一株产L-乳酸的酿酒酵母的改造及其应用

一株产l-乳酸的酿酒酵母的改造及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株产l-乳酸的酿酒酵母的改造及其应用，属于定向代谢技术领域。


背景技术：

2.近年来，随着生物可降解高分子材料-聚乳酸的需求不断增加，以及可直接参与人体代谢的特异性，l-乳酸在环保及食品中的应用日益引起人们的关注。l-乳酸发酵合成过程中，为了平衡不断降低的ph，常需要补加中和剂，如caco3、naoh、ca(oh)2等来中和所产生的乳酸。而在产物提取过程中，又需要用浓h2so4将乳酸盐进行酸化，置换出乳酸，同时形成大量caso4的废杂，不仅工序复杂而且对环境造成极大的污染。酵母菌能够耐受较低的ph环境，为开发在不补加中和碱的工艺下进行有机酸发酵的工业菌种提供了可能。鉴于酿酒酵母具有遗传背景清晰、耐受性强、食品安全性、利用廉价底物生产有价值物质方面的诸多优势，并随着分子生物学技术的发展，利用代谢工程改造酿酒酵母本身固有的代谢网络，使其高产l-乳酸已成为当前研究的热点。
3.酿酒酵母自身并不含有生产l-乳酸的乳酸脱氢酶ldh，仅在酿酒酵母中表达外源ldh得到的l-乳酸积累量都不高，需要通过代谢工程手段进一步提高产率。利用代谢工程技术对细胞代谢进行修饰与改造，定向改变细胞特性，是一种生产各类化学物质的重要方法。在改造酿酒酵母生l-乳酸方面已实现l-乳酸的积累，产率的提高，同时副产物明显降低。但是改造菌株生长能力降低的问题还需解决，而且酿酒酵母工程菌株的l-乳酸产量也未能达到乳酸菌菌株的l-乳酸产量水平，乳酸生产菌株还有待进一步的开发和改造以提升l-乳酸的生产。


