包含抑制PHF20的制剂的用于预防或治疗因肌肉减少引起的疾病的组合物的制作方法

包含抑制phf20的制剂的用于预防或治疗因肌肉减少引起的疾病的组合物
技术领域
1.本发明涉及phf20(phd指蛋白20(phd finger protein 20))在肌肉分化机制中的功能，更详细地，涉及phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂的用途。


背景技术：

2.骨骼肌的质量占人体体重的40％至50％，是人体中质量最大的组织。骨骼肌的发达需要包括肌源性谱系保证(myogenic lineage commitment)、成肌细胞的增殖及末端分化在内的基质。肌生成(myogenesis)的过程起到信号传导级联反应的末端效应的作用，通过适当的发达步骤-特异性转录体来调节。分化步骤通过包括myod(成肌分化蛋白标志物(myogenic differentiation marker))家族、mef2(肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor-2))家族及其他转录因子在内的肌肉-特异性转录因子的复杂的网络来控制。
3.因肌肉的减少引起的肌肉减少症(sarcopenia)主要因老化引起的肌肉减少而发生。现在，不仅是韩国，老龄化已逐渐成为全世界范围内的重要问题，因此，肌肉减少正成为整个社会日益关注的问题。美国在2016年10月在世界卫生组织(who)中为老年性肌肉减少症赋予了疾病编码(m62.84)正是这个问题的反映。但至今没有获得认可的治疗剂，相比于其他疾病，正在开发中的药物也少的多。尤其，以肌肉生长抑制素-激活素-卵泡抑制素(myostatin-activin-follistatin)系统及雄激素受体(androgen receptor)为靶向的大部分药物要么因治疗效果不大，要么因具有致命的副作用而受限，因此需要开发肌肉减少症的治疗药物。


技术实现要素：

4.技术问题
5.因此，本发明人通过查明phf20在肌肉分化中的机制来完成了本发明。
6.本发明的目的在于，提供包含phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂作为有效成分的用于预防或治疗因肌肉减少引起的疾病的药物组合物。
7.本发明的再一目的在于，提供用于预防或治疗因肌肉减少引起的疾病的药物组合物，包含phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂；或者yy1启动子活性抑制剂。
8.本发明的还有一目的在于，提供包含phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂作为有效成分的用于增大肌肉或阻碍肌肉损失的组合物。
9.本发明的另一目的在于，提供因肌肉减少引起的疾病的治疗方法，包括向有需要的个体处理phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂的步骤。
10.技术方案
11.为了上述目的，本发明提供包含phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂作为有效成分用于预防或治疗因肌肉减少引起的疾病的药物组合物。
12.并且，本发明提供用于预防或治疗因肌肉减少引起的疾病的药物组合物，包含
phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂；或者yy1启动子活性抑制剂。
13.并且，本发明提供包含phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂作为有效成分的用于增大肌肉或阻碍肌肉损失的保健功能食品组合物。
14.并且，本发明提供包含phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂作为有效成分的用于增大肌肉或阻碍肌肉损失的饲料添加剂组合物。
15.并且，本发明提供因肌肉减少引起的疾病的治疗方法，包括向有需要的个体处理phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂的步骤。
16.发明的效果
17.本发明的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂在实验室内(in vitro)及活体内(in vivo)促进肌肉的分化，可以用于因肌肉减少引起的疾病的预防、改善或治疗等多个领域。
附图说明
18.图1为示出通过实时定量逆转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)在c2c
12
细胞的肌肉分化期间确认phf20的表达结果的图(pre，前肌细胞(premyocyte)；d1-d5，根据分化天数的细胞)。
19.图2为示出通过蛋白印迹法在c2c
12
细胞的肌肉分化期间确认phf20及myod的表达结果的图。
20.图3为示出通过实时定量逆转录聚合酶链式反应在c2c
12
细胞的肌肉分化期间确认yy1的表达结果的图。
21.图4为示出通过蛋白印迹法在c2c
12
细胞的肌肉分化期间确认yy1及myod的表达结果的图。
22.图5为示出确认phf20的表达给c2c
12
细胞的分化带来的影响的结果的图(-doxy，未处理多西环素的细胞； doxy，处理多西环素的细胞)。更详细地，图5的a部分为根据是否在c2c
12
细胞中处理多西环素来分析phf20、yy1及myod的蛋白表达的结果。并且，图5的b部分为根据是否在c2c
12
细胞中处理多西环素来分析phf20、yy1及myod的信使核糖核酸(mrna)的表达的结果。
23.图6为示出通过免疫组织化学染色分析来确认phf20的表达给肌管形成带来的影响的结果的图。
24.图7为示出通过蛋白印迹法确认抑制phf20的表达给yy1及myod的表达带来的影响的结果的图。更详细地，图7的a部分为分化前的c2c
12
细胞(pre)的结果，图7的b部分为分化1天后的肌纤维的结果。
25.图8的a部分为示出通过蛋白印迹法确认根据多西环素的处理浓度的phf20的结果(上部图案)及通过荧光素酶报告基因分析确认根据上述phf20的表达的yy1启动子的活性的结果(下部图案)的图。
26.图8的b部分为示出通过蛋白印迹法确认根据短发夹核糖核酸(shrna)转染的phf20的表达的结果(上部图案)及通过荧光素酶报告基因分析确认根据上述phf20的表达的yy1启动子的活性的结果(下部图案)的图。
27.图9的a部分为示出在未处理多西环素的c2c
12
细胞中根据分化期间确认yy1启动子
的活性(上部图案)及phf2、yy1及myod的表达(下部图案)的图。
