一种小分子药物与siRNA共输送的小粒径纳米体系的构建方法及应用

一种小分子药物与sirna共输送的小粒径纳米体系的构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及高分子化学与生物医学工程领域，具体涉及一种小分子药物与sirna共输送的小粒径纳米体系的构建方法及应用。
技术背景
2.目前，用于胰腺癌系统治疗的药物主要包括吉西他滨，紫杉醇类，伊立替康，氟尿嘧啶类，奥沙利铂类等化疗药物，以及靶向药物厄洛替尼和尼妥珠单抗。然而由于胰腺癌特有的肿瘤微环境，限制了药物治疗作用的发挥，也导致胰腺癌患者对治疗的不敏感及预后效果差。
3.胰腺癌的肿瘤微环境主要由胰腺癌细胞及其周围的成纤维细胞、免疫细胞、血管内皮细胞、细胞外基质、细胞因子等成分构成。致密的细胞外基质可以形成物理屏障，阻碍药物输送至肿瘤部位；同时肿瘤相关巨噬细胞，髓源性抑制细胞，调节性t细胞等免疫抑制细胞在肿瘤部位的聚集也可以抑制肿瘤的免疫响应。因此，从肿瘤微环境的角度出发，寻找新的治疗策略，对于提高胰腺癌的治疗效果具有非常重要的意义。胰腺星状细胞是胰腺癌肿瘤微环境的重要组成部分，在细胞因子的刺激下，胰腺星状细胞可发生活化，大量增殖，并通过分泌细胞外基质、细胞因子等方式促进胰腺癌的生长。一方面，它分泌的细胞外基质可以形成物理屏障阻碍药物输送及效应t细胞的浸润；另一方面，它分泌的细胞因子不仅可直接作用于肿瘤细胞，促进肿瘤细胞的增殖与转移，还可作用于免疫细胞，诱导形成免疫抑制的肿瘤微环境。所以，胰腺星状细胞可作为胰腺癌治疗的一个重要靶点。
4.趋化因子12(cxcl12)，又称基质细胞衍生因子1(sdf-1)，是一种小分子细胞因子，属于趋化因子蛋白家族。研究报道表明，在胰腺癌发展过程中，趋化因子12(cxcl12)主要由胰腺星状细胞分泌，并参与形成免疫抑制的肿瘤微环境。cxcl12通过作用于肿瘤细胞、t细胞、单核细胞、血管内皮细胞表面的cxcr4受体，进而促进肿瘤的生长与转移，抑制细胞毒性t细胞在肿瘤部位的的浸润，并募集抑制性免疫细胞如到肿瘤微环境，介导免疫抑制的肿瘤微环境。因此，抑制cxcl12信号通路也可以改善胰腺癌的肿瘤微环境。近年来，rna干扰技术得到了很大的发展，因其具有高效的基因沉默效果，在包括肿瘤在内的多种疾病的治疗领域展现出了非常广阔的应用前景。利用rna干扰技术下调胰腺星状细胞的cxcl12的表达，可以减少免疫抑制细胞的募集，并增加细胞毒性t细胞的聚集，可达到改善胰腺癌肿瘤微环境的作用。此外，研究报道小分子药物钙泊三醇逆转胰腺星状细胞的活化，在减少胰腺星状细胞细胞外基质分泌的同时，也可抑制cxcl12的分泌。所以cxcl12小干扰rna与小分子药物钙泊三醇联合使用可达到协同改善胰腺癌肿瘤微环境的作用，在此基础上联合免疫抑制剂pd-1，可达到增强胰腺癌免疫治疗的效果。
5.近年来，聚合物纳米载体的发展为降低药物毒副作用及药物共输送方面展现出巨大的潜力，然而，受限于胰腺癌致密的基质微环境，目前报道的小分子与sirna共载体系100nm左右的尺寸无法在肿瘤部位有效渗透。因此，如何让共载的sirna和小分子药物在胰
腺癌组织富集并发挥抗肿瘤作用，也是临床上亟需解决的一个重要问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于制备一种聚合物载体共载钙泊三醇和cxcl12-sirna的小粒径的纳米药物，克服由于胰腺癌肿瘤微环境中致密的胞外基质引起的药物及效应t细胞渗透阻碍。
7.本发明的另一个目的在于提供一种小分子药物与核酸药物共递送的载体聚合物。
8.本发明的另一个目的在于提供一种上述载体聚合物的制备方法。
9.本发明的目的通过如下技术方案予以实现：
10.一种用于小分子药物与sirna共输送的载体聚合物，其结构如下式(i)所示：
[0011][0012]
其中，m为15，k为10，p为20。
[0013]
