一种基于类沸石咪唑酯骨架材料的固定化酶催化膜及其制备与应用

1.本发明涉及一种基于金属有机骨架的固定化酶纳米纤维膜及其制备方法，属于膜材料领域。


背景技术：

2.蛋白水解是指蛋白质降解为较小分子量的多肽或氨基酸的过程，其中，采用生物酶对蛋白进行水解具有高效温和的特点，已成为蛋白质分析、鉴定以及功能化蛋白肽生产的重要手段。与游离酶相比，固定化酶可以增强酶的稳定性，可重用性，并促进产物在线分离。载酶功能膜将酶水解与膜过程耦合，不仅可以实现酶的固定化，还可以实现产物的在线分离，避免产物抑制作用，从而提高酶催化的效率，但仍存在酶活性易在载酶过程中被破坏，载酶后膜传质阻力过高，难以发挥动态过滤优势等问题。因此，载酶功能膜多集中于小分子底物的水解研究，如微污染物、糖类等。在蛋白水解体系中，由于底物分子尺寸较大，若要达到较好的水解效果，需要保证酶的高反应活性，同时，蛋白分于在膜通道内扩散阻力较大，因此对催化膜传质通道设计提出了更高的要求。
3.金属-有机骨架材料(mofs)是一类新型纳米功能材料，由金属离子与有机配体经配位键结合而形成的立体网络结构，具有种类多、功能性强、孔隙率和比表面积大、孔尺寸可调控性强等优点，为酶的固定化提供了新思路。沸石咪唑酯骨架材料(zifs)为金属有机框架材料中一类特殊的子类，是由zn
2
，co
2
等金属离子与咪唑类有机分子配位形成，其中，zif-8是最具代表性的zifs材料，具有较好的热稳定性和化学稳定性、高比表面积、丰富的活性位点、较高的生物相容性与更低的毒副作用，已被用于载酶、药物递送以及生物体内标志物检测等领域。zif-8结构中含有zn
2
活性位点，可对酶类分子进行螯合吸附，同时对酶催化生物反应过程具有促进作用，且其制备方法简单温和，可在室温下进行快速合成。
4.纳米纤维膜由纳米纤维无规排列堆叠形成，具有分布相对均匀的三维网状孔结构，常采用静电纺丝法制备，纳米纤维膜具有比表面积大、孔隙率高、纤维尺寸可调控等优点，在膜过滤过程中具有较低的传质阻力。本发明基于类沸石咪唑酯骨架材料，将混有用于制备zif-8的锌盐的纳米纤维膜作为基膜，将zif
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8原位生长于纤维表面，形成包覆于纤维表面的zif-8功能层，而后通过吸附作用将蛋白酶固定至膜表面及内部，制备载酶功能膜。迄今为止，基于类沸石咪唑酯骨架材料的固定化酶催化膜的制备及其蛋白水解应用，尚未见文献报道。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明提供一种基于类沸石咪唑酯骨架材料的固定化酶催化膜及其制备方法与应用。本发明提供的制备方法简单易操作，绿色环保，zif-8具有稳定酶结构与促进酶活性的作用，且原位生长的zif-8 功能层均匀包裹于纤维表面，载酶吸附位点暴露率高。催化膜以纳米纤维膜为基膜，具有较高的比表面积与孔隙率，利于底物与酶的接触且底物
与产物在膜表面及孔内传质速率高，有利于在动态过滤过程中获得高效的蛋白水解性能。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.一种基于类沸石咪唑酯骨架材料的固定化酶催化膜，包括混有锌盐的纳米纤维基膜，包覆于纤维表面的类沸石咪唑酯骨架材料功能层和吸附于功能层上的蛋白酶；所述纳米纤维基膜由锌盐与聚合物共混组成，采用静电纺丝法制得；所述类沸石咪唑酯骨架材料原位生长于纤维表面，形成均匀包裹于纤维表面的功能层；所述蛋白酶与类沸石咪唑酯骨架材料通过螯合吸附固定于功能层表面，酶暴露面积高，载酶量可达0.35
±
0.09mg/cm2。
8.所述的固定化酶催化膜具有贯通网络状孔通道结构，膜平均孔径0.1-5.0μm，孔隙率为70-90％，膜传质阻力低，酶与底物的接触几率高，同时类沸石咪唑酯骨架材料功能层具有稳定酶结构与促进酶活性的特点，可在动态过滤过程中获得高效的蛋白水解性能。
9.本发明基于类沸石咪唑酯骨架材料的固定化酶催化膜的制备方法包括以下步骤：
10.步骤1、含锌盐纳米纤维基膜的制备：将聚合物与锌盐共混溶解制备膜铸膜液，聚合物与锌盐的配比为 95/5～50/50，浓度之和10-50％，而后采用静电纺丝法制备纳米纤维基膜；
11.步骤2、类沸石咪唑酯骨架材料功能层的原位生长：将步骤(1)中得到的静电纺丝纳米纤维基膜浸入浓度为0.1-2.0mol/l的2-甲基咪唑甲醇溶液中，原位生长2-24h后，得到纤维表面包裹有类沸石咪唑酯骨架材料功能层的功能膜；