28.图9的b部分为示出在处理多西环素的c2c
12
细胞中根据分化期间确认yy1启动子的活性(上部图案)及phf2、yy1及myod的表达(下部图案)的图。
29.图10为示出通过染色质免疫共沉淀分析来确认phf20调节yy1启动子的方式的结果的图。
30.图11为通过蛋白印迹法在c2c
12
细胞(pre)及分化3天的细胞中确认yy1的表达给myod的表达带来的影响的结果的图。
31.图12为示出通过免疫组织化学染色分析在分化1天的c2c
12
细胞中确认yy1的表达给肌管形成带来的影响的结果的图。
32.图13为示出通过蛋白印迹法在phf20转基因小鼠中确认phf20、yy1及mhc的表达的结果的图(wt，对照组；phf20-tg，phf20转基因小鼠)。
33.图14的a部分为测量phf20转基因小鼠的体重的结果。
34.图14的b部分为示出观察phf20转基因小鼠的大腿肌肉的结果的图。
35.图15为示出通过组织学分析观察phf20转基因小鼠的腓肠肌组织的结果的图。更详细地，图15的a部分为观察上述腓肠肌组织的横剖面的结果，图15的b部分为观察纵剖面的结果。
36.图16为示出通过组织学分析观察转基因小鼠的腓肠肌组织的横剖面的结果的图。
37.图17为示出通过免疫组织化学染色分析观察phf20转基因小鼠的腓肠肌组织的结果的图。更详细地，图17的a部分为观察上述腓肠肌组织的纵剖面的结果，图17的b部分为观察横剖面的结果。
38.图18为示出phf20的表达影响肌肉分化的机制的图。
具体实施方式
39.以下，详细说明本发明。
40.根据本发明的实施方式，本发明提供包含phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂作为有效成分的用于预防或治疗因肌肉减少引起的疾病的药物组合物。
41.并且，本发明提供因肌肉减少引起的疾病的治疗方法，包括向有需要的个体处理phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂的步骤。
42.在本发明中，phf20(植物同源结构域指蛋白20(plant homeodomain finger protein 20，phd finger protein 20))为使组蛋白h4乙酰化的赖氨酸乙酰转移酶复合物(lysine acetyltransferase complex)的多重结构域蛋白及亚基。phf20为转录因子，最早在神经胶质瘤患者中确认。phf20基因敲除小鼠在出生后即死亡，在骨骼及造血系统内出现多种表达型。在phf20基因敲除小鼠中的这些表达型的详细基质尚无报告。
43.在本发明的实施例中，确认到上述phf20在肌肉分化中通过如图18所示的机制影响肌肉分化。更详细地，phf20的表达抑制在实验室内(in vitro)及活体内(in vivo)中通过分离结合于yy1启动子的phf20来增加myod的表达，上述myod的表达增加促进肌肉分化。
44.在本发明的具体例中，优选地，上述phf20基因表达抑制剂为yy1启动子活性抑制剂。
45.在本发明的具体例中，上述phf20基因表达抑制剂可以通过增加myod的表达来促
进肌肉的分化。
46.在本发明中，yy1(yin yang 1)是指通过4个c-末端锌指结构域与脱氧核糖核酸(dna)结合的转录抑制蛋白。在骨骼肌中，作为mtor(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin))的抑制剂的雷帕霉素的治疗是通过增加线粒体转录调节蛋白(mitochondrial transcriptional regulator)基因的表达来减少线粒体基因的表达及氧的消耗。在c2c
12
成肌细胞中，mtor磷酸化及作为其下游的靶标的yy1及pgc-1α(过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha))通过fgf21(成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21))的处理得到增加。在成肌细胞中，通过fgf21激活的mtor-yy1-pgc1α通道调节通过细胞内三磷酸腺苷(atp)合成、氧消耗率、柠檬酸合酶(citrate synthase)的活性、糖分解、线粒体脱氧核糖核酸复制数及主要能量的表达的增加来表现出的能量恒常性。
47.在本发明的具体例中，优选地，上述因肌肉减少引起的疾病选自由肌肉减少症、弛缓症(atony)、肌肉萎缩(muscular atrophy)、肌营养不良症(muscular dystrophy)、肌肉退化、肌强直营养不良症(myotonic dystrophy)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、肌无力(myasthenia)及恶病质(cachexia)组成的组中，但不限定于此。
48.在本发明中，预防是指通过给药本发明的药物组合物来抑制或延迟的因肌肉减少引起的疾病的发病的所有行为。并且，在本发明中，治疗是指通过给药本发明的药物组合物来使因肌肉减少引起的疾病的症状好转或变更为痊愈的所有行为。
49.在本发明的具体例中，上述phf20基因表达抑制剂可以为选自由与phf20基因互补性结合的短发夹核糖核酸、小干扰核糖核酸(sirna)、核酶及反义核苷酸组成的组中的一种以上。
50.在本发明的优选具体例中，上述phf20基因表达抑制剂可以为由序列1的碱基序列表示的短发夹核糖核酸，并且，由序列1表示的碱基序列的变异体也包括在本发明的范围内。本发明的由序列1表示的短发夹核糖核酸的功能性等价物为包括例如通过缺失(deletion)、取代(substitution)或插入(insertion)变更由序列1表示的序列中的一部分，但在功能上能够起到与序列1的碱基序列形成的短发夹核糖核酸相同的作用的变异体(variants)在内的概念。
51.具体地，短发夹核糖核酸可以包含各个与序列1的碱基序列具有70％以上的序列同源性的序列，更优选地，可以包含与序列1的碱基序列具有80％以上的序列同源性的序列，更加优选地，可以包含与序列1的碱基序列具有90％以上的序列同源性的序列，最优选地，可以包含与序列1的碱基序列具有95％以上的序列同源性的序列。有关多核苷酸或氨基酸的“序列同源性的百分率(％)”通过比较两个最优排列的序列与比较区域来确认。
52.上述小干扰核糖核酸由从phf20基因的信使核糖核酸的碱基序列内选择的15单体单元(mer)至30单体单元的正义链及与上述正义链互补性结合的反义链构成，在此情况下，上述正义链不受特别限制。
53.在本发明的具体例中，上述phf20蛋白活性抑制剂可以为选自由与phf20蛋白特异性结合的化合物、肽及抗体组成的组中的一种以上。
