一种蝉花孢梗束的快速培养方法

1.本发明属于生物制品的培养制备技术领域，具体涉及蝉花孢梗束快速培养的方法。


背景技术：

2.蝉花(cordyceps chanhua)为麦角菌科(clavicipitaceae)、虫草属(cordyceps)的真菌，有多个同物异名：蝉虫草（cordyceps cicadae）, 辛克莱蝉花（cordyceps sinclairii）, 辛克莱棒束孢（isaria sinclairii）, 蝉拟青霉（paecilomyces cicadae）和蝉棒束孢（ isaria cicadae）。是蝉花真菌感染昆虫后长出孢梗束后的虫草复合体，蝉花是我国传统中药材，具有一千余年利用历史，具有重要经济价值，但是野生蝉花生产需要2年时间，同时受气候环境等多种因素影响，生产具有很大不确定性。目前，培养蝉花已实现人工培养，但培养过程中仍然有很多因素导致孢梗束诱发缓慢、生长参差不齐或产量较低。
3.本专利申请前期研究，通过比较蝉花不同生长阶段代谢差异，发现了在生长某些阶段添加本发明专用添加剂，可加快诱发蝉花孢梗束，并促进其生长，提高蝉花孢梗束生长速度。


技术实现要素：

4.为了实现提高蝉花孢梗束生长速度、生长均匀整齐、利于工厂化采收，本发明提供一种蝉花孢梗束的快速培养方法。
5.一种蝉花孢梗束的快速培养方法，所用蝉花菌株保藏在虫生真菌研究中心菌库（rcef菌库），其国际菌库保藏号为wdcm1031；操作步骤如下：（1）制备一级固体菌种，将蝉花（cordyceps chanhua）斜面菌种接种于平板固体培养基中培养，得到一级固体菌种；（2）制备二级液体菌种，将一级固体菌种接种于液体培养基中振荡培养，得到二级液体菌种；（3）蝉花孢梗束培养；步骤（3）中，将二级液体菌种接种到小麦固体培养基上，接种量为每100g小麦培养基接种1～10ml液体菌种，温度22～29℃条件下，恒温培养7～10天；喷施专用添加剂，喷施量为培养基干重的0.05～0.15%，温度22～29℃条件下，恒温培养10～12天，蝉花孢梗束的长度达到35～45mm，即可采收；所述专用添加剂由磷脂酰胆碱、核黄素、色酪半胱三肽和甲基吡啶甜菜碱按质量比1～3：1～3：3～1：3～1（w/w）混合均匀，得到混合物；取20g～100g混合物加水定溶到1000ml即得。
6.步骤（3）中，所述小麦固体培养基：将小麦在水中浸泡1～10小时；温度121℃条件下，灭菌15～25分钟，冷却得到。
7.本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：1. 本发明的快速培养方法可将蝉花孢梗束生长时间从15～18天缩短到10～12天，节省50%以上培养时间；同时，可使蝉花孢梗束生长均匀整齐，长度基本都在35～45cm之
间，利于工厂化采收；节省了大量劳动力，符合低碳发展需求，同时有利于野生蝉花资源的保护。
8.2．本发明首先研究比较了孢梗束刚形成时期（10d）、孢梗束形成的早期（14d）、孢梗束形成中期（24d）、产孢开始期（28d）和产孢后期（40d）代谢物差异。参见图1，通过代谢组学分析获得了人工培养基上蝉花孢梗束刚形成时期与孢梗束形成的早期、孢梗束形成中期、产孢开始期、产孢后期之间的差异代谢物。其中蝉花孢梗束形成时期，其磷脂酰胆碱、腺嘌呤、酪氨酸、色氨酸、核黄素、色酪半胱三肽和甲基吡啶甜菜碱等含量与孢梗束形成密切相关。代谢组分析磷脂酰胆碱、核黄素、色酪半胱三肽和甲基吡啶甜菜碱等化合物在菌丝生长后期通过光诱导后含量快速增长，并很快产生孢梗束，随着孢梗束快速生长后上述物质被快速消耗，含量急剧下降，表明这些物质中包含孢梗束生长的信号分子，可诱导菌丝从营养生长转向生殖生长。
9.在菌丝生长结束后直接喷施磷脂酰胆碱：核黄素：色酪半胱三肽：甲基吡啶甜菜碱=1～3：1～3：3～1：3～1（w/w），可明显加快蝉花孢梗束生长速度，喷施后10天蝉花孢梗束生长的长度可达35mm，与没有喷施对照15天的长度相当，生长速度提高达50%。喷施实验结果证实了代谢组分析的结果，即上述添加剂包含孢梗束生长的信号分子，可诱导菌丝从营养生长转向生殖生长。
附图说明
10.图1 为蝉花代谢组热图。
具体实施方式
11.下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
12.实施例1本实施例1所用蝉花菌株为从野生蝉花（cordyceps chanhua）上分离得到，保藏在虫生真菌研究中心菌库（rcef菌库），其国际菌库保藏号为wdcm1031。
