采用侧向层析试纸条对核酸扩增产物检测的装置和方法

1.本发明涉及到属于核酸分析领域的一种核酸扩增反应、检测装置和方法，具体是涉及了一种采用侧向层析试纸条对核酸扩增产物检测的装置和方法。


背景技术：

2.核酸扩增技术，包括聚合酶链式扩增(polymerase chain reaction，pcr)以及各种等温扩增技术，如环介导等温扩增(lamp)、重组酶扩增(rpa)等，是一种灵敏度高、特异性好的检测方法，在医学、农业、食品安全以及环境检测等各个领域都有十分广泛的应用。目前，扩增产物，也称为扩增子的检测多采用荧光检测方法。荧光加检测虽然灵敏度较高，也可以实现扩增产物的实时检测，但是存在仪器成本高，操作复杂等一些问题。
3.侧向层析试纸条，有时也被称为胶体金试纸条，在免疫检测领域已经得到了广泛的应用。胶体金孕检试纸条广泛进入家庭使用。对侧向层析试纸条上的标记物质和检测物质做些简单的修改，也可将其应用于核酸扩增产物的检测。这样就能够实现扩增产物的可视化现场检测。
4.但是，目前利用侧向层析试纸条对核酸扩增产物进行检测，还存在着一些问题：1、在大多数的情况下，核酸扩增在单独的扩增管中进行。之后，利用不同的手段，将扩增管打开或割破，从而将扩增产物加到试纸条的样品垫上进行检测。由于扩增产物的浓度一般较高，将扩增管打开，极易引起扩增产物的气溶胶污染，从而导致后续检测的假阳性。2、已有一些集成系统，将核酸扩增和扩增产物的试纸条检测集成在一个密闭系统中，或是在一个密闭的系统中打开扩增管，但是，这样系统一般需要泵，阀，刀片等装置，比较复杂，成本较高。3、对于常见的侧向层析试纸条，为了实现检测，对于一般3-4毫米宽的试纸条，在样品垫上所需添加的溶液需在50微升以上。太少的溶液不利于溶液在层析纸上毛细管运动，无法将足够的被测分子运送到t线的位置实现检测，从而影响检测结果。而核酸扩增反应体系的体积一般在25微升左右。由于核酸扩增检测的高灵敏性，增大反应体积并不会带灵敏度的明显提高，而反而会增大扩增酶等生物试剂的消耗，从而增加反应成本。因此，在目前很多的核酸扩增产物的试纸条检测中，需要对扩增液进行一定的稀释以有利于后续的层析检测。如何方便的将扩增液和稀释液混合，同时又不带来扩增子的气溶胶污染，也是必须解决的一个问题。针对上述问题，本发明设计了一种采用侧向层析试纸条对核酸扩增产物检测的新装置和方法，可以简化操作步骤，降低对相关仪器的需求，同时有效地提高检测性能。


技术实现要素：

5.为了解决背景技术中存在的问题，本发明提出了一种采用侧向层析试纸条对核酸扩增产物检测的装置和方法，能够提高采用侧向层析试纸条对核酸扩增产物检测时的性能。
6.本发明的技术方案是：
7.一、一种采用侧向层析试纸条对核酸扩增产物检测的装置：
8.所述的装置中包含三个腔室，分别为：
9.用于加入、容纳被测样本溶液的稀释封闭腔，腔体上下竖直布置；
10.用于核酸扩增反应的反应腔，腔内预先放置核酸扩增试剂和溶液，反应腔一端和稀释封闭腔底部之间通过细长的通道连通，且通过竖直布置的通道和外界大气连通；
11.反应腔预先固化核酸扩增所需的全部试剂，包括扩增酶、引物、(dntp)、以及扩增缓冲液成分等。
12.用于层析试纸条检测的混合腔，腔内预先放置核酸侧向层析试纸条，混合腔底部和反应腔另一端之间通过细长的通道连通，且通过竖直布置的通道和外界大气连通。
13.所述的细长是指长度和直径之比大于3以上。