54.上述化合物包括所有能够与phf20蛋白特异性结合来抑制其活性的任意化合物。
55.上述抗体可以与phf20蛋白特异且直接地结合来有效抑制phf20蛋白的活性。优选地，可以使用多克隆(polyclonal)抗体或单克隆(monoclonal)抗体作为与上述phf20蛋白特异性结合的抗体，上述抗体可以由本发明所属技术领域的普通技术人员通过公知的方法制备，也可以购买商业上已知的抗体来使用。
56.本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的添加剂，在此情况下，药学上可接受的添加剂可以使用淀粉、糊化淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、麦芽糖、阿拉伯胶、预糊化淀粉、玉米淀粉、粉末纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、淀粉乙醇酸钠、巴西棕榈蜡、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、白糖等。优选地，相对于上述组合物，可以包含0.1重量份至90重量份的本发明的药学上可接受的添加剂，但不限定于此。
57.并且，本发明的药物组合物在实际的临床给药中可以通过口服或胃肠外给药的多种剂型来给药，在配制时可以使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备，优选地，使用本发明所属技术领域中公知的适当的制剂。可以包含于上述组合物中的载体、赋形剂及稀释剂有乳糖、葡萄糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。
58.上述用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂混合一种以上的赋形剂，例如，混合淀粉、碳酸钙、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等来制备。并且，除单纯的赋形剂以外，还可以是用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。并且，上述用于口服给药的液体制剂有悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，除广为使用的作为单纯稀释剂的水、液体石蜡以外，还可以包含多种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。
59.上述用于胃肠外给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、油剂、冷冻干燥制剂、栓剂。非水溶剂、悬浮溶剂可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油之类的植物油、油酸乙酯之类的可注射的酯类等。栓剂的基剂可以使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、肉实树酯、甘油明胶等。上述胃肠外给药可以通过皮肤外用或腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉注射、肌肉内注射或胸腔内注射等注入方式来实现。
60.本发明的药物组合物的给药量的范围根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、代谢率及疾病的严重程度而多种多样，一天可以给药一次，也可以分为数次给药。
61.本发明的药物组合物可以通过多种途径向个体给药。
62.本发明的药物组合物可以为预防或治疗因肌肉减少引起的疾病而单独使用，或者可以与手术、放射性治疗、激素治疗、化学治疗及使用生物学反应调节剂的方法等联合使用。
63.根据本发明的再一实施方式，本发明提供用于预防或治疗因肌肉减少引起的疾病的药物组合物，包含：phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂；或者yy1启动子活性抑制剂。
64.在本发明的具体例中，上述yy1启动子活性抑制剂可以为小干扰核糖核酸，优选
地，可以为由序列2的碱基序列表示的小干扰核糖核酸。
65.根据本发明的还有一实施方式，本发明提供包含phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂作为有效成分的用于增大肌肉或阻碍肌肉损失的组合物。
66.优选地，上述组合物为保健功能食品组合物或饲料添加剂组合物，但不限定于此。
67.在本发明中，饲料添加剂是指为营养或特定目的而向饲料中微量添加的物质。
68.在上述用于增大肌肉或阻碍肌肉损失的组合物为保健功能食品组合物的情况下，可以单独添加phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂，或者与其他食品或食品成分一同使用，可以根据通常的方法适当地使用。有效成分的混合量可以根据使用目的(预防、保健或治疗性处置)来适当地决定。通常，在制备食品或饮料时，相对于全部组合物，可以添加15重量百分比以下的本发明的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂，优选地，可以添加10重量百分比以下的量。但在以保健及卫生为目的，或者以健康调节为目的而长期摄取的情况下，可以为上述范围以下，因安全性方面毫无问题，因此也能够以上述范围以上的量使用有效成分。
69.上述保健功能食品的种类不受特别限制。上述保健功能食品的例有糖果类、小食品类、口香糖类、饮料、茶、饮剂、酒精饮料及维生素复合剂等，在通常的意义上可以包括所有保健功能食品。
70.在上述用于增大肌肉或阻碍肌肉损失的组合物为饲料添加剂组合物的情况下，本发明的饲料添加剂组合物与饲料原料适当地配合来提供饲料，上述饲料原料可以使用谷物类、糟糠类、植物油粕类、动物性饲料原料、其他饲料原料、熟物等，但不限定于此。
71.以下，通过实施例更为详细地说明本发明。但本发明所属技术领域的普通技术人员应该自明的是，这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围不限定于这些实施例。
72.实验材料