12.步骤3、蛋白酶的吸附固载：将步骤(2)中得到的功能膜浸入0.2-5.0wt％的蛋白酶溶液中，水浴振荡吸附10h后，得到酶固定化催化膜。
13.优选地，所述的聚合物为乙烯-乙烯醇共聚物、聚乳酸或聚醚砜中的至少一种。
14.优选地，所述的锌盐为氯化锌、硝酸锌和乙酸锌等中的一种。
15.优选地，所述的铸膜液共混方式与静电纺丝成膜方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
16.优选地，所述的蛋白酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶等中的一种。
17.进一步的，本发明还涉及一种基于类沸石咪唑酯骨架材料的固定化酶催化膜的应用，所述固定化酶催化膜应用于动态过滤过程中的蛋白质催化水解。
18.与现有技术相比，本发明的优点在于：
19.(1)采用类沸石咪唑酯骨架材料为中间载体，利用zif-8结构中含有zn
2
活性位点，可对酶类分子进行螯合吸附，zif-8对酶催化生物反应过程具有促进作用，具有稳定酶结构与促进酶活性的双重作用；
20.(2)沸石咪唑酯骨架材料原位生长于纤维表面，形成均匀包裹于纤维表面的功能层，载酶吸附位点暴露率高，有利于提高载酶量，同时负载后的酶与底物接触几率高，有利于提高膜催化性能；
21.(3)采用具有高度多孔结构的静电纺丝纳米纤维膜为基膜，载酶后膜仍保留该特性，具有高比表面积与高孔隙率，底物与产物在膜表面及孔内传质速率高，有利于在动态过滤过程中获得较高的蛋白水解性能；
22.(4)制备过程简便可控，反应条件温和。
附图说明
23.图1对比例1中制得的未生长zif-8功能层的酶固定化膜表面sem图；
24.图2实施例1中制得的固定化酶催化膜表面sem图；
25.图3实施例2中制得的固定化酶催化膜表面sem图；
26.图4对比例1与实施例1-2的膜bsa水解sds-page图。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明提供的基于类沸石咪唑酯骨架材料的固定化酶催化膜的制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
28.对比例1
29.(1)将20wt％的乙烯-乙烯醇共聚物，65wt％的二甲基亚砜与15wt％的乙酸锌在70℃条件下搅拌溶解，静置脱泡12h后采用静电纺丝法制备纳米纤维基膜；
30.(2)将步骤(1)中得到的纳米纤维膜浸入2g/l的胰蛋白酶溶液中，水浴振荡10h。取出后纯水洗涤，得到未生长zif-8功能层的酶固定化膜。
31.对对比例1制得的未生长zif-8功能层的酶固定化膜表面以及纤维表面进行sem表征，结构如图1所示。膜表面开孔明显，膜具有贯通孔结构，纤维表面光滑。
32.对对比例1制得的未生长zif-8功能层的酶固定化膜的平均孔径、孔隙率、载酶量与动态过滤过程中 bsa水解度进行测试，结果如表1所示，其中bsa水解sds-page图如图4所示。
33.实施例1
34.(1)将20wt的乙烯-乙烯醇共聚物，65wt％的二甲基亚砜与15wt％的乙酸锌在70℃条件下搅拌溶解，静置脱泡12h后采用静电纺丝法制备纳米纤维基膜；
35.(2)将步骤(1)中得到的含有乙酸锌的纳米纤维基膜浸入0.4mol/l的2-甲基咪唑溶液中原位生长8h，得到zif-8功能化纤维膜；
36.(3)将步骤(2)中得到的zif-8功能化纤维膜浸入2g/l的胰蛋白酶溶液中，水浴振荡10h，取出后纯水洗涤。得到酶固定化催化膜。
37.对实施例1制得的基于zif-8的固定化酶催化膜表面以及纤维表面进行sem表征，结构如图2所示，膜表面开孔明显，具有明显贯通网络状结构，纤维上可明显观察到包覆有zif-8功能层，蛋白吸附后未影响膜与纤维表面结构。
38.对实施例1制得的固定化酶催化膜的平均孔径、孔隙率、载酶量与动态过滤过程中bsa水解度进行测试，结果如表1所示，其中bsa水解sds-page图如图4所示。
39.实施倒2
40.(1)将15wt％的聚乳酸，75wt％的二甲基亚砜与10wt％的乙酸锌在70℃条件下搅拌溶解，静置脱泡 12h后采用静电纺丝法制备纳米纤维基膜；
41.(2)将步骤(1)中得到的含有乙酸锌的纳米纤维基膜浸入2mol/l的2-甲基咪唑溶液中原位生长4h，得到zif-8功能化纤维膜；
