将它们在96孔板中混合，对照组不加卡瓦胡椒素a，37℃下200rpm振荡孵育4小时，然后取出混合液，加入100
×
dss,室温孵育交联30分钟，再加入tris(20mm)终止交联15分钟，加入loading煮样10分钟，然后进行sds-page凝胶电泳，电泳结束后，将page胶转移到干净的玻璃皿中，用固定液固定过夜，然后用30％乙醇洗涤10分钟，水洗涤10分钟，加入银染增敏剂增敏2分钟，用水洗涤两次，每次1分钟，然后加入银溶液银染10分钟，用水洗涤1分钟，然后加入银染显色液直至出现比较理想的预期蛋白条带，弃去银染显色液，加入银染终止液10分钟，用水洗涤3分钟，然后放在milli-q级纯水中保存，最后采用凝胶成像系统进行成像分析。
[0084]
结果如图7所示；图7显示：卡瓦胡椒素a与cxcl12共孵育后，cxcl12蛋白的二聚体含量明显减少，其单体含量明显增加，二聚体与单体的比例明显减少，由此可以看出：卡瓦胡椒素a可抑制cxcl12蛋白二聚化；由于cxcl12/cxcr4信号通路与肺纤维化密切相关，因此推测，卡瓦胡椒素a可能通过抑制cxcl12蛋白二聚化，继而抑制cxcl12/cxcr4信号通路的活化，进而抑制下游jnk/c-jun/ctgf通路信号转导，抑制成纤维细胞活化和胶原沉积，从而有效抑制肺纤维化。
[0085]
实施例3：卡瓦胡椒素a对cxcl12诱导的肺成纤维细胞活化及胶原沉积的影响
[0086]
本实施例中，通过western blot分析，检测了卡瓦胡椒素a对cxcl12诱导的肺成纤维细胞活化和胶原沉积的影响。
[0087]
具体地，按如下进行实验分组及处理：
[0088]
control组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基；
[0089]
cxcl12诱导组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基，在提取细胞总蛋白之前加10ng/ml cxcl12处理2h；
[0090]
cxcl12诱导 1μm卡瓦胡椒素a处理组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基，继续培养24h后，换成含有1μm卡瓦胡椒素a的1
‰
胎牛血清的dmem培养基，在提取细胞总蛋白之前加10ng/ml cxcl12处理2h；
[0091]
cxcl12诱导 2μm卡瓦胡椒素a处理组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基，继续培养24h后，换成含有2μm卡瓦胡椒素a的1
‰
胎牛血清的dmem培养基，在提取细胞总蛋白之前加10ng/ml cxcl12处理2h；
[0092]
cxcl12诱导 4μm卡瓦胡椒素a处理组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基，继续培养24h后，换成含4μm卡瓦胡椒素a的1
‰
胎牛血清的dmem培养基，在提取细胞总蛋白之前加10ng/ml cxcl12处理2h；
[0093]
然后，从以上各实验组的培养细胞中提取细胞总蛋白，并通过western blot分析有关蛋白的表达水平。具体地，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析细胞总蛋白，将电泳后的条带转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜(意大利米兰)上，然后用5％无脂牛
奶封膜，之后与抗tublin、α-sma、col-i或fn单克隆抗体在4℃下孵育过夜；将膜与相应的二抗进一步孵育(亲和力，1:10000)。最后，将膜置于电泳凝胶成像系统(chemiscope 6000,clix，上海，中国)进行成像分析。
[0094]
结果如图8所示；图8显示：经卡瓦胡椒素a处理后，cxcl12诱导下的mlg细胞中的胶原蛋白(col-i)、α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)和纤维粘连蛋白(fn)的表达下降，且随着卡瓦胡椒素a的浓度增加，其下降趋势更加明显；这些结果表明，卡瓦胡椒素a可以靶向cxcl12蛋白，并对其诱导下的col-i、α-sma、fn蛋白的表达具有抑制效应，且这种抑制效应具有剂量依赖性；即，卡瓦胡椒素a减少了胶原蛋白(col-i)沉积、α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)和纤维粘连蛋白(fn)的形成，抑制了成纤维细胞活化和ecm产生，从而有效地减弱了纤维化程度。
[0095]
实施例4：细胞划痕法检测卡瓦胡椒素a对肺成纤维细胞迁移能力的影响
[0096]
本实施例中，通过细胞划痕法，检测了卡瓦胡椒素a在体外对小鼠肺成纤维细胞迁移能力的影响。
[0097]
具体地，按如下进行实验分组及处理：
[0098]
control组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞汇合度约为100％的时候，使用无菌的白枪头尖端贴近皿底部在中间划竖线用于分析，pbs洗净，换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基培养；
[0099]
cxcl12诱导组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞汇合度约为100％的时候，使用无菌的白枪头尖端贴近皿底部在中间划竖线用于分析，pbs洗净，换成含10ng/ml cxcl12的1
‰
胎牛血清的dmem培养基；
[0100]
cxcl12诱导 1μm卡瓦胡椒素a处理组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞汇合度约为100％的时候，使用无菌的白枪头尖端贴近皿底部在中间划竖线用于分析，pbs洗净，将培养基换成含有10ng/ml cxcl12和1μm卡瓦胡椒素a的1