73.从cell signaling technology公司(贝弗利，马萨诸塞州，(beverly，ma))购入抗phf20抗体。从sigma aldrich公司(圣路易斯，美国(st.louis，usa))获得抗β肌动蛋白抗体。从santa cruz biotechnology公司(圣克鲁兹，加利福尼亚州(santa cruz，ca))购入抗yy1、抗myod及抗肌球蛋白重链抗体。从艾奥瓦州立大学的dshb获得抗肌球蛋白(mf20)抗体。从koma biotech公司(首尔，韩国(seoul，korea))获得结合有辣根过氧化物酶(hrp)的抗小鼠、抗兔及抗山羊免疫球蛋白g(igg)抗体。从panomics公司(加利福尼亚州，美国(california,usa))购入pyy-荧光素酶。从promega公司(麦迪逊，美国(madison，usa))购入荧光素酶检测系统试剂盒(luciferase assay system kit)。从clontech公司(takara bio公司，美国)获得tet-on高级诱导基因表达系统试剂盒(tet-on advanced inducible gene expression system kit)。
74.实验例1.细胞培养
75.1-1.c2c
12
细胞的培养及分化
76.在37℃及5％co2的条件下使用杜氏改良伊戈尔培养基(dmem)培养作为前肌细胞的c2c
12
细胞。上述dmem(welgene公司，庆山，韩国(gyeongsan，korea))包含10％的胎牛血清(fbs，fetal bovine serum)(hyclone公司，洛根，美国(logan，usa))及1％的抗生素-抗真菌剂(antibiotic-antimycotic)(gibco公司，底特律，美国(detroit，usa))。
77.为了细胞分化，将培养基更换为分化培养基(differentiation medium，dm)后进
行培养，培养基每2天更换一次。上述分化培养基包含2％的马血清(horse serum)及1％的抗生素-抗真菌剂(gibco公司，底特律，美国)。上述细胞分化从更换培养基24小时后开始。
78.1-2.c2c
12
/tet-on诱导性phf20细胞
79.利用c2c
12
细胞制备c2c
12
/tet-on诱导性phf20细胞。具体地，为了制备c2c
12-tet3g成肌细胞，向c2c
12
细胞处理慢病毒-tet3g后，使用g418(1.2mg/ml)进行选择来获得c2c
12-tet3g成肌细胞。使用plvx-tre3g-phf20暂时转染上述c2c
12-tet3g细胞。使用嘌呤霉素(3μg/ml)在暂时转染的细胞中选择tet-on诱导性phf20细胞。在包含多西环素(doxycycline，doxy)的培养基中培养选出细胞(c2c
12
/tet-on诱导性phf20细胞)的情况下，诱导phf20的表达。
80.为了在后述的实验中从c2c
12
细胞中诱导phf20的表达，使用包含100ng/ml浓度的多西环素的培养基进行培养。
81.实验例2.蛋白印迹法
82.将准备好的细胞放在冰上，向上述细胞处理裂解缓冲液裂解细胞来制备细胞裂解物。上述裂解缓冲液包含50mm的tris-hcl(ph7.5)、1％(v/v)的乙基苯基聚乙二醇(nonidet p-40)、120mm的nacl、25mm的氟化钠(sodium fluoride)、40mm的β磷酸盐(βphosphate)、0.1mm的正钒酸钠(sodium orthovanadate)、1mm的苯甲基磺酸氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)、1mm的苯甲脒(benzamidine)及2μm的微囊藻毒素-lr(microcystin-lr)。以13000rpm的转速离心分离细胞裂解物30分钟来获得蛋白质。通过利用10.0％至7.5％的凝胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)展开上述蛋白质。将展开的蛋白质移到immobilon-p膜(millipore公司)。然后，使用包含5％的脱脂牛奶及0.2％的吐温-20(tween-20)的1x的tbs缓冲液(tri-buffered saline buffer；140mm的nacl、2.7mm的kcl、250mm的tris hcl，ph7.4)处理膜来封闭1小时。使用稀释为1000倍的对各蛋白质的一抗处理后在4℃的温度下培养过夜。反应后，使用tbs缓冲液洗涤膜。使用稀释为2000倍的抗体(结合有辣根过氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白g(horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse igg)或抗兔免疫球蛋白g(anti-rabbit igg)(komabiotech公司，首尔，韩国(seoul，korea)))处理洗涤的膜后进行培养。培养后使用tbs缓冲液洗涤膜，根据生产公司的说明书检测蛋白质。
83.实验例3.实时定量逆转录聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qrt-pcr)
84.将c2c
12
/tet-on诱导性phf20细胞接种于6孔培养板后培养24小时。为了诱导phf20的表达，使用多西环素处理上述c2c
12
/tet-on诱导性phf20细胞。处理多西环素的第二天，使用quickgene rna kit(fujifilm's life science system公司，东京，日本(tokyo，japan))从细胞中提取总核糖核酸(rna)。并且，使用suprimescript rt premix(genet bio公司，天安，韩国(cheonan，korea))通过总核糖核酸合成互补脱氧核糖核酸(cdna)。cdna扩增通过prime q-mastermix(genet bio公司，天安，韩国)及cfx96t real-time system(bio-rad公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚，美国(hercules，ca，usa))进行互补脱氧核糖核酸的扩增。各互补脱氧核糖核酸的实时定量逆转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)分析是通过sybr绿染料及stepone plus实时聚合酶链式反应系统(invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(carlsbad，ca))来检测双螺旋脱氧核糖核酸(duplex dna)的形成的。
85.本实验所使用的引物如表1所示。
86.表1
[0087][0088]
实验例4.通过免疫组织化学染色分析检测肌球蛋白重链(myosin heavy chain，mhc)
[0089]
将c2c
12
/tet-on诱导性phf20细胞以1
×