技术实现要素：

4.为解决上述酿酒酵母异源基因表达效率低，产量不高等问题，本发明提供一种利用yeast8.4.0模型筛选高产l-乳酸关键代谢调控基因mdh1、mdh2、pfka、nde1和nde2，以提高酿酒酵母菌中l-乳酸产量的方法。利用基因工程手段分别调控了同工酶mdh1(质粒中表达)和mdh2(胞质中表达)，二者是同工酶但在模型约束中属竞争关系，模拟结果为在胞质中的mdh2更好利用；表达外源磷酸果糖激酶(大肠杆菌)pfka基因，提升能量供应的能力；敲除nadh脱氢酶nde1、nde2，减少nadh的消耗。
5.本发明的第一个目的是提供一种重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母敲除了苹果酸脱氢酶1、nadh脱氢酶，并过表达苹果酸脱氢酶2、来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶，并表达来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶。
6.过表达苹果酸脱氢酶2；
7.过表达苹果酸脱氢酶2、异源表达来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶并敲除苹果酸脱氢酶1；
8.过表达苹果酸脱氢酶2、异源表达来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶并敲除苹果酸脱氢酶1及nadh脱氢酶nde1；
9.过表达苹果酸脱氢酶2、异源表达来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶，并敲除苹果酸脱氢酶1、nadh脱氢酶nde1和nde2。
10.在一种实施方式中，将所述来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶整合至酿酒酵母基因组的nadh脱氢酶nde1位点以敲除nadh脱氢酶nde1并实现所述乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶的表达。
11.在一种实施方式中，将所述乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶整合至酿酒酵母基因组的nadh脱氢酶nde2位点以敲除nadh脱氢酶nde2并实现所述乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶的表达。
12.在一种实施方式中，以酿酒酵母tjg12为宿主细胞，所述酿酒酵母tjg12记载于公开号为cn113430127a的专利文献中。
13.在一种实施方式中，所述的苹果酸脱氢酶1(mdh1)的gene id为:853777。
14.在一种实施方式中，所述的苹果酸脱氢酶2(mdh2)的gene id为:853994。
15.在一种实施方式中，所述的nadh脱氢酶1(nde1)的gene id为:855176。
16.在一种实施方式中，所述的nadh脱氢酶2(nde2)的gene id为:851474。
17.在一种实施方式中，所述来源于大肠杆菌的6-磷酸果糖激酶pfka的gene id为:948412，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
18.在一种实施方式中，所述的乳酸脱氢酶lldh来源于乳酸乳球菌，编码其基因的核酸序列如seq id no.2所示。
19.在一种实施方式中，所述的过表达mdh2是通过将tef1强启动子插入mdh2的编码基因序列前端进行强化表达。
20.在一种实施方式中，所述的异源表达pfka基因是通过将gal1,10双向半乳糖诱导启动子插入基因序列前端进行强化表达。
21.本发明的第二个目的是提供生产l-乳酸的方法，利用所述重组酿酒酵母发酵生产l-乳酸。
22.在一种实施方式中，将所述重组酿酒酵母培养至od
600
＝3
±
0.5，按照体积比8％～10％的量接种至ypd培养基中，在28～35℃，200～220rpm下培养，培养至体系中葡萄糖含量低于3g/l时，连续补加葡萄糖维持体系中葡萄糖的含量3～5g/l。
23.在一种实施方式中，在补加葡萄糖的同时添加终浓度为10～15g/l的半乳糖。
24.在一种实施方式中，总共反应84h。
25.本发明的第三个目的是提供所述的重组酿酒酵母在制备l-乳酸、l-乳酸衍生物、含有l-乳酸的产品及含有l-乳酸衍生物的产品中的应用。
26.本发明的有益效果：
27.本发明以耐酸酿酒酵母tjg12作为生产菌株，在发酵有机酸过程具有酿酒酵母的耐酸性，无需添加中和剂，经济有效且对污染环境友好。并且对酿酒酵母tjg12做了改进，具体为异源表达来源于大肠杆菌的6-磷酸果糖激酶和来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶lldh，并增强苹果酸脱氢酶2的表达；敲除nadh脱氢酶nde1和nde2及苹果酸脱氢酶1，最终实现l-la的提升，摇瓶产量从最初的29.5g/l可提升至47.7g/l。
附图说明
28.图1为代谢网络模型优化与模拟的路线图；
29.图2为l-la标品高效液相图；
