一种对高脂血症具有明显改善作用的复合益生菌组合物的制作方法

1.本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种对高脂血症具有明显改善作用的复合益生菌组合物。


背景技术：

2.高脂血症(hyperlipoidemia)又称高脂蛋白血症(hyperlipoproteinemi)，指脂肪代谢过程中，血浆中的几种脂质水平比正常偏高，主要表现为血清胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)比正常水平偏高。根据流行病学及临床医学研究表明，血液中胆固醇含量高于正常水平与心血管疾病(cvd)的发生呈正相关。有报告称，比正常胆固醇水平高出1mmol/l(》5.2mmol/l)，患冠状动脉心脏疾病的风险增加了35％，同时，降低血清中胆固醇水平的1％，可以将患心脑血管疾病的风险降低 2％～3％。导致心血管疾病的主要原因是动脉粥样硬化，动脉粥样硬化的危险因素之一是高胆固醇血症。
3.益生菌(probiotic)通常被定义为当机体从膳食中摄入足够量时，能够调节并改善肠道菌群，对人体健康具有促进作用的一类具有活性的微生物。益生菌一般分为三类：乳酸菌类、双歧杆菌类及其它类。指定一株共生菌株作为益生菌的标准包括非致病性、来源人类、酸和胆盐的耐受性、在肠道内能够定植并存活、抗菌物质的产量和免疫调节的活性。很多文献报道并证实了益生菌具有抗肿瘤、抗癌抗突变、降血压、维持肠道完整性等生理功能。此外，益生菌还具有降血脂作用，这一功能获得了国内外相关研究人员的高度关注。