105cells/well的浓度接种于包括灭菌的盖玻片的12孔培养板，在37℃及5％co2的条件下进行培养。在未使用多西环素处理细胞的情况下培养24小时的为多西环素未处理组(-doxy)，使用包含多西霉素的培养基更换培养基后培养24小时的为多西环素处理组( doxy)。使用分化培养基更换培养的各细胞的培养基后，培养1天(d1)或3天(d3)来进行分化。然后使用37℃的磷酸盐缓冲溶液(pbs)洗涤细胞。在4％的多聚甲醛中培养洗涤的细胞15分钟来固定于盖玻片，然后使用磷酸盐缓冲溶液洗涤两次。为了封闭，在盖玻片处理1％的牛血清白蛋白(bsa，bovine serum albumin)后在室温下振荡培养1小时。并且，以1∶200的比例稀释抗肌球蛋白(anti-myosin)(mf-20)抗体后向细胞加入，在4℃的温度下振荡培养过夜。振荡培养后使用磷酸盐缓冲液洗涤盖玻片三次。加入异硫氰酸荧光素(fitc)二抗(1∶1000)(在5％的脱脂牛奶中(in 5％skim milk))后在室温的暗室里振荡培养6小时。振荡培养后使用磷酸盐缓冲液洗涤盖玻片三次。使用包含4',6-二脒基-2-苯基吲哚抗荧光衰减剂(dapi vectashield)(圣路易斯，美国)的封片剂替换洗涤的薄片的培养基后，与切片结合来分析荧光。
[0090]
实验例5.荧光素酶报告基因分析
[0091]
将c2c
12
/tet-on诱导性phf20细胞以3
×
105cells/ml的浓度接种于6孔培养板。按
照生产公司的说明书向接种的细胞转染1μg的包含yy1-荧光素酶的质粒。24小时后，在使用中使用转染的细胞。
[0092]
向转染的细胞处理报告裂解缓冲液来使细胞裂解。上述报告裂解缓冲液包含25mm的三磷酸(tris-phosphate)、2mm的二硫苏糖醇(dtt)、2mm的反式-1,2-环己二胺-n,n,n',n'-四乙酸(trans-1,2-cyclohexanediamine-n,n,n',n'-tetraacetic acid)、10％(v/v)的甘油(glycerol)及1％(v/v)的聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)。向20μg的细胞裂解物加入荧光素酶测定底物(luciferase assay substrate)(promega公司)并培养后，利用光度计(luminometer)(duo lumat lb 9507)测量发光10秒钟来来检测荧光素酶的活性。
[0093]
实验例6.染色质免疫共沉淀(chromatin-immunoprecipitation，chip)分析
[0094]
根据生产公司的说明书(upstate biotechnology公司，普莱西德湖，纽约州，美国(lake placid，ny，usa))进行染色质免疫共沉淀分析。具体地，使c2c
12
细胞分化3天后，使用甲醛处理7.5分钟。然后，使用包含蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞两次后，移到冰上。向冰上的细处理sds-裂解缓冲液后培养10分钟后，获得裂解液。上述裂解缓冲液包含50mm的tris-hcl(ph 8.0)、1％的sds、10mm的乙二胺四乙酸(edta)、1mm的苯甲基磺酰氟(pmsf)、1μg/ml的抑肽酶(aprotinin)及2μg/ml的为蛋白酶抑制剂(pepstatin)。使用一抗或对照组的免疫球蛋白g处理上述获得的裂解物后，在4℃的温度下培养过夜。然后，将培养物与30μl的蛋白a磁珠(包含500μg/ml的牛血清白蛋白及200μg/ml的三文鱼精子脱氧核糖核酸)一同在4℃的温度下培养3小时。使用qid快速聚合酶链式反应纯化试剂盒(qia quick pcr purification kit(qiagen公司，希尔登，德国(hilden，germany)))纯化培养后的脱氧核糖核酸试样，通过实时定量逆转录聚合酶链式反应进行定量。实时定量逆转录聚合酶链式反应的结果由输入值的百分率来表示。在本实验中使用的作为启动子特异性引物的小鼠(mouse)yy1(-200/-55)的序列如下。
[0095]-小鼠yy1(-200/-55)：5'-cgctgccttcctccctct-3'(正向，序列12)，5'-cgtccgtggcgatgtaga-3'(反向，序列13)。
[0096]
实验例7.制备phf20转基因小鼠
[0097]
为了制备phf20转基因小鼠，在pcdna3载体的巨细胞病毒(cmv)启动子的下游亚克隆(subcloning)编码人类phf20的互补脱氧核糖核酸，使用上述载体转化wt c57bl/6小鼠。对照组利用wt c57bl/6小鼠，以wt表示。在12h/12h长周期、湿度为50％至60％及周边温度为22℃的环境中饲育小鼠phf20-tg及wt。并且，所有动物实验都是根据机构指南在动物设施中进行的。实验协议得到了忠南大学(cnu-00890)审查委员会的认可。
[0098]
实验例8.组织学分析及免疫组织化学染色分析
[0099]
使用10％的福尔马林溶液处理从小鼠中采取的肌肉后，在4℃的温度下培养过夜并固定。将固定的肌肉试样包埋在石蜡块中。切割石蜡块准备为5μm厚度的薄片。还准备相邻部位的薄片，按照顺序准备切片。
[0100]
为了进行普通的形态学分析，使用苏木精及伊红(hematoxylin及eosin，h&e)染色。
[0101]
并且，为了免疫组织化学染色分析，使用二甲苯使切片上的薄片脱石蜡化，使用乙醇进行再水化。然后，将切片浸泡在过氧化物酶淬灭溶液(peroxidase quenching solution)中反应10分钟。反应后，使用磷酸盐缓冲溶液洗涤切片5分钟两次，为了封闭，向
切片滴入两滴试剂a后培养30分钟。培养后使用磷酸盐缓冲溶液洗涤切片两次。使用一抗(anti-mhc)处理洗涤的切片后，在4℃的温度下培养过夜。使用磷酸盐缓冲溶液洗涤培养的切片后使用生物素化(biotinylated)的二抗试剂b进行处理后，在室温下培养1小时。使用磷酸盐缓冲溶液洗涤培养的切片后，向切片滴入结合有酶的试剂c后，使用磷酸盐缓冲溶液洗涤。使用磷酸盐缓冲溶液洗涤后，向切片滴入dab发色剂以及试剂d1、试剂d2及试剂d3的混合物，使用荧光显微镜观察信号。然后，使用蒸馏水终止反应后，使用荧光显微镜拍摄切片照片。
[0102]
实验例9.统计学分析
[0103]
数据以平均值
±
标准误(s.e.)来表示。使用学生t检验分析至少三次实验中的组间差异，将p《0.05视为在统计学上具有显著性。并且，结果的定量分析使用image j软件(1.47版本)。
[0104]
实施例1.分析肌肉分化期间的yy1及phf20的表达
[0105]
为了在肌肉分化中评估phf20的变化，通过实时定量逆转录聚合酶链式反应及蛋白印迹法分析肌肉分化中的yy1、phf20信使核糖核酸及蛋白质的表达。
[0106]
1-1.phf20
