肺纤维化体外模型的构建方法与流程

技术特征：
1.基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)获取肺组织，用生理盐水清洗去除血水、周围血管、脂肪和筋膜，然后将肺组织剪碎，获得均匀的组织碎块；(2)将组织碎块置于trypsin或iv型胶原酶中，在37
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0.5℃条件下摇晃消化，时间40～180min，获得均匀的消化细胞小团块；(3)用2倍hbss终止消化后离心3～5min，收集细胞沉淀；(4)将步骤(3)中的细胞进行红细胞裂解处理后，进行活细胞计数，然后按105～106个细胞/毫升的比例种胶滴，在37
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0.5℃条件下孵育20～30min等胶滴凝固后，加入类器官培养基，培养6～10天后进行类器官传代；(5)将步骤(3)中的细胞进行红细胞裂解处理后，进行活细胞计数，然后按105～106个细胞/毫升的比例转移至培养皿中，获得贴壁培养的成纤维细胞，培养6～8天后进行成纤维细胞传代；(6)肺类器官的纤维化模型的构建方法，具体步骤包括：(a)将步骤(4)中的类器官，用tryple express重新消化3～10min后种胶滴，按5000～10000个细胞/10ul胶滴培养至96孔板的一个孔中，加入类器官培养基培养1～2天；(b)类器官培养1～2天后，将类器官培养基更换为含5～50ng/ml tgf-β1的类器官培养基处理48～72h，进行类器官的纤维化诱导，构建肺类器官纤维化模型；(7)成纤维细胞-肺类器官共培养体系的纤维化模型的构建方法，具体步骤包括：(a)使用步骤(5)中的成纤维细胞与肺类器官进行共培养，成纤维细胞数量为类器官的1～10倍，用类器官培养基重悬上述混合细胞并转移至低吸附96孔u型培养板中，培养1～2天。(b)培养1～2天后，将上述成纤维细胞-共培养类器官的培养基换为含5～50ng/ml tgf-β1的肺类器官培养基处理48～72h，进行类器官的纤维化诱导，构建成纤维细胞-肺类器官共培养体系的纤维化模型；(8)成纤维细胞-免疫细胞-肺类器官共培养体系的纤维化模型的构建方法，具体步骤包括：(a)将成纤维细胞、免疫细胞和肺类器官三种细胞进行共培养，其中成纤维细胞的数量设置为类器官的1～10倍，免疫细胞的数量设置为类器官的1～20倍，由于地塞米松对免疫细胞的激活具有抑制作用，用去除地塞米松的类器官培养基重悬上述混合细胞并转移至低吸附96孔u型培养板中，培养1～2天；所述的免疫细胞为巨噬细胞或t细胞；(b)培养1～2天后，将上述成纤维细胞-免疫细胞-肺类器官的培养基换成含5～50ng/ml tgf-β1或含3～20ug/ml blm且去除地塞米松的肺类器官培养基处理48～72h,进行类器官的纤维化诱导，构建成纤维细胞-免疫细胞-肺类器官共培养体系的纤维化模型。2.根据权利要求1所述的基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于步骤(2)中，trypsin的质量浓度为0.25％。3.根据权利要求1所述的基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于步骤(4)中，种胶滴使用matrigel和dmem/f12的混合液，matrigel为dmem/f12的1.5～2倍。4.根据权利要求1所述的基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于步骤(4)、(6)、(7)和(8)中，类器官培养的培养基成分包括dmem/f12基础培养基，100x的n2，
50x的b27，1％的p/s，1～5mm的glutamax，0.2～1μm的monothioglycerol，1～10μm的chir99021，100～500ng/ml的r-spondin-1，1～50ng/ml的human fgf10，1～50ng/ml的human kgf，20～100nm的dexamethasone，0.05～0.3mm的8-bromo-camp和0.05～0.3mm的ibmx，还有5～20ng/ml的bmp4和20～100nm的all-trans retinoic acid。5.根据权利要求1所述的基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于步骤(5)中，进行成纤维细胞贴壁培养前，培养皿用质量浓度为0.1～0.2％的gelatin在37
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0.5℃包被30～60min。6.根据权利要求1所述的基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于步骤(5)中，进行成纤维细胞贴壁培养时，培养基成分包括dmem basic基础培养基，1％的p/s，1～5mm的glutamax,1～5mm的neaa,10～20％的fbs,以及5～20ng/ml的human fgf2。7.根据权利要求1所述的基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于步骤(5)中，在培养时的前24h在培养基中添加10um的y-27632。8.根据权利要求1所述的基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于步骤(6)中，进行纤维化诱导的体系为肺类器官体系。9.根据权利要求1所述的基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于步骤(7)中，进行纤维化诱导的体系为成纤维细胞和类器官的共培养体系。10.根据权利要求1所述的基于肺类器官的肺纤维化体外模型的构建方法，其特征在于步骤(8)中，进行纤维化诱导的体系为成纤维细胞、免疫细胞和类器官的共培养体系。

技术总结
类器官肺纤维化体外模型的构建方法，步骤包括：(1)获取肺组织，清洗、剪碎；(2)置于trypsin或IV型胶原酶中，摇晃消化获得细胞小团块；(3)用2倍HBSS终止消化，离心收集细胞沉淀；(4)进行红细胞裂解处理后，一部分细胞种胶，胶滴凝固后加入类器官培养基进行类器官培养，另一部分细胞用成纤维细胞培养基贴壁培养，获得成纤维细胞；(5)肺类器官纤维化模型的构建；(7)成纤维细胞-肺类器官共培养体系的纤维化模型的构建；(8)成纤维细胞-免疫细胞-肺类器官共培养体系的纤维化模型的构建。本发明的方法为肺纤维化疾病机制的研究、新药研发、药物敏感性检测和临床前患者反应性监测提供更有利的支持。更有利的支持。更有利的支持。


技术研发人员：邹欢 朱宇 兰坚强 黄敏
受保护的技术使用者：创芯国际生物科技（广州）有限公司
技术研发日：2022.04.25
技术公布日：2022/8/12