13.一种蝉花孢梗束的快速培养操作步骤如下：1. 制备一级固体菌种将蝉花（cordyceps chanhua）斜面菌种接种于平板固体培养基中，每支斜面菌种接2个9cm平板；然后于温度22℃，培养4天，得到一级固体菌种；所述固体培养基：由葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸出粉10 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容至1000 ml；2. 制备二级液体菌种将一级固体菌种接种于液体培养基中，每个9cm平板菌种接到500ml液体培养基；接种后于温度22℃、转速160转/分钟、振荡培养3天，得到二级液体菌种；所述液体培养基：由葡萄糖30g/l，蛋白胨8 g/l，酵母浸出粉8 g/l，蒸馏水定容；3. 蝉花孢梗束培养将二级液体菌种接种到小麦固体培养基上，接种量为每100g小麦培养基接种1ml液体菌种；温度为22℃条件下，恒温培养7天；喷施专用添加剂，喷施量为小麦固体培养基干重的0.05%（w/w），温度为22℃条件下，恒温培养10天，蝉花孢梗束的长度达35mm，即可采收。
与没有喷施添加剂的15天收获的蝉花孢梗束长度和产量一致。
14.所述小麦固定培养基制作：将小麦在水中浸泡1小时；温度121℃条件下，灭菌15分钟，冷却得到室温。
15.所述专用添加剂由磷脂酰胆碱、核黄素、色酪半胱三肽和甲基吡啶甜菜碱按质量比1kg：1kg：3kg：3kg混合均匀，得到混合物；取20g混合物加水定溶到1000ml即得。
16.实施例2本实施例2所用蝉花菌株为从野生蝉花（cordyceps chanhua）上分离得到，保藏在虫生真菌研究中心菌库（rcef菌库），其国际菌库保藏号为wdcm1031。
17.一种蝉花孢梗束快速培养方法操作步骤如下：1. 制备一级固体菌种将分离纯化的蝉花（cordyceps chanhua）斜面菌种接种于平板固体培养基中，每支斜面菌种接2个9cm平板；然后于温度29℃，培养8天，得到一级固体菌种；所述固体培养基：由葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸出粉10 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容至1000 ml；2. 制备二级液体菌种将一级固体菌种接种于液体培养基中，每个9cm平板菌种接到500ml液体培养基；接种后于温度29℃、转速220转/分钟、振荡培养6天，得到二级液体菌种；所述液体培养基：由葡萄糖50 g/l，蛋白胨12 g/l，酵母浸出粉12 g/l，蒸馏水定容；3. 蝉花孢梗束培养将二级液体菌种接种到小麦固体培养基上，接种量为每100g小麦培养基接种5ml液体菌种，培养温度为29℃培养，恒温培养10天；喷施专用添加剂，喷施量为小麦固体培养基干重的0.15%（w/w），接着培养12天，蝉花孢梗束长度达45mm，即可采收。与没有喷施添加剂的18天收获的蝉花孢梗束长度和产量一致。
18.所述小麦培养基：为小麦在水中浸泡10小时后121℃灭菌25分钟，冷却得到室温；所述专用添加剂：由磷脂酰胆碱：核黄素：色酪半胱三肽：甲基吡啶甜菜碱按质量比3kg：3kg：1kg：1kg（w/w）混合均匀，得到混合物；取100g混合物加水定溶到1000ml即得。
19.实施例3本实施例3所用蝉花菌株为从野生蝉花（cordyceps chanhua）上分离得到，保藏在虫生真菌研究中心菌库（rcef菌库），其国际菌库保藏号为wdcm1031。
20.一种蝉花孢梗束快速培养方法操作步骤如下：1. 制备一级固体菌种将分离纯化的蝉花（cordyceps chanhua）斜面菌种接种于平板固体培养基中，每支斜面菌种接2个9cm平板；然后于温度26℃，培养6天，得到一级固体菌种；所述固体培养基：由葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸出粉10 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容至1000 ml；2. 制备二级液体菌种将一级固体菌种接种于液体培养基中，每个9cm平板菌种接500ml液体培养基；接种后于温度26℃、转速190转/分钟、振荡培养4.5天，得到二级液体菌种；
所述液体培养基：由葡萄糖40 g/l，蛋白胨10 g/l，酵母浸出粉10g/l，蒸馏水定容；3. 蝉花孢梗束培养将二级液体菌种接种到小麦固体培养基上，接种量为每100g小麦培养基接种10ml液体菌种，培养温度为26℃培养。恒温培养8.5天后，喷施专用添加剂，喷施量为小麦固体培养基干重的0.10%（w/w），接着培养11天，蝉花孢梗束长度达40mm，即可采收。与没有喷施添加剂的16.5天收获的蝉花孢梗束长度和产量一致。
21.所述小麦培养基：为小麦在水中浸泡5小时后121℃灭菌20分钟，冷却得到室温；所述专用添加剂：由磷脂酰胆碱：核黄素：色酪半胱三肽：甲基吡啶甜菜碱按质量比2kg：2kg：2kg：2kg（w/w）混合均匀，得到混合物；取60g混合物加水定溶到1000ml即得。