基于壳寡糖的非病毒基因药物载体及其制备方法

1.本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种基于壳寡糖的非病毒基因药物载体及其制备方法。


背景技术：

2.基因治疗通过纠正或补偿遗传缺陷的方法来改善乃至治疗某些疾病，比如取代病变细胞中的突变基因来治疗血友病、大疱性表皮松解症、囊性纤维化等诸如此类的遗传性疾病，或者向靶细胞递送遗传物质来治疗遗传病。研究发现，基因药物自身在体内很容易降解，所以为了有效地将基因药物递送至靶细胞，开发安全高效的载体体系是十分必要的。目前基因递送载体体系主要分为病毒载体和非病毒载体两类，非病毒载体以成本低、制备简单、生物相容性好的优点被广泛应用，非病毒载体通过增强核酸物质的容纳性，延长体内的循环周期，从而提高治疗效果。然而仅靠单纯的非病毒载体，负载货物的能力有限，靶向性也不足，需要引入新的配体与之进行修饰，改善递送系统的持续释放和靶向性能。
3.壳聚糖是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物，具有很好的生物相容性和生物降解性。壳聚糖对生物大分子类药物和核酸类物质具有保护作用，然而众所周知，作为共聚体的亲水片段，壳聚糖主要存在两个缺陷：一个是阳离子聚合物自身毒性较大，另一个是在生理ph 7.4时的水溶性差。而低分子量壳聚糖，也就是壳寡糖既能有壳聚糖的优势，又很好的规避潜在的劣势。