14.在反应腔和混合腔之间的通道中设置用于打开和关闭的阀，阀根据需要开启或关闭通道。
15.所述的稀释封闭腔顶端可设置带有透气结构的管帽。
16.所述的稀释封闭腔的体积大于反应腔的体积。
17.在反应腔和外界大气连通的通道、混合腔和外界大气连通的通道中均设置过滤材料，所述的过滤材料采用滤芯、氧化硅颗粒或者硅胶柱等。
18.在混合腔和外界大气连通的通道中设置用于打开和关闭的阀，阀根据需要开启或关闭通道，通过阀使得液体从反应腔无法经通道流入到混合腔中。
19.反应腔和外界大气连通的通道、混合腔和外界大气连通的通道为水平或者倾斜或者竖直布置。
20.在反应腔和外界大气连通的通道顶端设置柔性薄膜，不设置过滤材料。
21.在混合腔和外界大气连通的通道顶端密封设置柔性薄膜，不设置过滤材料和阀，在反应腔和混合腔之间的通道中不设置阀，在混合腔和外界大气连通的通道顶端、在柔性薄膜之上在设置硬质材料。
22.二、一种应用于上述装置的检测方法：
23.先向稀释封闭腔加入一定量的被测样本溶液，打开稀释封闭腔和反应腔之间的通道，稀释封闭腔内的液面高于反应腔，在静压的作用下，被测样本溶液经过稀释封闭腔和反应腔之间的通道进入到反应腔；此时通过在反应腔和混合腔之间的通道中设置阀并关闭，或者在混合腔和外界大气连通的通道中设置阀并关闭，使得混合腔成为一个气密腔，阻止溶液从反应腔流入混合腔；
24.扩增反应结束后，通过在反应腔和混合腔之间的通道中设置阀并打开，使得打开反应腔和混合腔之间的通道，通过在混合腔和外界大气连通的通道中设置阀并打开，且混合腔经通道和外界大气压相通；稀释封闭腔内的液面高于反应腔和混合腔内的液面，在稀释封闭腔的溶液静压的作用下，反应腔中的溶液就会进入混合腔；由于溶液静压的作用，稀释封闭腔中的未被扩增的样本溶液也通过反应腔并进一步进入到混合腔中，直到稀释封闭腔、反应腔和混合腔中的水压保持平衡为止，即稀释封闭腔、反应腔和混合腔内的液面位于同一水平面。
25.在被测样本溶液进入反应腔后、溶解反应腔中预置的溶液后、扩增反应结束前，在外置或附属的温控装置对反应腔的温度进行控制，进行核酸扩增反应；此时通过通道的几何尺寸控制调节，使得通道中的溶液在没有外力直接作用，且通道两端静压也处于平衡的
条件下，不会发生流动，即稀释封闭腔的被测样本溶液不再在静压的作用下经过通道进入到反应腔，反应腔中的溶质成分只能通过扩散的方式进入通道并进一步进入到稀释封闭腔中。
26.通过在混合腔和外界大气连通的通道顶端设置密封的柔性薄膜，柔性薄膜之上设置硬质材料，使得混合腔经通道和外界大气压无法相通，在扩增反应结束后，撕开硬质材料，通过在反应腔和混合腔之间的通道中设置阀并打开，使得打开反应腔和混合腔之间的通道，使得溶液从反应腔进入混合腔进行层析检测，且同时造成混合腔内原有的气体压缩，柔性薄膜响应向外凸起维持混合腔内的气压和外部气压平衡，反应腔和稀释腔中的溶液能够进入混合腔。
27.本发明的有益效果是：
28.本发明的装置及方法可以实现核酸扩增及其产物的侧向层析检测。整个检测过程中，使用者只需要手动操作两步。第一是向稀释封闭腔中滴加一定量的被测样本溶液；第二是等待一定的核酸扩增时间后，进行一个阀的开启动作，就能完成整个检测过程。通过装置的设计，核酸扩增反应的体积可以控制在数微升到数十微升之间，而这样的体积控制不需要使用移液枪等高精度移液仪器。核酸扩增完成之后，只需要开启一个阀门，就可以完成扩增液的稀释以及添加到层析试纸条的样品垫的工作，不需要任何手工移液步骤，且整个过程是在一个防污染的空间中进行的。