一种用于小分子药物与sirna共输送的载体聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
s1.聚乙二醇-聚氨基酸苄酯的合成：
[0015]
由聚乙二醇-氨基作大分子引发剂，先引发赖氨酸苄酯酸酐聚合，再加入聚天冬氨酸苄酯酸酐和聚苯丙氨酸酸酐的开环共聚，得到聚乙二醇-聚氨基酸苄酯；
[0016]
s2.聚天冬氨酸苄酯的氨解：
[0017]
用n,n-二异丙基乙二胺(dip)氨解聚乙二醇-聚氨基酸苄酯中的聚天冬氨酸苄酯段，引入酸敏感基团；
[0018]
s3.合成聚合物(i)：
[0019]
用溴化氢脱去s2所得聚合物中聚赖氨酸的苄基保护基，得到如式(i)所示的载体聚合物。
[0020]
优选地，为实现聚合物载体的小粒径，聚乙二醇的分子量为2000da，主链分子量约为14kda。合理控制聚合物分子可以更有效提高药物载体聚合物在血液中的循环时间，更有利于纳米药物在胰腺癌部位的渗透。
[0021]
步骤s1所述聚乙二醇-氨基、赖氨酸苄酯酸酐、聚天冬氨酸苄酯酸酐和聚苯丙氨酸酸酐的摩尔比为1:15:10:20。
[0022]
步骤s1所述n,n-二异丙基乙二胺与聚乙二醇-聚氨基酸苄酯的摩尔比为30：1。
[0023]
上述式(i)所述的载体聚合物在作为小分子药物与sirna共输送载体的应用。
[0024]
一种治疗胰腺癌的药物，由上述式(i)所述的载体聚合物共载小分子药物与sirna得到。
[0025]
式(i)所示的聚合物在自组装同时负载小分子药物和sirna药物后具有较小的粒径，能够在胰腺癌有效富集。
[0026]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0027]
本发明在聚合物中引入的聚乙二醇，具有良好的生物相容性，可在聚合物载体表面形成水化层，有效屏蔽体内带负电的蛋白质对聚合物载体的吸附，逃避网状内皮系统对于纳米药物的清除，从而提高纳米药物在体内的稳定性；带正电的聚赖氨酸嵌段与sirna可通过正负电荷的聚电解质的复合作用形成复合物，有效负载sirna；苯丙氨酸嵌段提供疏水性及刚性，有利于形成粒径较小的纳米胶束；此外，将n,n-二异丙基乙二胺(dip)接枝在可降解的聚天冬氨酸侧链上，可赋予胶束ph敏感的药物释放能力。本发明提供一种可联合输送小分子药物与核酸药物的载体聚合物，且共载药物后得到的纳米药物尺寸较小，可在具有致密基质的胰腺癌有效聚集并作用于胰腺星状细胞。以胰腺星状细胞作为治疗靶点，所递送的sirna能够下调细胞趋化因子12的表达，同时小分子药物钙泊三醇能够抑制胰腺星状细胞的活化，从而达到协同治疗的效果。
附图说明
[0028]
图1为载体聚合物peg-pll-p(asp(dip)-co-phe)的分子结构式；
[0029]
图2为peg-pll(z)-p(bla-co-phe)的核磁共振氢谱图；
[0030]
图3为peg-pll(z)-p(asp(dip)-co-phe)的核磁共振氢谱图；
[0031]
图4为peg-pll-p(asp(dip)-co-phe)的核磁共振氢谱图
[0032]
图5为凝胶阻滞实验检测聚合物载药胶束对sirna的负载能力；
[0033]
图6为负载小分子药物钙泊三醇与核酸药物cxcl12-sirna后得到的纳米药物透射电镜图。
具体实施方式
[0034]
下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
[0035]
实施例1
[0036]
一种新型的可用于核酸与小分子药物共输送的载体聚合物，该聚合物由聚乙二醇、聚赖氨酸、聚天冬氨酸接枝n,n-二异丙基乙二胺共聚聚苯丙氨酸组成，其结构如下所示：
[0037][0038]
聚合物负载小分子药物与基因药物后为纳米级颗粒，粒径为45
±
6.4nm。
[0039]
聚合物(i)的合成
[0040]
s1.聚乙二醇-聚氨基酸苄酯(peg-pll(z)-p(bla-co-phe))的合成：
[0041]
