一种靶向PD-L1的PET显像探针

al.comparison of copper-67-and iodine-125-labeled anti-cea monoclonal antibody biodistribution in patients with colorectal tumors[j].j nucl med 1997,38(6):847-853.)。中国专利cn111388686a公开了一种核素标记的pd-1靶向单克隆抗体，通过将pd-1单克隆抗体以n-溴代琥珀酰亚胺介导、或者与双功能螯合剂去铁胺偶联后，进行
124
i、
64
cu或
89
zr放射性核素标记得到核素标记的pd-1单克隆抗体。该专利的
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i-toripalimab探针对pd-1阳性肿瘤具有较高的摄取率，且肝脏非特异性摄取较低，有利于肝脏病灶的检出。


技术实现要素：

[0005]
本发明为了解决上述问题，提供了一种预测准确率高、成本低的评估pi3k/art/mtor通路相关基因突变的试剂盒、系统、计算机可读储存介质及其应用，采用临床已有检测项目的基因作为检测对象，能够在较低检测成本的基础上对pi3k/art/mtor通路相关基因突变进行较高准确度的预测。
[0006]
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种靶向pd-l1的pet显像探针
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i-durva-f(ab’)2，所述探针为核素
124
i修饰的pd-l1单克隆抗体f(ab’)2片段，所述pd-l1单克隆抗体为durvalumab单克隆抗体或其类似物。
[0007]
优选的，所述探针的比活度不低于3.0gbq/μmol。
[0008]
优选的，durvalumab单克隆抗体的类似物包括与durvalumab单克隆抗体核酸编码序列或氨基酸序列具有90％以上同源性的抗体。
[0009]
本发明还提供了一种靶向pd-l1的pet显像探针
124
i-durva-f(ab’)2的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
将durvalumab单克隆抗体或其类似物的f(ab’)2片段、核素
124
i和碘化剂混合进行标记，纯化后得到
124
i-durva-f(ab’)2。
[0011]
优选的，所述碘化剂为iodogen。
[0012]
优选的，将durvalumab单克隆抗体或其类似物的f(ab’)2片段、核素
124
i加入预涂有碘化剂iodogen的碘化管中，室温下孵育10min-30min，以pd-10脱盐柱纯化，得到
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i-durva-f(ab’)2。
[0013]
优选的，所述durvalumab单克隆抗体或其类似物的f(ab’)2片段的制备方法包括：以免疫球蛋白降解酶s对durvalumab单克隆抗体或其类似物酶解。
[0014]
优选的，所述酶解温度为35-40℃。
[0015]
本发明还提供了前述技术方案所述探针
124
i-durva-f(ab’)2或上述技术方案所述制备方法得到的探针
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i-durva-f(ab’)2在制备靶向pd-l1的诊断试剂或肿瘤治疗药物中的应用。
[0016]
优选的，所述靶向pd-l1的诊断试剂包括无创评估病灶pd-l1表达的诊断试剂、pd-1/pd-l1药物疗效诊断试剂及预后诊断试剂。
[0017]
与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0018]
1.本发明提供的
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i-durva-f(ab’)2探针对pd-l1具有高亲和力和特异性，在肝脏、骨骼中非特异摄取率低，有助于提高对肝脏、骨骼这两处易出现原发性或转移癌灶部位的识别灵敏度和准确率。
[0019]
2.本发明提供的
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i-durva-f(ab’)2探针仅采用抗体f(ab’)2片段，探针分子量显著降低，探针在体内清除速度显著提高，仅需4h即可获得可供诊断的图像，12小时显像效果最好；而含有完整抗体的pet/ct探针在24小时才能提供可以诊断的图像，最佳显像时间约在96小时。
附图说明
[0020]
图1为本发明所述
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i-durva-f(ab’)2探针的一种制备流程图；
[0021]
图2为实施例2中durvalumab单克隆抗体溶液和durva-f(ab’)2溶液的sds-page分析电泳图；
[0022]
泳道m：千道尔顿的标记蛋白；泳道1：还原后的durva-f(ab’)2溶液；泳道2：完整的durvalumab单克隆抗体；泳道3：纯化后的durva-f(ab’)2溶液，泳道4-7：durva-f(ab’)2片段的稳定性测试，分别在pbs中(37℃)孵育4、8、16、24小时；
[0023]
图3为实施例2中质谱检测结果；
[0024]
图4为纯化后24h对durva-f(ab’)2溶液的hplc分析图；
[0025]
图5为实施例2中
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i-durva-f(ab’)2探针的放射化学纯度检测图；
[0026]