29.同时，在配套仪器的控制下，第二步阀的开启也可以通过仪器自动完成。
30.和已有的方法相比，本发明的装置和方法具有操作简单、性能好的优势。
附图说明
31.图1是本发明装置的结构示意图。1、基板，2、稀释封闭腔2，3、通道，4、反应腔4，5、阀，6、通道，7、混合腔7，8、过滤材料，9、通道，10、阀，11、过滤材料，12、通道。
32.图2是扩增产物的层析试纸条检测。
33.图3是扩增凝胶电泳照片。左边为各种不同长度的标准核酸片段，中间为在标准反应管中的进行扩增的扩增产物电泳结果，右边为在本发明装置中反应腔4中进行扩增的扩增产物电泳结果。
34.图4是通道中的铁磁阀。51、铁磁材料，6、通道。
35.图5是利用柔性薄膜材料实现气密及气压平衡。12、通道，13、柔性薄膜。
36.图6是利用柔性薄膜材料及硬质材料实现气密及阀的功能。9、通道，13、柔性薄膜，14、硬质材料。
具体实施方式
37.下面结合附图和具体实施对本发明作进一步说明。
38.结合图1，介绍本发明的方法和配套装置。图1主要为了方便说明本发明的相关内容，为了有利于表述，突出结构细节，没有根据实际比例绘制。
39.装置中在基板1内部设置相互各自独立的三个腔室，分别为稀释封闭腔2、反应腔4、和混合腔7；稀释封闭腔2和反应腔4通过通道3相连；反应腔4和混合腔7通过通道6相连。
40.在反应腔4和混合腔7之间的通道6中设置阀5，根据需要开启或关闭通道。
41.反应腔4中可预先固化核酸扩增所需的全部试剂，包括扩增酶、引物、dntp、以及扩增缓冲液成分等。混合腔7中预先放置了相应的核酸侧向层析试纸条。
42.反应腔4和混合腔7都通过附设的通道12、9和外部保持气压相同和平衡。同时，在通道12、9中，可设置过滤、密闭材料11，8，可采用滤芯、氧化硅颗粒或者硅胶柱等，以确保只有气体等小分子可以通过通道，从而在保持腔室内外气压平衡的条件下同时避免核酸扩增产物泄漏到外部环境从而引起扩增子的污染。
43.在混合腔7的毛细管通道9中，设置阀10，以开启或关闭通道和外界环境的连通。也就是说，在阀10关闭时，混合腔7可以设置成气密模式，防止液体从反应腔4经通道6进入混合腔7。
44.下面是本发明的实施工程过程
45.1、在具体应用时，利用滴管等向稀释封闭腔2加入一定量的被测样本溶液。
46.根据核酸扩增试剂的具体情况，这些被测样本溶液可以是经过标准核酸提取过程的，也可以是经过简单加热或稀释的。被测样本溶液添加的量可以大约控制在50到1000微升之间。在能够后续层析测试要求的情况下，被测样本溶液添加量可以少些。
47.被测样本溶液添加后，可以用带有透气结构的管帽等封闭稀释封闭腔2，这样一方面防止大分子从稀释封闭腔2进入到周围环境，同时另一方面有能保持腔内和外界的气压平衡。管帽上的透气结构可以采用滤芯、氧化硅颗粒或者硅胶柱等来实现。
48.2、核酸扩增反应
49.被测样本溶液添加到稀释封闭腔2之后，由于稀释封闭腔2和反应腔4是一个连通结构，稀释封闭腔2液面高于反应腔4的液面，因此在静压的作用下，被测样本溶液就会进入到反应腔4。
50.而在这时候，反应腔4和混合腔7之间，通过阀5或是阀10来控制：当设置时，阀5关闭，溶液就不能进入到混合腔7；而当不设置阀5时，也可以利用阀10来关闭通道9和外界的气压联系，从而使得混合腔7成为一个气密腔，阻止液体的流入。