[0107]
在接种c2c
12
细胞24小时后，更换包含2％的马血清的分化培养基来诱导肌肉分化。在肌肉分化期间，每天通过实时定量逆转录聚合酶链式反应检测细胞的phf20信使核糖核酸的表达。并且，在上述肌肉分化期间，每天通过蛋白印迹法确认phf20及myod的蛋白质表达。分析phf20信使核糖核酸及蛋白质表达的结果分别如图1及图2所示。
[0108]
如图1及图2所示，确认到随着肌肉分化的进行，phf20的信使核糖核酸及蛋白质的表达逐渐减少。相反，确认到随着肌肉分化的进行，myod的蛋白质的表达逐渐增加。上述结果可以暗示在c2c
12
细胞中作为转录因子的phf20与肌肉分化有关。
[0109]
1-2.yy1
[0110]
通过现有的研究确认，在phf20过度表达的细胞中，yy1的表达增加。于是，以与上述实施例1-1相同的方法分析了yy1的信使核糖核酸及蛋白质表达。分析yy1的信使核糖核酸及蛋白质表达的结果分别如图3及图4所示。
[0111]
如图3及图4所示，确认到随着肌肉分化的进行，yy1的信使核糖核酸的表达逐渐减少。并且，确认到随着肌肉分化的进行，myod的蛋白质表达逐渐增加，但yy1的蛋白质表达却逐渐减少。
[0112]
实施例2.确认phf20的表达给c2c
12
细胞的分化带来的影响
[0113]
还评估了phf20的表达给肌肉分化带来的影响。
[0114]
2-1.phf20的表达给myod蛋白质表达带来的影响
[0115]
准备c2c
12
细胞(pre)后，分为多西环素未处理组(-doxy)及处理组( doxy)。然后，多西环素未处理组(-doxy)为在未向准备的细胞处理多西环素的情况下培养24小时的组，多西环素处理组( doxy)为更换包含多西环素的培养基后培养准备的细胞24小时的组。在实验中使用未处理或处理多西环素的c2c
12
细胞，以pre表示。
[0116]
为了制备分化的肌纤维(d1、d3及d5)，使用分化培养基更换上述处理或未处理多西环素的c2c
12
细胞的培养基后进行培养。根据分化的天数将培养的细胞分别表示为d1、d3及d5。
[0117]
向准备好的细胞处理裂解缓冲液来制备各细胞裂解物，通过蛋白印迹法分析phf20、yy1及myod的蛋白质表达。分析phf20、yy1及myod的蛋白质表达的结果如图5的a部分所示。
[0118]
如图5的a部分所示，在肌肉分化期间，作为对照组多西环素未处理组(左侧图案)表现出phf20及yy1的蛋白质表达减少，myod的表达增加的倾向。相反，确认到多西环素处理组(右侧图案)的phf20的表达被诱导，myod的表达比对照组低。
[0119]
2-2.phf20的表达给myod信使核糖核酸的表达带来的影响
[0120]
提取上述实施例2-1的处理( doxy)或未处理(-doxy)多西环素处理的c2c
12
细胞(pre)及分化的肌纤维(d5)的总核糖核酸后，通过实时定量逆转录聚合酶链式反应分析phf20、yy1及myod的信使核糖核酸的表达。分析上述信使核糖核酸的表达的结果如图5的b部分所示。
[0121]
如图5的b部分所示，确认到在肌肉分化期间，phf20、yy1及myod的表达表现出与蛋白质表达相同的倾向性，即，诱导phf20表达的细胞的myod的表达减少。
[0122]
2-3.phf20的表达给肌管形成带来的影响
[0123]
为了确认phf20给肌管(myotube)形成带来的影响，通过免疫组织化学染色分析来确认肌球蛋白重链的表达。具体地，准备处理( doxy)或未处理(-doxy)多西环素的c2c
12
细胞(pre)及分化的肌纤维(d1及d3)。利用准备好的细胞，使用抗mf抗体(绿色)进行免疫组织化学染色分析。肌球蛋白重链被抗mf抗体染色而呈绿色，细胞核被4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，dapi)染色而呈蓝色。免疫组织化学染色分析结果如图6所示。
[0124]
如图6所示，确认到通过多西环素诱导phf20的表达的细胞( doxy，d1及d3)在肌肉分化期间抑制肌管形成。相反，确认到在作为对照组的多西环素未处理组(-doxy，d1及d3)中，c2c
12
细胞分化为肌管。
[0125]
2-4.phf20的表达抑制给myod的表达带来的影响
[0126]
确认了phf20的表达抑制给myod的表达带来的影响。为此准备了c2c
12
细胞(pre)及分化的肌纤维(d1)。向准备好的细胞转染表达由序列1的碱基序列表示的与phf20序列相关的短发夹核糖核酸(shphf20)的慢病毒。对照组使用由序列3的碱基序列表示的与加扰序列有关的短发夹核糖核酸。培养转染的细胞24小时。培养后裂解细胞，使用细胞裂解物进行蛋白印迹法。分化前的c2c
12
细胞(pre)的结果如图7的a部分所示，分化的肌纤维(d1)的结果如图7的b部分所示。
[0127]
如图7所示，在分化前的c2c
12
细胞(pre)中，通过短发夹核糖核酸的phf20的表达抑制诱导了yy1的表达抑制，引起myod表达的增加。确认到在分化1天的肌纤维(d1)中上述现象更为突出。
[0128]
实施例3.phf20的表达给yy1启动子的表达带来的影响
[0129]
通过上述实施例1及实施例2确认到，在肌肉分化期间，phf20的表达增加使yy1的表达增加，使myod的表达减少。于是，通过yy1启动子分析来追加评估phf20的表达给肌肉分化带来的影响。
[0130]
3-1.确认根据多西环素的处理浓度的phf20及yy1启动子的表达
[0131]
确认了根据多西环素的处理浓度的phf20及yy1启动子的表达。向c2c
12
细胞(pre)
转染yy1-荧光素酶基因。向转染的细胞处理不同浓度(0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml及500ng/ml)的多西环素后培养24小时。培养后对c2c
12
细胞实施蛋白印迹法及荧光素酶报告基因分析。上述蛋白印迹法用于确认phf20的表达，荧光素酶报告基因分析用于确认yy1启动子的活性。蛋白印迹法结果及荧光素酶报告基因分析结果如图8的a部分所示。
[0132]
如图8的a部分所示，多西环素诱导phf20的表达，但确认到上述phf20的表达依赖于多西环素的浓度。并且，确认到yy1启动子的活性依赖于phf20的表达量。
[0133]
3-2.确认短发夹核糖核酸转染的phf20及yy1启动子的表达
[0134]
确认了根据短发夹核糖核酸转染的phf20及yy1启动子的表达。具体地，准备c2c
12
细胞(pre)，向准备好的细胞转染表达与加扰序列(shrna)或phf20序列(shphf20)相关的短发夹核糖核酸的慢病毒。培养转染的细胞24小时后，追加转染yy1-荧光素酶基因。然后裂解细胞，使用细胞裂解物进行蛋白印迹法及荧光素酶报告基因分析，结果如图8的b部分所示。
