一种具有护眼功能的石斛组合物的制作方法

1.本发明属于功能食品开发技术领域，具体涉及一种具有护眼功能的石斛组合物。
技术背景
2.石斛，兰科石斛属多年生草本植物，味甘，性微寒，归胃、肾经，益胃生津，滋阴清热，用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，目暗不明，筋骨痿软。石斛是我国传统的养生珍品，现代药理研究证明石斛具有降血糖、降血脂、抗氧化、调节人体免疫力、抗肿瘤等功效，对肠胃疾病，眼疾，咽喉疾病，糖尿病及心脑血管疾病有显著改善作用。
3.人参，五加科植物人参的根，性味甘、微苦、平，入脾、肺、心经，具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智的功效，多用于气虚证、肺脾气虚、食少乏力、自汗、虚咳喘促及各种气虚厥脱、虚劳、虚损等症。
4.决明子，豆科植物决明的干燥成熟种子，以其有明目之功效而名之。决明子味苦、甘、咸，性微寒，入肝、肾、大肠经；润肠通便，降脂明目，治疗便秘及高血脂，高血压；清肝明目，利水通便，有缓泻作用，降血压降血脂。
5.本发明以石斛为主要功能原料，人参和决明子为辅助功能原料，将石斛、人参、决明子合理配伍，开发一种具有护眼功能的石斛组合物。