图6为实施例2中
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i-durva-f(ab’)2探针在pbs中孵育24h后的检测图；
[0027]
图7为实施例2中
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i-durva-f(ab’)2探针在fbs中孵育24h后的检测图；
[0028]
图8为实施例2中
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i-durva-f(ab’)2探针在pbs中孵育72h后的检测图；
[0029]
图9为实施例2中
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i-durva-f(ab’)2探针在fbs中孵育72h后的检测图；
[0030]
图10为实施例3中
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i-durva-f(ab’)2探针的生物分布图；
[0031]
图11为实施例3注射124i-durva-f(ab’)
2 12h后的pet/ct(左)和pet(右)图像，虚线框内为肿瘤。
具体实施方式
[0032]
本发明提供了一种靶向pd-l1的pet显像探针
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i-durva-f(ab’)2，所述探针为核素
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i修饰的pd-l1单克隆抗体f(ab’)2片段(“durva-f(ab’)2片段”)，所述pd-l1单克隆抗体为durvalumab单克隆抗体或其类似物。durvalumab单克隆抗体，也称度伐利尤单抗或德瓦鲁单抗，商品名称为imfinzi(英飞凡)，是一种抗pd-l1抗体，该抗体肝摄取相对较低，本发明利用durvalumab以高亲和力和特异性结合pd-l1的特点对durvalumab或其类似物进行改造，保留活性区f(ab’)2，去掉重链固定区fc，得到的durva-f(ab’)2片段在保留分子特异性特异性的同时减少了探针分子量。体内和体外实验均显示了探针
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i-durva-f(ab’)2可对pd-l1的靶向性，探针
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i-durva-f(ab’)2可以高度特异地评价pd-l1的表达情况，与现有技术的正电子药物相比，该分子探针在肝脏和骨骼中的摄取明显降低。
[0033]
本发明探针
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i-durva-f(ab’)2的比活度不低于3.0gbq/μmol，所述“比活度”即比放射性，表示单位浓度的探针所含核素
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i的放射性活度。在本发明中，durvalumab单克隆抗体的类似物优选的包括与durvalumab单克隆抗体核酸编码序列或氨基酸序列具有90％以上同源性的抗体，如具有90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同源性的抗体。在本发明的一些具体实施方式中，探针
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i-durva-f(ab’)2为核素
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i修饰的durvalumab单克隆抗体的f(ab’)2片段，探针分子量仅为100kda左右，相对于包含完整单克隆抗体的探针
分子量缩减到2/3左右，探针的放射化学纯度高(96％以上)且标记稳定性好。
[0034]
如图1所示，本发明的一些具体实施方式中公开了一种探针
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i-durva-f(ab’)2的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
(1)durva-f(ab’)2片段的制备：将完整的durvalumab单克隆抗体或其类似物与免疫球蛋白降解酶s(ides蛋白酶)混合，35-40℃下孵育80-160min，得到消化产物；将消化产物中的fc片段与durva-f(ab’)2片段进行磁分离纯化，得到durva-f(ab’)2片段；
[0036]
(2)核素
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i的制备：在sumitomo hm-20回旋加速器中通过
124
te(p,n)
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i反应生成
124
i。
[0037]
(3)核素
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i标记：将pbs缓冲液、durva-f(ab’)2片段溶液、
124
i溶液加入到预涂有碘化剂iodogen的碘化管中，室温下孵育10-30min，以pd-10脱盐柱纯化，得到
124
i-durva-f(ab’)2。
[0038]
上述步骤(1)(2)之间无先后顺序限制。
[0039]
本发明还提供了前述技术方案所述探针