‰
胎牛血清的dmem培养基；
[0101]
cxcl12诱导 2μm卡瓦胡椒素a处理组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞汇合度约为100％的时候，使用无菌的白枪头尖端贴近皿底部在中间划竖线用于分析，pbs洗净，将培养基换成含有10ng/ml cxcl12和2μm卡瓦胡椒素a的1
‰
胎牛血清的dmem培养基；
[0102]
cxcl12诱导 4μm卡瓦胡椒素a处理组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞汇合度约为100％的时候，使用无菌的白枪头尖端贴近皿底部在中间划竖线用于分析，pbs洗净，将培养基换成含有10ng/ml cxcl12和4μm卡瓦胡椒素a的1
‰
胎牛血清的dmem培养基；
[0103]
将以上各实验组的细胞分别接种于35mm的培养皿中培养单层细胞至100％，使用无菌枪头尖端制100μm划痕空白区，弃液，1
×
pbs洗2次，分别加入浓度为1、2、4μm卡瓦胡椒素a细胞培养液，并设置不加药物的对照孔，置于37℃、5％co2培养箱中培养24h，于0h、12h和24h时，放在光学显微镜上于固定位置取样，拍照，记录划痕两端细胞间距的变化。
[0104]
计算各时间点的细胞间距相对于0h细胞间距(即，划痕宽度)的比值(ratio to 0h)，为s
xh
/s
0h
；用excel软件绘制细胞间距相对于0h细胞间距的比值vs时间的曲线，各数值指标均用均值
±
标准差来表示。
[0105]
结果如图9所示；图9显示，卡瓦胡椒素a对cxcl12诱导下的mlg细胞的迁移能力具有抑制作用，即，卡瓦胡椒素a可以靶向作用于cxcl12，从而对肺成纤维细胞的迁移具有抑制作用。
[0106]
实施例5：卡瓦胡椒素a对cxcl12诱导的肺成纤维细胞中cxcl12/cxcr4通路蛋白表
达情况的影响
[0107]
本实施例中，通过western blot分析，检测了卡瓦胡椒素a对cxcl12诱导的肺成纤维细胞中cxcl12/cxcr4通路蛋白表达情况的影响。
[0108]
具体地，按如下进行实验分组及处理：
[0109]
control组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基；
[0110]
cxcl12诱导组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基，在提取细胞总蛋白之前加10ng/ml cxcl12处理2h；
[0111]
cxcl12诱导 1μm卡瓦胡椒素a处理组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基，继续培养24h后，换成含有1μm卡瓦胡椒素a的1
‰
胎牛血清的dmem培养基，在提取细胞总蛋白之前加10ng/ml cxcl12处理2h；
[0112]
cxcl12诱导 2μm卡瓦胡椒素a处理组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基，继续培养24h后，换成含有2μm卡瓦胡椒素a的1
‰
胎牛血清的dmem培养基，在提取细胞总蛋白之前加10ng/ml cxcl12处理2h；
[0113]
cxcl12诱导 4μm卡瓦胡椒素a处理组：用含10％胎牛血清的dmem进行培养，等细胞长到汇合度约为80-90％的时候，将培养基换成含1
‰
胎牛血清的dmem培养基，继续培养24h后，换成含有4μm卡瓦胡椒素a的1
‰
胎牛血清的dmem培养基，在提取细胞总蛋白之前加10ng/ml cxcl12处理2h；
[0114]
然后，从以上各实验组的培养细胞中提取细胞总蛋白，并通过western blot分析有关蛋白的表达水平。具体地，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析细胞总蛋白，将电泳后的条带转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜(意大利米兰)上，然后用5％无脂牛奶封膜，之后与抗tublin、jnk、p-jnk、c-jun、p-c-jun、ctgf或α-sma单克隆抗体在4℃下孵育过夜；将膜与相应的二抗进一步孵育(亲和力，1:10000)。最后，将膜置于电泳凝胶成像系统(chemiscope 6000,clix，上海，中国)进行成像分析。
[0115]
结果如图10所示；图10显示：经卡瓦胡椒素a处理后，cxcl12诱导下的mlg细胞中的jnk和c-jun蛋白的磷酸化水平下降，ctgf和α-sma蛋白表达减弱，且随着卡瓦胡椒素a的浓度增加，上述下降或减弱趋势更加明显；这些结果表明，卡瓦胡椒素a可以靶向cxcl12蛋白，并影响cxcl12/cxcr4信号通路，包括，抑制下游jnk的磷酸化，进而抑制c-jun的磷酸化，减弱ctgf的过表达，从而抑制肺成纤维细胞归巢到肺部，并且抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)的形成，从而抑制肺纤维化的发展。
[0116]
综上所述，卡瓦胡椒素a对肺成纤维细胞的分化、迁移均具有显著的抑制作用，并可通过cxcl12/cxcr4相关jnk信号通路，抑制jnk和c-jun的磷酸化，减弱ctgf表达，抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)的形成，抑制肺纤维化的发展，因此有望作为肺纤维化的候选治疗药物，具有巨大的临床价值。
[0117]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可
以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。