51.同时，通道12的设计使得其只承担一个气体通道的功能，其相对于反应腔4的体积是较小的。这样，流入反应腔4液体的体积主要由反应腔4的体积决定。设计中可以将反应腔4体积控制在3到80微升之间，这样，只要在稀释封闭腔2中加入适当的样本，就可以根据装置的设计，在反应腔4中得到相应体积的溶液并进行反应。3到80微升的体积，一般需要高精度的移液枪来获取。对于普通使用者来说，移液枪的使用是较为复杂的。而本发明通过装置的设计，使用者只需在稀释封闭腔2中加入一定的样本溶液就能实现。这是本发明的一个优势。
52.在本发明中，根据功能要求，稀释封闭腔2的体积大于反应腔4。这样在稀释封闭腔2中可以存放更多的溶液，有利于在静压的作用下整个装置中液体的运动。
53.被测样本溶液进入反应腔4后，将会溶解反应腔4中预置的反应溶液。可以在外置或附属的温控装置对反应腔4的温度进行控制，进行核酸扩增反应。这样的反应可以是pcr反应，也可以是等温扩增反应，如lamp，或rpa等。
54.在核酸扩增反应过程中，反应腔4和稀释封闭腔2是通过通道3连接在一起的。在本发明中，通过控制通道3的几何尺寸，使得通道3中的溶液在没有外力直接作用，且其两端静压也处于平衡的条件下，不会发生流动。因此，反应腔4中的溶质成分只能通过扩散的方式
进入通道3并进一步进入到稀释封闭腔2中。溶液中溶质扩增是一个缓慢的过程，而核酸扩增反应一般在一小时之内。
55.实验表明，在此时间尺度下，当通道3的直径在50微米到1毫米之间，只要其长度大于5毫米，由于扩散而导致的反应腔4和稀释封闭腔2之间的溶质成分的交换可以忽略。
56.3、反应液和试剂也达到层析条样品垫处，进行层析反应
57.扩增反应结束后，
58.在设有阀5的情况下，可以打开阀5，同时，使得混合腔7经通道9和外界气压相通。这样，在溶液静压的作用下，反应腔4中的溶液就会进入混合腔7；同时，由于溶液静压的作用，稀释封闭腔2中的未被扩增的样本溶液也会通过反应腔4并进一步进入到混合腔7中，直到稀释封闭腔2、反应腔4和混合腔7中的水压保持平衡为止。这样阀门开启动作，就对核酸扩增产物进行一定的稀释以溶液体积、满足层析试纸条检测的要求。
59.也可以不设置阀5，在未设有阀5的情况下，而在通道9中设置阀10。这样当阀10关闭时，混合腔7是一个气密空间，溶液通过细长的通道6进入时，会压缩混合腔7的气体，从而造成气压升高，从而无法进行入混合腔7。而当阀10打开时，反应腔4和稀释密封腔中的溶液就能进入混合腔7实现层析检测。
60.在实际装置设计中，可以通过调节稀释密封腔、反应腔4以及混合腔7的相对位置来控制各个腔之间的液体静压关系，以提高检测效果。
61.具体实施实例：
62.1、副溶血弧菌的核酸扩增及试纸条检测
63.装置结构如图1所示，所使用的材料为聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)板材。通过机械加工的方式在板材的一面加工出如图1所示的图形(请注意图1为了说明方便，并不是根据实际尺寸绘制，装置中各个结构的尺寸以下面文字说明为准)。
64.这里所说深度均为垂直纸面方向，高度为纸面纵向，而宽度为纸面横向。
65.稀释封闭腔2、反应腔4和混合腔7的深度均为2毫米。稀释封闭腔2的宽度为3毫米，高度为60毫米。反应腔4的宽度为4毫米，高度为3毫米。混合腔7的宽度为4毫米，高度为60毫米。