30.图3为酿酒酵母菌株tjg16发酵l-la高效液相结果图。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
32.涉及的检测方法：
33.通过高效液相色谱对酿酒酵母中的l-la进行检测，将发酵72h的酿酒酵母菌液，取1ml加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪破碎20min，取出破碎后的混合液离心取上清，稀释10倍后通过0.55μm水相膜过滤，进行高效液相色谱分析。流动相使用0.5mm稀硫酸，流速0.6ml/min。检测器使用紫外检测器，检测波长为210nm，检测温度50℃。
34.本技术中使用的菌株酿酒酵母tjg12公开于公开号为cn113430127a的专利文献中。
35.实施例中所使用的引物如表1所示：
36.表1
37.38.[0039][0040]
实施例1：重组酿酒酵母菌tjg13的构建
[0041]
将酿酒酵母tjg12菌株制成酵母感受态细胞；
[0042]
以酿酒酵母tjg12基因组为模板，分别利用引物mdh2-u-f/r、m2-his-f/r、m2-tef1-f/r、mdh2-d-f/r，构建得到4个重组片段m2u、his、tef1、m2d，再将得到的基因片段转化至酿酒酵母tjg12感受态细胞中，涂布在his平板上，在30℃下培养2～3至长出单菌落，利用引物m2-y1-f/r以及m2-y2-f/r进行验证，验证正确的菌株即为在苹果酸脱氢酶2(mdh2，gene id：853994)前插入tef1强启动子的阳性转化子，并命名为菌株tjg13。
[0043]
实施例2：重组酿酒酵母菌tjg14～tjg16的构建
[0044]
(a)重组酿酒酵母菌tjg14的构建
[0045]
将tjg13菌株制成酵母感受态细胞；以酿酒酵母工程菌tjg12基因组为模板，采用引物mdh1-u-f，mdh1-u-r扩增得到基因片段mdh1-u，采用引物m1-leu-f，m1-leu-r扩增得到标签基因片段leu，采用引物m1-lldh-f、m1-lldh-r扩增得到tef1启动子 乳酸脱氢酶ldh 终止子cyc1基因片段lldh，采用引物mdh1-d-f、mdh1-d-r扩增基因片段得到mdh1-d。将基因片段mdh1-u、leu、lldh和mdh1-d通过化学转化方式整合至酿酒酵母感受态细胞tjg13的mdh1基因处，实现lldh基因的表达，在阻碍mdh1基因表达的同时表达乳酸脱氢酶，促进乳酸的合成，构建得到的菌株命名为tjg14。
[0046]
(b)重组酿酒酵母菌tjg15的构建
[0047]
将tjg14菌株制成酵母感受态细胞；以酿酒酵母工程菌tjg12基因组为模板，采用nde1-u-f/r引物扩增得到基因片段nde1-u。采用e1-his-f/r引物扩增得到基因片段his标签。采用e1-tdh3-f/r引物扩增得到基因片段tdh3终止子。采用e1-pfka-f/r引物扩增得到基因片段pfka。采用e1-gal-f/r引物扩增得到基因片段双向启动子gal1,10。采用e1-lldh-f/r引物扩增得到基因片段lldh。采用nde1-d-f/r引物扩增得到基因片段nde1-d。将得到的4个基因片段转化进入tjg14中，实现pfka基因和lldh基因的双表达，在破坏nde1基因表达的同时表达外源乳酸脱氢酶和磷酸果糖激酶，促进乳酸的合成的同时提升能量供应的能力。使用引物e1-y1-f/r，e1-y2-f/r进行上下游同源臂菌落pcr验证。最终得到菌株tjg15。
[0048]
(c)重组酿酒酵母菌tjg16的构建
[0049]
按照(b)相似步骤，采用gal1,10同时启动外源基因lldh和pfka，整合至酿酒酵母自身的nadh脱氢酶nde2处，实现nde2的敲除，并用引物e2-y1-f/r，e2-y2-f/r进行上下游同源臂菌落pcr验证。最终得到菌株tjg16。
[0050]
实施例3：重组酿酒酵母发酵生产l-乳酸
[0051]
在2ml ypd培养基中分别接入从固体ypd平板上挑取的实施例1和2构建得到的酿酒酵母菌tjg13～tjg16单菌落，在30℃，220rpm培养18～24h后，发酵菌株od
600
值达到3左右后按10％体积比接入含有25ml ypd液体培养基的250ml圆底摇瓶内，在30℃，220rpm培养，发酵至葡萄糖《3g/l时，加入葡萄糖进行碳源的补充，保持葡萄糖含量在3～5g/l。同时添加终浓度为12g/l半乳糖开始进行诱导启动子合成l-乳酸。总共发酵84h，发酵结束后，离心取沉淀，除去上清，使用10ml无菌水重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪破碎20min，取出破碎后的混合液，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用稀硫酸，检测器使用紫外检测器，检测波长为210nm，检测温度50℃。
[0052]
经过液相分析，在tjg12基础上，构建成功的高产乳酸菌株tjg13～tjg16的l-la产量分别为36.72g/l，37.9g/l，44.1g/l，47.7g/l。
[0053]
将菌株tjg12按照上述方法发酵生产l-乳酸，经检测，l-乳酸的产量为29.5g/l。
[0054]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。