先用聚乙二醇-氨基作大分子引发剂，引发苄基保护的赖氨酸酸酐的开环聚合，反应完成后再引发天冬氨酸苄酯酸酐和苯丙氨酸酸酐共聚，得到聚乙二醇-聚氨基酸苄酯，其反应机理及过程如下：
[0042][0043]
取1g peg-nh2加入反应瓶，经80℃抽真空干燥4h后，将1.5g赖氨酸酸酐用2ml无水dmf溶解后加入反应瓶，在35℃下反应48h后，加入3ml无水dmf溶解的1g天冬氨酸苄酯酸酐(bla-nca)和1.6g苯丙氨酸酸酐(phe-nca)混合溶液，继续在35℃反应48h。然后将反应物溶液加入约400ml的乙醚中沉淀，并-20℃冷藏12h，恢复室温后，离心，乙醚洗涤沉淀并真空干燥得到聚乙二醇-聚氨基酸苄酯(peg-pll(z)-p(bla-co-phe))。产物核磁如附图2所示。
[0044]
s2.peg-pll(z)-p(asp(dip)-co-phe)的合成：
[0045]
用n,n-二异丙基乙二胺(dip)氨解嵌段聚合物中的聚天冬氨酸苄酯段。1.5g peg-pll(z)-p(bla-co-phe)用无水dmso溶解，加入3g dip(过量)，在35℃下反应24h后将聚合物溶液用甲醇透析(透析袋截留分子量：3.5kda)2天，旋蒸除去甲醇得到peg-pll(z)-p(asp(dip)-co-phe)。产物核磁如附图3所示。
[0046]
s3.合成聚合物(i)：
[0047]
用hbr脱去peg-pll(z)-p(asp(dip)-co-phe)中聚赖氨酸嵌段的苄基保护基即可得到终产物(i)。1g peg-pll(z)-p(asp(dip)-co-phe)用10ml三氟乙酸溶解后，在冰浴条件下加入3ml hbr的乙酸溶液，撤去冰浴搅拌2h。随后，将反应液沉淀在大量冷乙醚中，过滤、洗涤、干燥得到粗产物。粗产物用水溶解后(可加入dmso助溶)在中性水中透析2天，冻干得终产物peg-pll-p(asp(dip)-co-phe)，即聚合物(i)。产物核磁如附图4所示。
[0048]
s1和s2的反应机理及过程如下：
[0049][0050]
实施例2
[0051]
聚合物(i)联合负载小分子药物与sirna并应用与胰腺癌的治疗。
[0052]
实施例中使用的sirna序列为：正义链5
′
cca gag cca acg uca agc auc ugaa3
′
，反义链5
′
uuc aga ugc uug acg uug gcu cugg3
′
。
[0053]
取实施例1制备得到的聚合物(i)20mg与2mg钙泊三醇一起溶解在2ml氯仿和dmso的混合溶液中，经超声乳化到20ml去离子水中，然后旋蒸除去氯仿，并在水中透析2天除去dmso，浓缩后制备得到载药聚合物胶束溶液。然后通过凝胶阻滞电泳实验验证其负载sirna的能力(如图5)。按n/p比为6将载药胶束与sirna的水溶液混合，强烈震荡30s，静置30min后即制得复合sirna的纳米药物。用透射电镜表征其尺寸和形貌。如图6所示，该纳米药物为球形结构，直径在40nm左右。
[0054]
上述sirna可以下调cxcl12基因的表达，减少肿瘤相关巨噬细胞，髓源性抑制细胞，调节性t细胞等免疫抑制细胞在肿瘤部位的聚集，同时增加细胞毒性t细胞的募集；此外，共输送的小分子药物钙泊三醇可以抑制胰腺星状细胞的活化，减少细胞外基质的分泌的同时也可抑制cxcl12的表达，从而达到协同调节免疫微环境的作用，最终可增强pd-1抗体在胰腺癌中的免疫治疗作用。
[0055]
对比例1
[0056]
与实施例1区别在于，药物载体(i)的酸敏感pasp(dip)和疏水段pphe的比例不同，即分子式(i)中k，p值分别为15，15或20，10，对比他们与实例1中结构的载药效率，重点研究获得的纳米药物尺寸及小分子药物酸敏感释放情况，筛选出更符合需求的纳米药物。
[0057]
当k，p值分别为15，15时，得到的最终纳米药物尺寸为76
±
8.5nm；当k，p值分别为20，10时，得到的最终纳米药物尺寸为106
±
12.4nm。因为聚苯丙氨酸嵌段变少，聚合物的疏水性相应变差。