66.通道3的深度为1毫米，高度为1毫米，长度为5毫米。通道6的深度为1毫米，高度为1毫米，长度为5毫米。通道9的深度为0.1毫米，宽度为0.1毫米，高度为10毫米。通道12的深度为0.1毫米，宽度为0.1毫米，高度为59毫米。在通道9和通道12中均放入硅胶颗粒，从而在保持通道气流通畅的同时可以防止核酸扩增产物等大分子扩散到外界。根据需要，可在通道9和通道12中设置毛细管阀，以阻止通道中液体的流动。关于毛细管阀的具体设置，可参考有关文献sensors and actuators a 130
–
131(2006)601
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608。
67.上述结构加工完毕后，可通过压敏胶等和另一块pmma板材粘结以构建完整腔室。在通道9的顶部粘结有不透气粘性胶带，充当阀10。
68.本实施例以副溶血性弧菌为例，以副溶血弧菌中的不耐热溶血素(thermolabile hemolysin,tlh)基因为靶标，进行lamp扩增反应。
69.装置中所用的试纸条为常见的核酸检测层析试纸条，t线上固定有链霉亲和素，胶体金上连接有fam抗体，关于核酸层析试纸条，可以参考文献plos one8(7):e69355.doi:10.1371/journal.pone.0069355。
70.相关反应体系，及该反应体系在装置反应腔4的固化可参考文献sensors&actuators:b.chemical 305(2020)127440和talanta 214(2020)120818。
71.所采用的样本副溶血弧菌的浓度约为250cfu/g。向稀释封闭腔2中加入120微升副溶血弧菌的核酸提取液，利用外加的温控电热装置，对装置中的反应腔4部位加热，温度为65度，时间为40分钟。加热结束后，撕开黏在通道9顶部的不透气胶带，可见到反应腔4及稀释封闭腔2中的溶液进入混合腔7，接触层析试纸条的样品垫并在毛细管力的作用下进行层析检测，约等待5分钟后，t线出现，如图2所示。这一结果表明，本发明的装置和方法可以有效的进行核酸扩增及检测。
72.同时，为了进一步考察装置的扩增性能，确保通过通道3连通反应腔4和稀释封闭腔2不会对整体扩增性能带来明显影响，在装置中扩增结束后，可以将装置打开，取出扩增液，进行凝胶电泳检测。同时，也可以采用相同的样本及扩增试剂，在标准pcr管中进行lamp扩增反应并进行凝胶电泳检测。这两者的检测结果如图3所示，从而表明在装置中也可以进行有效的核酸扩增。
73.crispr体系是一个十分灵敏的检测方法，可检测100pm左右的目标核酸，关于crispr的详细信息可以参考有关文献(anal.chem.2019,91,11362-11366)。实验中设计了grna序列并利用crispr/cas12a体系对稀释封闭腔2中可能存在的扩增产物进行检测。由于稀释封闭腔2和反应腔4通过通道3连接，扩增过程中在反应腔4中硅产生大量的扩增产物，这些产物有可能通过通道3运动至稀释封闭腔2。但是，根据实验结果，即使对反应腔4中扩增的浓度为250cfu/g阳性副溶血弧菌样本的提取液，扩增完成后，也无法利用crispr技术在稀释封闭腔2中检测到扩增产物。这一结果说明，在装置目前的条件下，虽然反应腔4和稀释封闭腔2之间有通道连接，但是，由于通道的几何尺寸的限制，其并不能发生有效的溶质交换，也就是说通道的设置不会对核酸扩增产生明显影响。
