基于Simoa平台检测血清中抗人TNF-α抗体的方法与流程

基于simoa平台检测血清中抗人tnf-α
抗体的方法
技术领域
1.本发明属于生物检测领域，具体地，本发明涉及一种基于simoa平台检测血清中抗人tnf-α抗体的方法。


背景技术：

2.simoa(single-molecule array，单分子阵列)技术可以在外周血中实现这些神经系统疾病标志物的准确检测。simoa技术是由美国quanterix公司研发生产的一款超高灵敏度单分子蛋白质检测技术，其灵敏度为elisa技术的1000倍以上，检测下限达到fg/ml，相比传统技术，不仅提高酶底物的反应效率，且指数级降低了荧光信号的扩散和背景信号的干扰，从而提高了低丰度蛋白的检测灵敏度，实现了单分子检测的可能。
3.simoa技术是将约250,000个捕获抗体包被在2.7μm的小磁珠(10种荧光标记)上，检测时加入生物素标记的检测抗体及亲和素偶联的酶和底物，通过一层油将单个磁珠封闭在4.5μm的反应孔(well)中进行反应(避免信号扩散和交叉反应)。每238,000个well组成一张芯片(array)，每24个array再组成一张光盘(disc)，disc数据采集使用ccd摄像头捕获这些小孔中超过阈值的检测信号，标记为“on well”和“off well”。通过计算“on well”在array中的比例，依据泊松分布理论，计算出目的蛋白的浓度，实现数字化定量，其精确度远超elisa的模拟定量。
4.肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,tnf-α)是一种促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生。tnfα受体存在于多种细胞表面，tnfα与tnfr的结合通常会引起细胞凋亡、炎症和肿瘤的发生等。其功能失调被认为与许多疾病相关，如心血管疾病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、移植物抗宿主病和骨髓造血紊乱综合症等。tnf-α抑制剂阻止其与tnf受体的结合，从而抑制tnf的生物活性。tnf-α抑制剂的毒理及药代动力学研究，对该类疾病的防治有积极的意义。
5.现有simoa商用试剂盒虽然灵敏度高，但成本高昂，多用于pd标志物检测。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少高灵敏度检测血清中抗人tnf-α抗体的方法，提供一种基于simoa平台检测血清中抗人tnf-α抗体的方法。本发明的方法使用homebrew标记，能极大降低成本，且可以针对药动学实验进行有效检测。
7.本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
8.本发明的第一方面提供一种基于simoa平台检测血清中抗人tnf-α抗体的方法，包括：在液滴中将包被在磁珠上的捕获抗体和生物素标记的检测抗体与待测样本共孵育，加入荧光显色剂，荧光显色剂作为底物，与结合抗人tnf-α抗体的检测抗体上连接的酶发生反应，产生检测信号并通过simoa平台捕获和分析所述检测信号，所述捕获抗体为genscript的monorab anti-adalimumab antibody(4e12，cat:a01921-40)，所述检测抗体为
genscript的monorab anti-adalimumab antibody(134d5，cat:a01922-40)。
9.在本发明一些实施方案中，所述包被在磁珠上的捕获抗体的工作浓度为0.6～0.72ng/ml。
10.较佳地，所述包被在磁珠上的捕获抗体的工作浓度为0.72ng/ml。
11.在本发明一些实施方案中，所述磁珠的工作浓度为1.8～2.4
×
107个/ml。
12.较佳地，所述磁珠的工作浓度为2
×
107个/ml。
13.在本发明一些实施方案中，所述检测抗体的工作浓度为0.2～0.3ng/ml。
14.较佳地，所述检测抗体的工作浓度为0.25ng/ml。
15.在本发明一些实施方案中，所述生物素标记的检测抗体为nhs-peg4-biotin标记的检测抗体。
16.在本发明一些实施方案中，所述酶为链霉亲和素β-乳糖酶。
17.较佳地，所述酶的工作浓度为30～60pm。
18.更佳地，所述酶的工作浓度为50pm。
19.在本发明一些实施方案中，所述底物为试卤灵a-d-吡喃半乳糖苷(rpg)。
20.在本发明一些实施方案中，所述方法还包括：对所述捕获抗体和所述检测抗体在使用前通过滤膜进行缓冲液置换。
21.较佳地，所述缓冲液置换包括：用缓冲液分别冲洗所述滤膜的两侧3～4次。
22.在本发明一些实施方案中，所述捕获抗体在0～4℃包被所述磁珠。
23.在本发明一些实施方案中，所述simoa平台为simoa hd-x analyzer。
24.在本发明一些实施方案中，所述待测样本为血清样本。
25.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
26.本发明所用试剂和原料均市售可得。
27.本发明的积极进步效果在于：
28.本发明的方法使用homebrew试剂分别置换捕获抗体和检测抗体，并将捕获抗体结合在活化的磁珠上，使用生物素标记检测抗体，在simoa平台上进行检测，能极大降低成本，且可以针对药动学(pk)实验进行有效检测，灵敏度可为2ng/ml。
附图说明
29.图1为标准品拟合曲线截屏。
30.图2为标准品拟合曲线截屏。
具体实施方式
31.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
32.实施例1beads标记