技术实现要素：

6.本发明以石斛、人参、决明子为原料，原料按照特定配比混合后，经粉碎、浸泡、煎煮、过滤、浓缩、干燥等工艺步骤制得一种具有护眼功能的石斛组合物。
7.本发明的具体实现步骤如下：
8.1、按照重量份称取石斛9份、人参9份、决明子15份，混合后粉碎，制得原料粉末；
9.2、在原料粉末中加入20倍重量的水常温浸泡60mim，然后80℃煎煮100min，过滤，滤渣重复煎煮60mim，过滤，合并两次滤液；
10.3、滤液经适度浓缩、干燥，制得石斛组合物。
11.本发明的有益技术效果体现在以下几个方面：
12.1、本发明在中药理论基础上，将石斛、人参、决明子三种药食同源原料合理配伍，开发的石斛组合物经细胞试验验证，具有显著的视网膜色素上皮细胞光损伤保护作用。
13.2、本发明以中药配伍理论为基础，挑选药食同源原料，按照特定的质量比例进行配方组合，运用传统的水煎方法，获取其中的有效成分，为研制具有护眼作用的功能食品提供了理论基础和技术支撑。
附图说明
14.图1最优配方功能验证各试验组细胞形态倒置显微镜观察图；
15.图2最优配方功能验证各试验组细胞活力测定结果图；
16.图3最优配方功能验证各试验组细胞内ros含量测定结果图；
17.图4最优配方功能验证各试验组细胞内mda含量测定结果图。
具体实施方式
18.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但示例性的实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。
19.实施例1
20.在石斛、人参、决明子中国药典推荐用量的基础上，为了排除量效关系的干扰，在保持各组原料配比关系不变的前提下，将各组原料总量均调整为27g，采用l9(34)正交试验，具体试验分组见表1。
21.表1 l9(34)正交试验分组表
[0022][0023]
按照表1各组中原料重量称取石斛、人参、决明子，混合后粉碎，制得原料粉末；在原料粉末中加入20倍重量的水常温浸泡60mim，然后80℃煎煮100min，过滤，滤渣重复煎煮60mim，过滤，合并两次滤液；滤液经适度浓缩、干燥，制得不同原料配比组合物。
[0024]
组合物得率计算方法为：冻干后粉末重(g)/原料总量(27g)*100％，计算结果见表2。
[0025]
表2不同原料配比组合物得率计算结果
[0026][0027]
实施例2
[0028]
1、试验血清制备
[0029]
将60只小鼠随机分为10组，每组6只，其中9组为不同原料配比组合物试验组，1组为空白对照组，试验组以人体每日推荐剂量的10倍并结合提取率计算各组小鼠的每日灌胃剂量，空白对照组灌胃等量生理盐水。所有组别小鼠适应性饲养7天后开始灌胃，每天灌胃2次，间隔时间为6h，持续灌胃7天。最后一次灌胃1.5h后，co2窒息小鼠，75％酒精消毒后于超净台心脏取血，血样静置3h后，3000rpm离心15min，取上清，过0.22μm滤膜除菌，放于-80℃冰箱保存备用。
[0030]
2、视网膜色素上皮细胞培养
[0031]
人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)购于中国科学院细胞库，dmem/f12完全培养基(10％优质胎牛血清，1％青链霉素)培养，观察细胞形态为梭形或多边形，每2～3d换液一次。
[0032]
待细胞长至80％～90％时传代，弃去旧培养液，pbs缓冲液洗涤3次，加入0.25％胰酶消化2min，加入完全培养基终止消化，反复吹打至贴壁细胞分散成细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清液，加新培养液吹打，细胞计数后，按1∶2或1∶3传代接种到培养瓶中继续培养。
[0033]
细胞长至约80％时，弃去旧培养液，pbs缓冲液洗涤2次，胰酶消化2min后，加入完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清液，加细胞冻存液(培养基∶血清∶dmso＝7∶2∶1)重悬细胞，分装到无菌冻存管中，4℃静置30min后转入-20℃冰箱2h，-80℃超低温冰箱过夜，第二天置于液氮罐中长期冻存。
[0034]
快速从液氮罐中取出细胞，立即置于37℃水浴锅中不断摇动至解冻，移至离心管，加入适量培养液，1000rpm离心5min，弃上清液，加入完全培养基吹打成细胞悬液并移于培养瓶培养，24h后观察并记录细胞形态与数目，更换培养液。
[0035]
3、视网膜色素上皮细胞光损伤建模条件确定
[0036]
将细胞计数后按照2
×
104个/孔均匀种于96孔板，每孔体积为100μl，待细胞贴壁
24h后，置于led日光灯下，调整光照强度为7.32
±
0.29j/(s
·
m2)、29.28
±
0.29j/(s
·
m2)、73.21
±
0.29j/(s
·
m2)，持续照射细胞2h，照射完毕后于细胞培养箱恢复培养12h，对照组细胞相同条件下避光培养，培养结束后每孔加入10μl cck-8溶液，37℃孵育3h后测定450nm处的吸光值，计算细胞活力。
[0037]
细胞活力＝(试验孔od值-空白孔od值)/(对照孔od值-空白孔od值)，造模成功的标准为试验组的细胞活力为对照组的50％左右，不同光照强度下细胞活力计算结果见表3。计算结果表明，在73.21
±
0.29j/(s
·
m2)光强照射下，试验组细胞活力为对照组的55.84
±
4.13％，故光损伤模型建立的最佳光照强度为73.21
±
0.29j/(s
·
m2)，光照时间为2h。
[0038]
表3不同光照强度下细胞活力
[0039][0040]
4、筛选视网膜色素上皮细胞光损伤保护作用最优的原料配比
[0041]
试验分组如下：空白对照组(100μl dmem/f12完全培养基培养，避光)、模型组(100μl dmem/f12完全培养基培养，光照)、空白血清组(5μl小鼠空白血清 95μl dmem/f12完全培养基，光照)、不同原料配比血清组(5μl不同原料配比组小鼠血清 95μl dmem/f12完全培养基，光照)。
[0042]
各试验组细胞均在贴壁24h后，弃去旧培养基后用pbs洗涤一遍，按照试验分组加入不同培养基，培养箱避光孵育24h后，需要光照处理的细胞在73.21
±
0.29j/(s
·
m2)光强下光照2h，光照结束后培养箱恢复培养12h。
[0043]
细胞恢复培养结束后每孔加入10μl cck-8溶液，37℃孵育3h，酶标仪测定450nm处的吸光值，计算细胞增殖率，根据细胞增殖率数据分析结果，筛选视网膜色素上皮细胞光损伤保护作用最优的原料配比。
[0044]
细胞增殖率(％)＝(不同原料配比血清组od值-空白孔od值)/(空白血清组od值-空白孔od值)*100％，各试验组细胞增殖率计算及分析结果见表4。细胞增殖率结果表明，石斛9份、人参9份、决明子15份的原料配比视网膜色素上皮细胞光损伤保护作用最优。
[0045]
表4各试验细细胞增殖率数据分析表
[0046][0047]
实施例3
[0048]
1、最优配方护眼功能细胞验证试验分组
[0049]
空白对照组(100μl dmem/f12完全培养基培养，避光)、模型组(100μl dmem/f12完全培养基培养，光照)、空白血清组(5μl小鼠空白血清 95μl dmem/f12完全培养基，光照)、最优配方血清组(5μl最优配方小鼠血清 95μl dmem/f12完全培养基，光照)。
[0050]
各试验组细胞均在贴壁24h后，弃去旧培养基后用pbs洗涤一遍，按照试验分组加入不同培养基，培养箱避光孵育24h后，需要光照处理的细胞在73.21
±
0.29j/(s
·
m2)光强下光照2h，光照结束后培养箱恢复培养12h。
[0051]
2、倒置显微镜观察各试验组细胞形态
[0052]
恢复培养结束后，于倒置显微镜下观察各试验组细胞形态并拍照记录。倒置显微镜观察各试验组细胞形态结果(图1)表明：空白对照组细胞形态多为梭形，且细胞边缘清晰，细胞较为圆滑；模型组细胞间隙大，细胞形态多为不规则形，可见细胞边缘伸出触角；最优配方血清组细胞间隙缩小，细胞生长状态较模型组有显著好转，细胞状态得到显著改善。
[0053]
3、cck-8法检测细胞活力
[0054]
恢复培养结束后，每孔加入10μl cck-8溶液，37℃孵育3h后测定450nm处的吸光值，计算细胞活力。细胞活力测定结果(图2)表明：模型组细胞活力为空白对照组的52.99
±
2.93％，说明光损伤模型建立成功，与空白血清组相比，最优配方血清组细胞活力提高了65.06
±
3.44％，最优配方血清组显著提高了细胞活力。与空白对照组相比，*p＜0.05，**p
＜0.01，与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01。
[0055]
3、细胞内ros和mda含量的检测
[0056]
恢复培养结束后按照ros检测试剂盒和mda检测试剂盒的说明方法进行测定。
[0057]
ros是需氧细胞在代谢过程中产生，可以氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸，反应产物是mda，mda是脂质过氧化过程中重要的反应产物之一，可通过测定mda的含量了解脂质过氧化的程度。ros和mda是两种有代表性的氧化指标。细胞内ros含量测定结果(图3)和细胞内mda含量测定结果(图4)表明：模型组细胞内ros和mda含量明显增加，最优配方血清组细胞内ros和mda含量显著下降。与空白对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01。
[0058]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本发明的内容，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。