技术实现要素：

4.目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于壳寡糖的非病毒基因药物载体及其制备方法，该载体是可用于细胞中基因药物输送的非病毒载体。本发明的自组装纳米递送系统通过将重复单元1-20的壳寡糖通过交联剂胱胺二丙烯酰胺连接形成聚合物，提高基因药物进入靶细胞的效率。
5.技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
6.一种基于壳寡糖的非病毒基因药物载体(cso-cba)，其化学结构式如下：
[0007][0008]
其中，m为1-20的正整数，x为正整数。
[0009]
本发明还提供了上述基于壳寡糖的非病毒载体的制备方法，包括如下步骤：由壳寡糖和胱胺二丙酰胺通过迈克尔加成方法获得，壳寡糖和胱胺二丙酰胺的摩尔比为1:0.2-1:1.2，壳寡糖重复单元数为1-20。
[0010]
壳寡糖表面有丰富的功能基团，可以包裹或吸附目的基因，它的修饰位点主要是伯胺和羟基，可以通过酰胺化或酯化、环氧-胺/羟基偶联、席夫碱形成和迈克尔加成等方法对其进行化学改性，在这里选择了迈克尔加成法进行伯胺修饰。修饰后的壳寡糖可与基因有更好的结合，交联后的壳寡糖/基因复合物经内吞进入细胞，可在细胞还原环境下响应性降解，能更好地释放基因。同时与交联剂胱胺二丙烯酰胺组装，能增加链长，而且经过修饰的壳寡糖与pdna结合稳定性提高，从而提高转染效率，在l929、a549、4t1和nih/3t3细胞转染中均得到很好地验证。
[0011]
具体的，包括以下步骤：
[0012]
(1)壳寡糖(cso)，用无水dmso室温下溶解，加入三乙胺，搅拌均匀，得壳寡糖的dmso溶液；(三乙胺是为了去掉壳寡糖中的酸根离子，优选的，cso和三乙胺的摩尔比为1：3)
[0013]
(2)将胱胺二丙烯酰胺，用无水dmso室温下溶解，得胱胺二丙酰胺的dmso溶液；
[0014]
(3)将步骤(1)的壳寡糖的dmso溶液和步骤(2)的胱胺二丙酰胺的dmso溶液室温下混合均匀，转移至耐压瓶中，在反应温度下进行迈克尔加成反应(反应条件优选60℃油浴24小时)，反应结束后调节ph去掉多余的铵根离子(ph优选为4)，接着用分子量截留值3500的透析袋纯水透析，冻干后得成品cso-cba。
[0015]
反应式如下：
[0016][0017]
上述胱胺二丙烯酰胺(cba)的合成：胱胺二盐酸盐的水溶液、丙烯酰氯的二氯甲烷溶液和氢氧化钠在冰浴下滴定混匀，接着室温搅拌6小时得到胱胺二丙烯酰胺粗品，再通过萃取、旋蒸和干燥等一系列方式得到纯品。
[0018]
有益效果：本发明以壳寡糖(重复单元1-20)为基础，使用交联剂胱胺二丙烯酰胺通过michael加成连接形成复合物后(壳寡糖和胱胺二丙酰胺的摩尔比为1:0.2-1:1.2)，可与质粒pdna在静电力的作用下组装。该基于壳寡糖的基因载体在l929、a549、4t1和nih/3t3细胞中均能将核酸物质递送至胞内，转染效果明显。
附图说明
[0019]
图1是本发明依照实施方式例2合成的壳寡糖载体cso-cba的傅里叶红外光谱图。
[0020]
图2是本发明依照实施方式例4制备cso-cba载体与pdna自组装纳米粒结果图；
[0021]
图3是本发明依照实施方式例5的方法做出的非病毒载体cso-cba生物相容性的表征：(a)cso-cba的细胞毒性测试。(b)cso-cba的溶血实验；
[0022]
图4是本发明按照实施方式例6针对l929、a549、4t1和nih/3t3细胞的转染效果的表达。
具体实施方式
[0023]
本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0024]
本发明下面结合实施例作进一步详述：
[0025]
基于壳寡糖的非病毒载体cso-cba的制备方法如下：将胱胺二盐酸盐和丙烯酰氯合成得到胱胺二丙酰胺，接着与壳寡糖通过迈克尔加成反应连接，再通过调节ph，透析冻干后得到纯品cso-cba载体。
[0026]
自组装纳米共递送系统均是新鲜制备，制备方案具体如下：将pdna溶液在涡旋状态下逐滴加入等体积的cso-cba载体溶液中，涡旋混匀，室温放置20min，便得到cso-cba/pdna。
[0027]
上述非病毒纳米载体可用于细胞中基因输送。
[0028]
实施例1
[0029]
cso-cba的合成：
[0030]
取cso粉末160mg(分子量970da)，加入0.5ml无水dmso和413ml三乙胺溶解(cso和三乙胺的摩尔比为1：3)。取cba粉末52mg，加入适量1mldmso溶解，缓慢加入cso溶液中(cso和cba的摩尔比为1:1.2)，所有操作均在25℃环境下进行。接着将溶液ph调为4，放入耐压瓶中60℃油浴24小时。使用分子量截留值为3500的透析袋进行透析，真空冷冻干燥后得到纯品cso-cba载体，收率为18％。
[0031]
实施例2
[0032]
cso-cba聚合物的结构鉴定。
[0033]
cso-cba聚合物通过傅里叶红外光谱来鉴定结构。图1显示，cso-cba中属于cba的碳碳双键特征峰消失，说明cso-cba的成功合成。
[0034]
实施例3
[0035]
壳寡糖载体与pdna自组装纳米粒的制备。
[0036]
制备方案如下所述：pdna溶液处于涡旋状态，将cso-cba溶液缓慢逐滴加入，再一次涡旋将其混匀，室温放置20min即可。
[0037]
实施例4
[0038]
自组装纳米粒的成纳米结果表征。
[0039]
cso-cba/pdna的成纳米结果通过琼脂糖凝胶电泳来表征。采用1％的琼脂粉制备的凝胶，电解质选用tae缓冲液，将cso-cba与pdna以五种不同质量比结合，添加烯释液和上样显色剂，最终总体积统一为12ul。上样，通电，110v，30min。图2显示不同质量比的cso-cba均与pdna成功结合在上样孔处，说明自组装纳米粒的成功合成。
[0040]
实施例5
[0041]
cso-cba自组装纳米递送系统的生物相容性表征。
[0042]
将正常培养的nih/3t3细胞用pbs清洗、胰酶消化后，1500rpm离心3min沉淀细胞，之后使用细胞计数板计数，将细胞以8000个/ml的密度接种于96孔板中，37℃、4％co2，孵育12小时。弃去旧培养基，加入培养基烯释的不同浓度的cso-cba样品(0、10、20、30、50、100μg/ml)，以1％的曲拉通作为阳性对照，每个样设置4个复孔。相同孵育条件下再次培养24小时。每孔加入20μl的mtt溶液，4h培养后弃去孔内液体，加入无水dmso，摇床培养5min后，使用酶标仪测定od
570nm
。图3(a)中nih/3t3细胞形态没有发生改变，数量没有发生减少，数据显示cso-cba对nih/3t3细胞的毒性很低，样品在低浓度时也有细胞增殖迹象。
[0043]
从正常小鼠的眼眶静脉中取出新鲜血液，用抗凝管收集。冷冻离心机2000rpm，4℃条件下离心10min，收集红细胞。取300μl预冷的ph 7.4的pbs清洗红细胞3次，4℃，2000rpm离心5min，再次弃上清。然后往处理好的红细胞加入ph 7.4的pbs，配置成20％的红细胞悬液。1％的曲拉通和ph 7.4的pbs分别作为阳性对照和阴性对照。cso-cba用ph 7.4的pbs烯释成浓度为20、50、100、200、400、800μg/ml的样品。往准备好的1ml的阴性对照、阳性对照、6个浓度梯度的样品中各加入20μl 20％的红细胞悬液。之后在37℃条件下孵育2小时。最后将这些样品4℃，2000rpm离心10min并拍照。图3(b)显示cso-cba的溶血率均低于5％，说明红细胞没有发生破裂溶解现象，该载体生物相容性好。
[0044]
实施例6
[0045]
cso-cba/pdna对l929、a549、4t1和nih/3t3细胞的转染效率研究。
[0046]
将正常培养的l929细胞用pbs清洗、胰酶消化后，1500rpm离心3min沉淀细胞，之后使用细胞计数板计数，将细胞以106个/ml的密度接种于24孔板中，37℃、4％co2，孵育16小时左右。将pdna在涡旋状态下加入等量的cso-cba溶液中，涡旋混匀，放置20min后替换24孔板中原先培养液，继续孵育4小时后再替换成新鲜的细胞培养基。24小时后对每个孔采用倒置荧光显微镜进行拍照。a549、4t1和nih/3t3细胞采用相同方法操作。图4显示cso-cba载体在l929、a549、4t1和nih/3t3细胞的转染效果比单纯的cso效果好。
[0047]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。