42.(3)将步骤(2)中得到的zif-8功能化纤维膜浸入1g/l的糜蛋白酶溶液中，水浴振荡10h，取出后纯水洗涤，得到酶固定化催化膜。
43.对实施例2制得的基于zif-8的固定化酶催化膜表面以及纤维表面进行sem表征，
结构如图3所示，膜表面开孔明显，具有明显贯通网络状结构，纤维上可明显观察到包覆有zif-8功能层，蛋白吸附后未影响膜与纤维表面结构。
44.对实施例2制得的固定化酶催化膜的平均孔径、孔隙率、载酶量与动态过滤过程中bsa水解度进行测试，结果如表1所示，其中bsa水解sds-page图如图4所示。
45.实施例3
46.(1)将12wt％的聚醚砜，83wt％的二甲基乙酰胺与5wt％的氯化锌在70℃条件下搅拌溶解，静置脱泡 12h后采用静电纺丝法制备纳米纤维基膜；
47.(2)将步骤(1)中得到的含有硝酸锌的纳米纤维基膜浸入0.8mol/l的2-甲基咪唑溶液中原位生长12h，得到zif-8功能化纤维膜；
48.(3)将步骤(2)中得到的zif-8功能化纤维膜浸入0.5g/l的胃蛋白酶溶液中，水浴振荡10h，取出后纯水洗涤，得到酶固定化催化膜。
49.对实施例3制得的固定化酶催化膜的平均孔径、孔隙率、载酶量与动态过滤过程中bsa水解度进行测试，结果如表1所示。
50.实施例4
51.(1)将15wt％的乙烯-乙烯醇共聚物，75wt％的二甲基亚砜与10wt％的硝酸锌在70℃条件下搅拌溶解，静置脱泡12h后采用静电纺丝法制备纳米纤维基膜；
52.(2)将步骤(1)中得到的含有氯化锌的纳米纤维基膜浸入0.1mol/l的2-甲基咪唑溶液中原位生长24h，得到zif-8功能化纤维膜；
53.(3)将步骤(2)中得到的zif-8功能化纤维膜浸入4g/l的木瓜蛋白酶溶液中，水浴振荡10h，取出后纯水洗涤，得到酶固定化催化膜。
54.对实施例4制得的固定化酶催化膜的平均孔径、孔隙率、载酶量与动态过滤过程中bsa水解度进行测试，结果如表1所示。
55.表1固定化酶催化膜性能测试
[0056] 膜平均孔径(μm)膜孔隙率(％)载酶量(mg/cm2)bsa水解度(％)对比例10.5850.05
±
0.0110.6
±
0.2实施例10.2800.35
±
0.0996.3
±
0.6实施例20.5750.30
±
0.0290.8
±
0.5实施例32.0850.25
±
0.0377.3
±
0.3实施例43.0850.29
±
0.0583.9
±
0.6
[0057]
性能测试
[0058]
(1)膜电镜观察
[0059]
采用日本日立s-4800型仪器进行测试，加速电压为10kv。样品检测前，进行喷金处理以提高其导电性。
[0060]
(2)膜表面孔径
[0061]
采用cpf-1100-a孔径分析仪对膜的孔径进行测试，孔径分析仪通过测定一定压力下膜的气通量计算膜的孔径，并通过逐级升压的方法测试膜的孔径分布将干燥好的膜放入16-tension dynamic中充分浸润，取出放入孔径分析仪，在浸润状态下升压在干燥状态下减压的方式测试孔径，通过孔隙参数方程(式1)计算出膜平均孔径。
[0062][0063]
式中，d为孔隙直径(m)，y为液体的表面张力(mn/m)，θ为接触角(g)，p为压差(mpa)。
[0064]
(2)膜载酶量
[0065]
配制不同浓度的蛋白酶标准液(0-1mg/ml)，通过紫外-可见光光度计法测定其在波长280nm处的吸光度值，以酶浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，利用线性拟合得到蛋白酶标准曲线，通过测定反应前后上清液的吸光度值，根据标准曲线计算其酶浓度，并根据式(2)计算载酶量：
[0066][0067]
式中，c为吸附后酶浓度，c0为吸附前酶浓度，v为蛋白酶溶液体积，s为膜面积。
[0068]
(3)bsa水解度
[0069]
将一定量bsa蛋白溶解于磷酸缓冲液中，配置浓度为1g/l的bsa溶液，将固定化酶纳米纤维膜置于过滤装置中，收集透过膜的溶液，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sds-page)对蛋白水解产物进行分析，使用tanon 1600型凝胶成像仪对染色后的凝胶进行分析，其中蛋白质浓度越大，其条带的净光密度则越大。根据蛋白条带的净光密度，通过式(3)计算蛋白水解度；
[0070][0071]
式中，i0为反应前蛋白sds-page净光密度值：a为反应后蛋白sds-page净光密度值。