33.置换捕获抗体buffer
34.1、计算80μg捕获抗体(genscript的monorab anti-adalimumab antibody，4e12，
cat:a01921-40)并加入到amicon filter中预冷的bead conjugation buffer，总体积为500μl。
35.2、离心14,000g，5min，将离心管中的液体倒掉。
36.3、加入预冷的bead conjugation buffer到amicon filter中，使总体积约为500μl，离心14,000g，5min，将离心管中的液体倒掉。
37.4、重复1次步骤3。
38.5、收集捕获抗体，取一个新的amicon离心管，将filter倒置到新的amicon离心管中，离心1,000g，2min。
39.6、用50μl预冷的bead conjugation buffer冲洗filter两边的膜，用移液枪由上而下冲洗6次，每边膜各3次。
40.7、将filter倒置到步骤6的amicon离心管中，离心1,000g，2min，收集到的捕获抗体体积78μl。
41.8、按照nanodrop说明书中记载的igg检测模式检测收集的捕获抗体浓度为0.704mg/ml(nanodrop，a280，igg，用bead conjugation buffer做blank)。
42.9、用bead conjugation buffer将捕获抗体稀释到0.2mg/ml，取300μl涡旋，置于冰上备用。
43.置换磁珠buffer
44.1、将磁珠置于磁力架上》1min，去除上清液。
45.2、在ep管中加入300μl bead wash buffer，涡旋5s，快速离心，打开ep管盖子，置于磁力架上》1min，去除上清液。
46.3、重复2次步骤2。
47.4、加入300μl预冷的bead conjugation buffer，涡旋5s，快速离心，打开ep管盖子，置于磁力架上》1min，去除上清液。
48.5、重复2次步骤4。
49.6、加入291μl预冷的bead conjugation buffer，涡旋5s，快速离心，置于冰上备用。
50.磁珠活化
51.1、将1ml预冷的bead conjugation buffer加入到edc(thermo scientific，77149lcs)(10mg)管中，拧紧盖子，涡旋5s直到粉末完全溶解。
52.2、取9μl冷的edc溶液到291μl置换好buffer的预冷的磁珠中，edc终浓度为0.3mg/ml，快速涡旋10s，混匀。
53.3、置于hulamixer上，2-8℃，30min。
54.将捕获抗体偶联到磁珠上
55.1、将活化的磁珠从hulamixer上取出，快速离心，打开ep管盖子，置于磁力架上》1min，去除上清液。
56.2、加入300μl预冷的bead conjugation buffer，涡旋5s。
57.3、快速离心，打开ep管盖子，置于磁力架上》1min，去除上清液。
58.4、加入置换好buffer的预冷的捕获抗体，涡旋10s。
59.5、置于hulamixer上，2-8℃，2h。
60.封闭磁珠
61.1、将偶联了捕获抗体的磁珠从hulamixer上取出，快速离心，打开ep管盖子，置于磁力架上》1min。
62.2、加入300μl bead wash buffer到磁珠中，涡旋5s。
63.3、快速离心，打开ep管盖子，置于磁力架上》1min，将上清液转移到新的ep管中。
64.4、重复1次步骤2-3，但是无需收集上清液。
65.5、加入300μl bead blocking buffer，涡旋5s。
66.6、置于hulamixer上，室温，45min。
67.清洗
68.1、从hulamixer上取下封闭的磁珠，快速离心，打开ep管盖子，置于磁力架上》1min，去除上清液，加入300μl bead wash buffer，涡旋5s。
69.2、快速离心，打开ep管盖子，置于磁力架上》1min，去除上清液，加入300μl bead diluent，涡旋5s。
70.3、快速离心，打开ep管盖子，置于磁力架上》1min，去除上清液，加入300μl bead diluent，涡旋5s。
71.快速离心将盖子和管壁的磁珠离下来，避光储存在冷藏冰箱(2～8℃)。
72.实施例2生物素化检测抗体
73.置换检测抗体buffer
74.1、计算80μl检测抗体(genscript的monorab anti-adalimumab antibody，134d5，cat:a01922-40)，加入到amicon filter中biotinylation reaction buffer，总体积为500μl。
75.2、离心》14,000g，min，将amicon离心管中的液体倒掉。
76.3、加入biotinylation reaction buffer到amicon filter中，使总体积约为500μl，离心》14,000g，5min，将amicon离心管中的液体倒掉。
77.4、重复1次步骤4。
78.5、收集检测抗体，取一个新的amicon离心管，将filter倒置到新的amicon离心管中，离心1,000g，2min。
79.6、用50μl biotinylation reaction buffer冲洗filter两边的膜，用移液枪由上而下冲洗6次，每边膜各3次。
80.7、将filter倒置到步骤6的amicon离心管中，离心1,000g，2min。
81.8、用biotinylation reaction buffer将检测抗体稀释到1mg/ml，取100μl。
82.9、涡旋，置于冰上备用。
83.检测抗体生物素化
84.1、用383μl dih2o溶解nhs-peg4-biotin，混匀。
