鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的菌株水平计数引物及其活菌计数方法

sybr qpcr master mix进行扩增，扩增的qpcr反应体系见表1，qpcr扩增程序见表2，扩增区在鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301中的拷贝数为2；记录ct值，利用下面活菌数计算公式计算鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的活菌数：
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表1 qpcr反应体系
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表2 qpcr扩增程序
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步骤(1)中，细菌基因组dna快速提取试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司生产的试剂盒。
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步骤(2)中，2*aceq universal sybr qpcr master mix由南京诺维赞生物科技有限公司提供。
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步骤(2)中，扩增长度限制在300bp之内。
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本发明方法先进科学，通过本发明，本发明将扩增长度限制在300bp之内，设计了鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的菌株特异性计数引物对(y3f:ttcaagcagtccaatccgca；y3r:accaagttcggaggcaatgat；拷贝数：2)；通过绘制标准曲线(y＝-3.3357x 44.983)，经干扰扩增证明，该引物对能够对鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301进行特异性计数；通过pma添加，能够对鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301实现菌株水平的活菌计数。
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操作流程为：取500μl菌悬液于1.5ml离心管中，加入pma使其终质量浓度为50μ
mol/l，充分混匀后，将其置于黑暗中孵育15min，保证pma可以进入死菌中；然后将离心管打开放在冰上，在500w卤素光源下20cm处曝光15min，使pma与细菌dna尽可能地结合完全；随后10000r/min离心10min，取沉淀收集菌体，180μl 20mg/ml的溶菌酶处理2h，20μl 20mg/ml蛋白酶k处理30min，采用细菌基因组dna快速提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取dna。
[0019]
将dna样品进行10倍梯度稀释(稀释次数为n)作为模板，2*aceq universal sybr qpcr master mix(南京诺维赞生物科技有限公司)进行扩增(见表1、表2)，记录ct值，通过活菌数计算公式计算鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的活菌数。
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有益效果：
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通过菌株特异性的计数专用引物，将计数水平提高至菌株级；通过优化dna提取流程，提高dna提取效率；通过添加pma，去除死菌干扰，最终实现针对鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的菌株水平的活菌计数。
[0022]
本发明实现特异性菌株(针对lactobacillus rhamnosus hsryfm 1301)的菌株水平计数，能够在混菌体系中对目的菌株进行计数，具有市场实施的可能性和较好的预期经济效益。
附图说明
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图1为图1鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301计数质粒pmd-y3的标准曲线；
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图2为干扰菌株dna的加入对目标菌株qpcr计数的影响；
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图3为三种dna提取方法得到的ct值大小比较；
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图4为鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301菌悬液取样量对dna提取的影响；
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图5为溶菌酶处理对鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301dna提取的影响；
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图6为蛋白酶k处理对鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301dna提取的影响；
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图7为pma浓度对死亡鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的屏蔽效果的影响；
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图8为曝光时间对死亡鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的屏蔽效果的影响；
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图9为pma对鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301死菌和活菌混合液的屏蔽效果；
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注：50％活菌与100％活菌ct值相差1左右，表明已屏蔽活菌；
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图10为pma-qpcr对鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301活菌的选择计数。
具体实施方式
[0034]
下面结合附图以及附图说明对本发明做进一步说明。
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混菌培养体系中的鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301菌株水平活菌计数；
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(1)引物设计和标准曲线绘制；
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引物对为y3f:ttcaagcagtccaatccgca；
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y3r:accaagttcggaggcaatgat；
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扩增区在鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301中的拷贝数为2。
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将鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的y3扩增片段克隆至pmd19-t载体，构建重组质粒pmd-y3。用hindiii酶切后测得浓度为47.85ng/μl；计算得拷贝数为1.564
×
10
13
个/ml。标准曲线方程为：y＝-3.3357x 44.983(图1，扩增效率(e)为0.986，相关系数(r2)为99.88％)。
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(2)计数引物特异性验证；
[0042]
选取了3株鼠李糖乳杆菌菌株(鼠李糖乳杆菌lgg，鼠李糖乳杆菌lv108，鼠李糖乳杆菌hn001)和5株其他乳酸菌菌株(瑞士乳杆菌r0052，发酵乳杆菌cect5716，植物乳杆菌grx16，嗜酸乳杆菌ncfm，干酪乳杆菌shirota)作为代表性干扰菌株，取鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 dna 10倍浓度的干扰dna进行qpcr试验。这8株乳酸菌基因组dna作为干扰加入鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 dna进行qpcr反应后所产生的ct值与无干扰dna所产生的ct值无显著性差异(p》0.05)，表明引物具有菌株特异性(图2)。
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(3)dna提取流程优化；
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利用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒、细菌组dna快速提取试剂盒和dnazol提取法进行基因组dna提取工作，随后进行qpcr扩增，得到相应的ct值。从图3可以看出，用dnazol提取法所得到的ct值最大，dna柱式提取法次之，而快速抽提法最小(图3)。根据实时荧光定量pcr的原理可知，ct值越大，说明所含目的基因越少，及dna含量越低。因此，选用dna快速抽提法提取dna。通过比较不同采样体积、溶菌酶浓度、蛋白酶是否添加时的ct值，确定提取流程为取500μl菌悬液于1.5ml离心管中(图4)，10000r/min离心10min，取沉淀收集菌体，180μl 20mg/ml的溶菌酶处理2h(图5)，20μl20mg/ml蛋白酶k处理30min(图6)，采用细菌基因组dna快速提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取dna(图3)。
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通过比较不同pma浓度、曝光时间时的ct值，确定pma处理条件为取500μl菌悬液于1.5ml离心管中，加入pma使其终质量浓度为50μmol/l(每个浓度n＝3)，充分混匀后，将其置于黑暗中孵育15min，保证pma可以进入死菌中；然后将离心管打开放在冰上，在500w卤素光源下20cm处曝光15min(图4)；活菌计数未受影响，死菌屏蔽率达到99.98％。
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(4)qpcr
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将鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301与其它鼠李糖乳杆菌混合培养，按上述流程进行pma处理和dna提取，将dna样品进行100倍稀释作为模板，采用2*aceq universal sybr qpcr master mix(南京诺维赞生物科技有限公司)进行qpcr(表1，表2)，记录ct值，计算鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的活菌数。计算公式：
[0048][0049]
经计算，可获得鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301在指数期、稳定期和衰亡期的活菌数(图10)。