[0135]
如图8的b部分所示，确认到因短发夹核糖核酸引起的phf20表达的减少抑制yy1启动子的活性。这意味着phf20在转录体的水平上正比例地调节前肌细胞的yy1的表达。
[0136]
3-3.确认根据肌肉分化期间的phf20及yy1启动子的表达
[0137]
分析了根据肌肉分化期间的phf20的表达抑制给yy1启动子的表达带来的影响。使用作为前肌细胞的c2c
12
细胞进行用于上述分析的yy1启动子分析。具体地，在分化培养基中培养未处理多西环素的c2c
12
细胞(pre)来分化，在各分化时间点(d1及d3)转染yy1-荧光素酶基因。通过蛋白印迹法分析转染的细胞的phf2、yy1及myod的表达。并且，通过荧光素酶报告基因分析确认yy1启动子的活性。利用处理多西环素的c2c
12
细胞(pre)，以与上述相同的方法进行实验。利用未处理上述多西环素的c2c
12
细胞的实验结果如图9的a部分所示，利用处理多西环素的c2c
12
细胞的实验结果如图9的b部分所示。
[0138]
如图9的a部分所示，随着c2c
12
细胞的肌肉分化的进行，phf20及yy1的表达随yy1启动子活性的减少而减少，而myod的表达增加。
[0139]
如图9的b部分所示，确认到在肌肉分化期间，通过多西环素诱导的phf20的表达诱导yy1启动子的活性，因此，myod的表达减少。
[0140]
上述结果意味着phf20的表达量在通过yy1及yy1启动子的肌肉分化调节中很重要。
[0141]
3-4.确认通过phf20的yy1启动子的调节方式
[0142]
通过染色质免疫共沉淀分析确认phf20以何种方式调节yy1启动子。上述染色质免疫共沉淀分析利用c2c
12
细胞(pre)及分化的肌纤维(d1及d3)，使用引物小鼠yy1(-200/-55)。使用免疫球蛋白g作为对照组。染色质免疫共沉淀分析结果如图10所示。
[0143]
如图10所示，在肌肉分化期间，c2c
12
细胞中phf20与yy1启动子(-200/-55)的结合减少。上述结果暗示phf20作为用于调节肌肉分化的转录因子，直接与yy1启动子结合。
[0144]
实施例4.yy1的表达给myod的表达带来的影响
[0145]
通过上述实施例3确认到phf20直接调节yy1。因此在本实施例中确认yy1启动子的表达给作为下游基因的myod带来的影响。
[0146]
4-1.蛋白印迹法
[0147]
为了确认yy1启动子的表达给作为下游基因的myod带来的影响，准备处理( doxy)或未处理(-doxy)多西环素(100ng/ml)的c2c
12
细胞(pre)。使用分化培养基培养上述c2c
12
细
胞来分化为肌肉。在分化的第三天(d3)转染小干扰核糖核酸或小干扰yy1(siyy1)(序列2)后培养24小时。培养后制备细胞裂解物，通过蛋白印迹法分析phf20、yy1及myod的表达。利用处理( doxy)或未处理(-doxy)多西环素(100ng/ml)的c2c
12
细胞(pre)作为对照组。蛋白印迹法的结果如图11所示。
[0148]
如图11所示，phf20的过度表达在c2c
12
细胞(pre)中诱导myod表达的减少，在分化的第三天(d3)，不仅诱导肌肉分化，还在前肌细胞中诱导yy1的表达(各条件的前两条线)。并且，通过短发夹核糖核酸的yy1表达的抑制使myod的表达增加(各条件的最后两条线)。
[0149]
4-2.免疫组织化学染色分析
[0150]
为了确认yy1给肌管形成带来的影响，通过免疫组织化学染色分析确认了肌球蛋白重链的表达。具体地，准备处理( doxy)或未处理(-doxy)多西环素的分化的肌纤维(d1)。向准备好的细胞转染小干扰核糖核酸或siyy1后培养24小时。利用培养的细胞，进行使用抗肌球蛋白(mf20)抗体的免疫组织化学染色分析。肌球蛋白重链被抗肌球蛋白(mf20)抗体染色而呈绿色，细胞核被4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色而呈蓝色。免疫组织化学染色分析结果如图12所示。
[0151]
如图12所示，确认到通过短发夹核糖核酸的yy1的表达减少促进肌管形成( siyy1、-doxy)。相反，确认到在通过多西环素诱导phf20的表达的情况下，肌管形成被抑制(-siyy1、 doxy)。尤其确认到，即使phf20过度表达，当yy1的表达被抑制时，恢复分化( siyy1、 doxy)。上述结果意味着phf20通过yy1调节myod之类的分化调节因子。
[0152]
实施例5.在phf20转基因小鼠中确认phf20表达给肌肉的分化带来的影响
[0153]
5-1.在phf20转基因小鼠中的phf20、yy1及mhc表达的分析及表现型确认
[0154]
从phf20转基因小鼠中分离骨骼肌组织。裂解分离的骨骼肌组织来制备细胞裂解物。制备上述细胞裂解物后，通过蛋白印迹法分析phf20、yy1及肌球蛋白重链(myosin heavy chain，mhc)的表达。上述肌球蛋白重链作为肌肉的分化标志物，表达随着分化的进行而增加。对照组使用5月龄的雄性wt小鼠。蛋白印迹法的结果如图13所示。
[0155]
如图13所示，与对照组(wt)相比，phf20转基因小鼠的phf20及yy1的表达显著增加。但确认到与对照组相比，上述phf20转基因小鼠的作为肌肉分化标志物的肌球蛋白重链的表达减少。
[0156]
为了接下来的实验，在安乐死phf20转基因小鼠之前测量体重。然后，解剖phf转基因小鼠后观察大腿肌肉及肌肉。phf20转基因小鼠的体重测量结果如图14的a部分所示，观察大腿肌肉的结果如图14的b部分所示。
[0157]
如图14的a部分所示，确认到与对照组(wt)相比，phf20转基因小鼠的体重显著增加。
[0158]
如图14的b部分所示，确认到与对照组(wt)相比，解剖的phf20转基因小鼠的肌肉颜色浅，这意味着肌肉比对照组少，脂肪堆积量多。
[0159]
通过上述结果可知phf20转基因小鼠的体重增加是因脂肪堆积引起的。
[0160]
5-2.组织学分析及免疫组织化学染色分析
[0161]
以横向(cross section)或纵向(longitudinal section)切割phf20转基因小鼠(phf20-tg)及对照组(wt)的腓肠肌(gastrocnemius)组织来制备切片。
[0162]
使用苏木精及伊红(h&e)染色上述制备的横向或纵向切片的组织。观察腓肠肌组
织的横剖面的结果如图15的a部分所示，观察纵剖面的结果如图15的b部分所示。
[0163]
如图15的a部分所示，确认到与对照组相比，phf20转基因小鼠的肌纤维少。并且，确认到与对照组相比，phf20转基因小鼠的肌纤维更圆，肌纤维之间具有多个空的空间(白色)。
[0164]