85.2、取3μl nhs-peg4-biotin加到置换好buffer的检测抗体中。
86.3、涡旋混匀，快速离心，室温孵育30min。
87.纯化生物素化的检测抗体
88.1、将反应液转移到新的amicon filter中。
89.2、加入400μl biotinylation reaction buffer，离心》14,000g，5min，将amicon
离心管中的液体倒掉。
90.3、加入biotinylation reaction buffer到amicon filter中，使总体积约为500μl，离心》14,000g,5min，将amicon离心管中的液体倒掉。
91.4、重复2次步骤3。
92.5、收集生物素化的检测抗体，取一个新的amicon离心管，将filter倒置到新的amicon离心管中，离心1,000g，2min。
93.6、用50μl biotinylation reaction buffer冲洗filter两边的膜，用移液枪由上而下冲洗6次，每边膜各3次。
94.7、将filter倒置到步骤5的amicon离心管中，离心1,000g，2min。
95.检测收集的检测抗体稀释至0.25mg/ml，储存在冷藏冰箱。
96.实施例3
97.1、包被试剂的配制：
98.将浓度为1.12
×
109beads/ml的实施例1制备得到的beads用bead diluent稀释56倍。
99.2、检测试剂的配制：
100.将浓度为0.25mg/ml的实施例2制备得到的生物素化检测抗体用homebrew detector/sample diluent稀释1000倍。
101.3、sbg(链霉亲和素β-乳糖酶)溶液的配制
102.将浓度为50nm的sbg concentrate用sbg diluent稀释1000倍。
103.4、标准曲线样品的配制：
104.使用标准品anti-human tnf-α(genscript probio，c5247gi09001/ds02fl001)，依照下表1配制，得到标准曲线样品。
105.表1标准品配方
[0106][0107]
5、精密度和准确度样品的配制：
[0108]
使用标准品anti-human tnf-α(genscript probio，c5247gi09001/ds02fl001)，依照下表2配制，得到精密度和准确度样品。
[0109]
表2标准品精密度和准确度结果
[0110]
aanti-human tnf-α550245196.400μg/mlba5401954.910μg/mlcb1140429122000.750pg/mluloqc409.6491/25637664000.000pg/mlhqculoq4204/314048000.000pg/mlmqchqc200220024000.000pg/mllqcmqc10043006000.000pg/mllloqlqc10032002000.000pg/ml
[0111]
表中：uloq为定量上限(upper limit of quantitation)，hqc为高浓度质控(high concentration quality control)，mqc为中浓度质控(medium concentration quality control)，lqc为低浓度质控(low concentration quality control)，lloq为定量下限(lower limit of quantitation)。
[0112]
6、样品处理：加样前标准曲线、质控品用homebrew detector/sample diluent溶液进行5倍稀释预处理。
[0113]
加样：根据实验布局，在相应的孔内分别加入250μl的标准曲线样品、质控样品和待测样品。
[0114]
上机：将配制好的包被捕获抗体的磁珠、生物素化的检测抗体、酶、rgp(试卤灵a-d-吡喃半乳糖苷，荧光显色剂)及加好样品的96孔板上机(simoa hd-x analyzer数字式单分子免疫阵列分析仪)。assay类型选择3步法(第一步：加入beads，sample/calibrator孵育15min；第二步：加入detector(检测抗体)，孵育5.25min；第三步：加入sbg，孵育5.25min，最后用rgp显色)。依照程序流程依次确认试剂和96孔板放置位置，耗材可使用量充足，wash buffer 1，wash buffer 2，water充足。
[0115]
回归方法:
[0116]
以待测样品浓度为横坐标，待测样品复孔均值与空白复孔均值的aeb值差为纵坐标，通过四参数曲线拟合，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。两个批次run01和run02的拟合曲线如图1和图2所示，标准曲线结果以及精密度和准确度结果如表3和表4所示。
[0117]
样品中分析物的实测浓度由以下回归方程计算：
[0118]
y＝(a-d)/[1 (x/c)b] d
[0119]
其中，a：曲线下渐近线估值
[0120]
d：曲线上渐近线估值
[0121]
b：曲线的斜率
[0122]
c：最大结合一半时对应的浓度(权重因子为1/y)
[0123]
表3标准曲线结果汇总
[0124][0125][0126]
range？＝超出标准曲线范围，不能进行拟合回算
[0127]
表4待测样品精密度和准确度结果汇总
[0128][0129]
range？＝超出标准曲线范围，不能进行拟合回算。
[0130]
综上，基于simoa平台，使用标记的beads和生物素化检测抗体，建立了检测血清中anti-human tnf-αantibody的检测方法，灵敏度为2ng/ml。