74.由于扩增产物不能有效的进入到稀释封闭腔2中，所以只要稀释封闭腔2中保持有足够的液体，它事实上起到了一个反应腔4封闭的作用。这一封闭有助于防止反应腔4中的溶液挥发进入外界环境引起污染。这也是该腔被命名为稀释封闭腔2的原因。
75.对于相同的反应体系，当装置的其他参数不变，只是通道3的几何尺寸变为如下参数时：1)通道3的深度为0.1毫米，高度为0.1毫米，长度为5毫米。2)通道3的深度为0.1毫米，高度为0.5毫米，长度为5毫米。3)通道3的深度为0.1毫米，高度为0.1毫米，长度为2毫米。实验均得到了相似的结果，从而表明当通道3的几何尺寸在次范围内是，装置均能正常工作。
76.从理论上分析，通道3的长度越长，越有利于阻止反应腔4和稀释封闭腔2之间的溶质交换。但是，在实际中，过长的通道长度也会引起不便，一般其长度可设置在10厘米之内。
77.在实际中，通道3并不一定要水平设置，也可斜的，或是竖直设置。总之，其通道以细长结构为佳。
78.当采用lamp的f3和b3作为引物时，也可以在反应腔4中实现副溶血弧菌的pcr扩增。这时，f3的5’端修饰有fam，而f3的5’端修饰有生物素。反应时需要有一个温控装置控制反应腔4温度在95度和63度间循环。其余的操作均和上述lamp反应相似，也可得到相似实验结果。
79.2、带有铁蜡阀的装置实现副溶血弧菌的检测
80.本实施例所检测对象为副溶血弧菌，所用检测试剂均和实施例1相同，但在装置结
构上有所不同。
81.如图1所示，本实施例中，设置阀10，从而混合腔7通过通道9和外界保持气压平衡。在通道6中设置如图4所示的铁磁材料51形成铁蜡阀。
82.在反应腔4中进行核酸扩增反应时，铁蜡阀处于关闭状态。而当扩增反应结束后，在激光的照射下，铁蜡阀打开，从而反应扩增液及样本溶液可以进入混合腔7中并接触层析试纸条的样品垫记性层析检测。
83.实验结果表明，采用这一结构时，可得到和实施例1相类似的核酸检测结果。
84.3、采用柔性薄膜封闭的装置实现副溶血弧菌的检测
85.本实施例所检测对象为副溶血弧菌，所用检测试剂均和实施例1相同。但在装置结构上有所不同。
86.如图1所示，本实施例中，在通道12中不设置过滤材料11，取而代之，只是在通道12的顶端，设置如图5所示的柔性薄膜13。
87.在通道6中设置阀5，在通道9中不设置过滤材料8和阀10，取而代之，只是在通道9的顶端，设置如图6所示的柔性薄膜13。
88.这柔性薄膜13的设置，一方面可以断绝通道内气体和外界的流动，从而达到气密的效果，防止由于扩增子污染所可能造成的污染，也就是起到原先过滤材料8的作用。
89.同时，由于这是一个柔性薄膜。在装置的设计和制造时，可以设置这一薄膜有极大的面积和柔性，从而当通道6中的阀5打开后溶液从反应腔4进入混合腔7从而造成混合腔7内原有的气体压缩时，这一柔性薄膜会迅速响应，向外凸起，从而维持混合腔7内的气压和外部气压平衡，使得反应腔4和稀释腔中的溶液能够进入混合腔7。
90.实验结果表明，采用这一结构时，可得到和实施例1相类似的核酸检测结果。
91.更进一步的，当在通道9中采用柔性薄膜13时，可以在通道6中也不设置阀5，而是如图6所示，在通道9的顶端，再粘贴一层硬质材料14。这样，由于这一硬质材料14层的存在，混合腔7是一气密腔室，溶液不能进入。而当核酸扩增反应结束后，撕开这一硬质材料14层，这时反应腔4以及稀释封闭腔2中的溶液就可以进入混合腔7进行层析检测。
92.实验结果表明，采用这一结构时，可得到和实施例1相类似的核酸检测结果。