如图15的b部分所示，观察肌肉的纵剖面的结果，确认到与对照组相比，phf20转基因小鼠的肌纤维压缩更轻，这意味着肌肉的完全性低。
[0165]
并且，追加观察上述苏木精及伊红染色的横剖面切片，结果如图16所示。
[0166]
如图16所示，对照组(wt)的肌肉之间几乎没有脂肪组织，相反，在phf20转基因小鼠的肌肉之间观察到脂肪组织。
[0167]
通过免疫组织化学染色分析观察上述制备的横向或纵向切片的非常及组织。观察腓肠肌组织的纵剖面的结果如图17的a部分所示，观察横剖面的结果如图17的b部分所示。
[0168]
如图17的a部分所示，确认到与对照组(wt)相比，phf20转基因小鼠的肌纤维少，长度短。并且，确认到与对照组(wt)相比，phf20转基因小鼠的mhc的表达减少。
[0169]
如图17的b部分所示，与对照组(wt)相比，在phf20转基因小鼠的肌纤维之间发现空的空间，这意味着肌纤维的压缩程度低。
[0170]
通过上述结果确认phf20在活体内给肌肉的发达带来不良影响。
[0171]
综上所述，通过上述实验结果确认phf20的表达通过如图18所示的机制给肌肉分化带来影响。更详细地，确认到敲除phf20基因，即，phf20的表达抑制在实验室内及活体内通过分离与yy1启动子结合的phf20来增加myod的表达，上述myod的表达增加促进肌肉分化。这表明phf20抑制剂可以在因肌肉减少引起的疾病的预防或治疗领域使用。
[0172]
以下，通过制剂例更详细地说明本发明。但这些制剂例仅用于例示本发明，本发明的范围不应解释为限定于这些制剂例。
[0173]
制剂例1.制备药物组合物
[0174]
1-1.制备散剂
[0175]
20μg的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂
[0176]
100mg的乳糖
[0177]
10mg的滑石
[0178]
混合上述成分后填充进密封袋中制备散剂。
[0179]
1-2.制备片剂
[0180]
20μg的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂
[0181]
100mg的玉米淀粉
[0182]
100mg的乳糖
[0183]
2mg的硬脂酸镁
[0184]
混合上述成分后根据通常的片剂制备方法压片来制备片剂。
[0185]
1-3.制备胶囊剂
[0186]
20μg的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂
[0187]
3mg的结晶纤维素
[0188]
14.8mg的乳糖
[0189]
0.2mg的硬脂酸镁
[0190]
根据通常的胶囊剂制备方法混合上述成分后填充进明胶胶囊来制备胶囊剂。
[0191]
1-4.制备注射剂
[0192]
10μg的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂
[0193]
180mg的甘露醇
[0194]
2974mg的注射用灭菌蒸馏水
[0195]
26mg的二水合磷酸二钠
[0196]
根据通常的注射剂制备方法以每安碚瓶(2ml)为上述成分含量的方式制备。
[0197]
1-5.制备液剂
[0198]
10μg的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂
[0199]
10g的异构糖
[0200]
5g的甘露醇
[0201]
适量纯水
[0202]
根据通常的液剂制备方法，将各成分加入纯水并溶解后，加入适量柠檬香后，混合上述成分后加入纯水来将总量调节为100ml后放入褐色瓶中灭菌来制备液剂。
[0203]
制剂例2.制备食品制剂
[0204]
2-1.制备保健食品
[0205]
10μg的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂
[0206]
适量维生素混合物
[0207]
70g的维生素a醋酸酯
[0208]
1.0mg的维生素e
[0209]
0.13mg的维生素b
[0210]
0.15mg的维生素b2
[0211]
0.5mg的维生素b6
[0212]
0.2g的维生素b12
[0213]
10mg的维生素c
[0214]
10g的生物素
[0215]
1.7mg的烟酰胺
[0216]
50g的叶酸
[0217]
0.5mg的泛酸钙
[0218]
适量无机物混合物
[0219]
1.75mg的硫酸亚铁
[0220]
0.82mg的氧化锌
[0221]
25.3mg的碳酸镁
[0222]
15mg的磷酸二氢钾
[0223]
55mg的磷酸二钙
[0224]
90mg的柠檬酸钾
[0225]
100mg的碳酸钙
[0226]
24.8mg的氯化镁
[0227]
上述维生素及矿物质混合物的组合比是以较为适合保健食品的优选实施例来混
合组成的，但其配制比可以任意变更来实施，根据通常的保健食品制备方法混合上述成分后，制备为颗粒，然后可以根据通常的方法用于制备保健食品。
[0228]
2-2.制备保健饮料
[0229]
10μg的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂
[0230]
15g的维生素c
[0231]
100g的维生素e(粉末)
[0232]
19.75g的乳酸铁
[0233]
3.5g的氧化锌
[0234]
3.5g的烟酰胺
[0235]
0.2g的维生素a
[0236]
0.25g的维生素b1
[0237]
0.3g的维生素b2
[0238]
适量的水
[0239]
根据通常的保健饮料制备方法混合上述成分后，在85℃的温度下搅拌加热约1小时后，将制备的溶液过滤后放入灭菌的2l的容器中密封灭菌后，冷藏保管后用于制备本发明的保健饮料组合物。
[0240]
上述组合比为将比较适合喜好饮料的成分混合组成为优选实施例，但可以根据所需受众、所需国家、使用用途等地区性、民族性偏好度任意改变配制比来实施。
[0241]
制剂例3.制备饲料添加剂
[0242]
2.0％的phf20基因表达抑制剂或phf20蛋白活性抑制剂
[0243]
2.0％的葡萄糖
[0244]
1.0％的蛋白胨
[0245]
1.0％的酵母提取物
[0246]
0.2％的第二磷酸
[0247]
0.05％的硫酸镁
[0248]
0.05％的半胱氨酸
[0249]
剩余量(to 100％)的纯水
[0250]
适量的赋形剂脱脂米糠
[0251]
以上，详细记述了本发明内容的特定部分，但本发明所属技术领域的普通技术人员应该明白的是，这些具体记述仅为优选的实施方式，而不是要以这些内容限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围应通过随附的发明要求保护范围及其等价物来定义。