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i-durva-f(ab’)2或上述技术方案所述制备方法得到的探针
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i-durva-f(ab’)2在制备靶向pd-l1的诊断试剂或肿瘤治疗药物中的应用；优选的，所述靶向pd-l1的诊断试剂包括无创评估病灶pd-l1表达的诊断试剂、pd-1/pd-l1药物疗效诊断试剂及预后诊断试剂。
[0040]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0041]
实施例1制备探针
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i-durva-f(ab’)2[0042]
将200μg完整的durva与200u的ides蛋白酶在37℃的消化缓冲液(20mm磷酸钠，10mm氯化钠，ph＝6.5)中孵育120分钟。将消化产物与蛋白a磁珠在室温下孵育2小时后，置于磁力架中1分钟，以分离附着fc片段的珠子和含有f(ab’)2片段的上清液，获得纯化的f(ab’)2片段。
[0043]
124
i是在sumitomo hm-20回旋加速器中通过
124
te(p,n)
124
i反应生产的，将产物加热并收集在预先配置的naoh溶液(10mm，ph＝12)中。在标记之前，将hcl(0.1m，ph＝1)添加到放射性碘溶液中以中和naoh。
[0044]
随后，将10
×
pbs(0.1m，ph＝7.4)、durva-f(ab’)2片段溶液(～2mg/ml)和
124
i溶液(111mbq/ml,ph 7.07.2)加入预涂100μg iodogen的碘化管中。在室温下孵育15分钟，每5分钟轻轻摇动一次。
124
i-durva-f(ab’)2通过预平衡的pd-10脱盐柱纯化并用pbs洗脱到离心管中，每个离心管收集0.5ml级分并γ计数器计数。
[0045]
实施例2探针
124
i-durva-f(ab’)2质控和稳定性试验
[0046]
sds-page采用12％的非还原凝胶凝胶在120v的电压下进行1小时，各泳道加样顺序如图2所示，之后在室温(rt)下用考马斯亮蓝进行染色。如图3-9所示，hplc在agilent 1260 infinity ii系统上进行色谱柱型号为：tosoh bioscience tskgel g3000swxl(7.8mm x 30cm)。质谱分析采用waters bioaccord质谱仪进行。
[0047]
sds-page结果表明(图2)，完整的durvalumab单克隆抗体位于大约150kda处，这非常接近理论分子量，纯化后，在加入durva-f(ab’)2的泳道中观察到约100kda的单独条带，而且生成的durva-f(ab’)2具有优异的体外稳定性，相应的泳道中，durva-f(ab’)2的条带清晰可见，在制备24小时后与制备完成时并无明显差别。随后，质谱结果(图4)证实durva-f
(ab’)2的分子量为98.544kda。sec-hplc分析显示durva-f(ab’)2的保留时间为8.2至9.3分钟的主峰。使用itlc分析了标记后的
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i-durva-f(ab’)2的放射化学纯度(图5)和标记稳定性(图6-9)。标记产物放化纯高(96％以上)，比活度约为3.0gbq/μmol。为了证明
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i-durva-f(ab’)2的稳定性，探针在pbs或fbs中于37℃孵育24小时或72小时。itlc的结果表明，即使孵育72h，
124
i-durva-f(ab’)2的放射化学纯度仍然＞92％。
[0048]
实施例3探针
124
i-durva-f(ab’)2的生物分布试验
[0049]
在注射探针
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i-durva-f(ab’)2的后4小时、12小时、24小时、48小时和72小时进行生物分布实验。
[0050]
麻醉下摘除眼球取血后处死小鼠，取主要组织器官(心、肺、肝、脾、胃、肠、肾、大脑、肌肉、肿瘤)在对取出的组织和器官称重并放射性计数后，每个器官或组织的放射性表示为％id/g，结果如图10、表1所示。
[0051]
如图4所示，肿瘤于注射
124
i-durva-f(ab’)2后12小时对探针的摄取达到峰值(约为5.29
±
0.42％id/g)，之后仍然保持相当的放射性活度。在正常器官组织中，血液具有最高的活性水平，并且随着时间的推移逐渐降低(从4h时的24.95
±
1.34％id/g到72h时的5.07
±
0.29％id/g，n＝3)，这表明该核素分子探针具有良好的血液稳定性。除了血液以外，肾脏的放射性摄取在诸多器官脏器中最高，提示了该核素分子探针通过肾脏排出。
[0052]
表1 4-72小时
124
i-durva-f(ab’)2的生物分布变化表(％id/g)
[0053][0054]
综上所述，本发明所述探针
124
i-durva-f(ab’)2显著减少分子量，由全抗约146.3kda的分子量减少到了约100kda左右，加速了探针在体内的清除速度，有利于临床转化，4h即可获得可供诊断的图像，12小时显像效果最好，而完整抗体在24小时才能提供可以诊断的图像，最好的现象时间约在96小时。同时，肝脏、骨骼的本底非特异性摄取明显降低，而这两个部位又是较易出现原发或转移癌灶的部位，因此探针
124
i-durva-f(ab’)2的特性对满足转移或原发病灶位置位于这部分的患者有着较大的临床意义
[0055]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。