技术实现要素：

4.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种复合益生菌组合物在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗高脂血症的食品或药物中的用途。
5.为此，本发明提供了如下的技术方案：
6.一种复合益生菌组合物在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗高脂血症的食品或药物中的用途，所述复合益生菌组合物包括：
7.干酪乳杆菌zhang(lactobacillus casei zhang)，保藏编号为cgmcc no.5469；
8.动物双歧杆菌乳亚种v9(bifidobacterium animalis subsp.lactis v9)，保藏编号为cgmcc no.5470；
9.植物乳杆菌p-8(lactobacillus plantarum p-8)，保藏编号为cgmcc no.6312；
10.鼠李糖乳杆菌probio-m9(lactobacillus rhamnosus probio-m9)，保藏编号为cgmcc no.18639；和
11.乳双歧杆菌probio-m8(bifidobacterium lactis probio-m8)，保藏编号为cgmcc no.18610。
12.可选的，所述复合益生菌组合物的总活菌数不低于3.0
×
10
10
cfu/g，每株菌的活菌数不低于6.0
×
109cfu/g。
13.可选的，每株菌的原料包括该株菌的培养物、发酵物或冻干粉中的任意一种；
14.可选的，每株菌的原料为该株菌的冻干粉。
15.可选的，还包括辅料；
16.可选的，所述辅料为益生元或膳食纤维；
17.可选的，所述辅料包括低聚半乳糖、低聚果糖、菊粉和聚葡萄糖中的至少一种；
18.可选的，所述辅料添加量为占所述复合益生菌组合物总质量的 1.0％-50.0wt％。
19.可选的，还包括复合益生菌组合物的制备方法，包括将含各株菌的原料混合的步骤；
20.可选的，还包括将含各株菌的原料混合后添加辅料的步骤。
21.可选的，所述复合益生菌组合物还具有如下(a)-(f)中任意一项的用途：
22.(a)在制备降低内脏脂肪的食品或药物中的用途
23.(b)在制备降低血液中胆固醇含量的食品或药物中的用途；
24.(c)在制备降低血液中低密度脂蛋白含量的食品或药物中的用途；
25.(d)在制备提升血液中高密度脂蛋白含量的食品或药物中的用途；
26.(e)在制备抑制血液中d-乳酸含量上升或降低血液中d-乳酸含量的食品或药物中的用途；
27.(f)在制备降低血液中二胺氧化酶含量的食品或药物中的用途；
28.(g)在制备直投式发酵剂中的用途。
29.可选的，所述食品包括普通食品、保健食品和辅助治疗型食品。
30.可选的，所述食品包括由所述复合益生菌组合物作为发酵剂进行发酵制备得到的食品。
31.可选的，所述食品包括豆制品、乳制品或果蔬制品。
32.本发明技术方案，具有如下优点：
33.1、本发明提供的一种复合益生菌组合物在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗高脂血症的食品或药物中的用途，复合益生菌组合物包括：干酪乳杆菌zhang(lactobacillus casei zhang)，保藏编号为cgmcc no.5469；动物双歧杆菌乳亚种v9(bifidobacterium animalis subsp.lactis v9)，保藏编号为cgmcc no.5470；植物乳杆菌p-8(lactobacillus plantarum p-8)，保藏编号为cgmcc no.6312；鼠李糖乳杆菌probio-m9(lactobacillusrhamnosus probio-m9)，保藏编号为cgmcc no.18639；和乳双歧杆菌 probio-m8(bifidobacterium lactis probio-m8)，保藏编号为cgmcc no. 18610；上述的复合益生菌组合物具有预防、缓解、辅助治疗或治疗高脂血症的作用，在制备缓解和治疗高脂血症等此类疾病的产品中具有很大的应用前景。
34.2、本发明提供的一种复合益生菌组合物在制备预防、缓解、辅助治疗或治疗高脂血症的食品或药物中的用途，所述益生菌组合物的总活菌数不低于3.0
×
10
10
cfu/g，每株菌的活菌数不低于6.0
×
109cfu/g；上述复合益生菌组合物能通过调节人体肠道菌群，显著改善高脂血的相关症状。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
36.图1为本发明实验例中益生菌组和安慰剂组干预前后受试者体内的 ldl-c含量变化；横坐标中括号中的数值为其纵坐标对应的数值。
37.图2为本发明实验例中益生菌组和安慰剂组干预前后受试者体内的tc 含量变化；横坐标中括号中的数值为其纵坐标对应的数值。
38.图3为本发明实验例中益生菌组和安慰剂组干预前后受试者体内的 hdl-c含量变化；横坐标中括号中的数值为其纵坐标对应的数值。
39.图4为本发明实验例中益生菌组和安慰剂组干预前后受试者体内的d
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乳酸含量变化；横坐标中括号中的数值为其纵坐标对应的数值。
40.图5为本发明实验例中益生菌组和安慰剂组干预前后受试者体内的二胺氧化酶含量变化；横坐标中括号中的数值为其纵坐标对应的数值。
41.图6为本发明实验例中益生菌组和安慰剂组干预前后受试者体内的内脏脂肪含量变化；横坐标中括号中的数值为其纵坐标对应的数值。
具体实施方式
42.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
43.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
44.干酪乳杆菌zhang(lactobacillus casei zhang)是2002年分离自内蒙古大草原自然发酵酸马奶中的1株具有多种益生功能的益生菌，是我国第1 株完成全基因组测序的益生菌，已于2011年11月18日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏编号为：cgmcc no.5469。试验研究发现：l.casei zhang 干预可加速脂肪酸氧化从而起到降血脂的作用。
45.动物双歧杆菌乳亚种v9(bifidobacterium animalis subsp.lactis)于2011 年11月18日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.5470。基因组学研究发现该菌株发生重组、突变几率极小，遗传稳定。
46.植物乳杆菌p-8(lactobacillus plantarum p-8)是2005年分离自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗草原上牧民家庭自然发酵酸牛乳样品的1株具有优良益生特性的植物乳杆菌。已于2012年06月28日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.6312。
47.鼠李糖乳杆菌probio-m9(lactobacillus rhamnosus probio-m9)于2017 年分离自健康妇女母乳。已于2019年10月08日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏编号为：cgmcc no.18639。
48.乳双歧杆菌probio-m8(bifidobacterium lactis probio-m8)于2017年分离自健康妇女母乳。已于2019年9月20日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.18610。
49.复合益生菌菌粉中，干酪乳杆菌zhang、动物双歧杆菌乳亚种v9、植物乳杆菌p-8、鼠李糖乳杆菌probio-m9和乳双歧杆菌probio-m8的总活菌数大于等于3.0
×
10
10
cfu/g。
50.益生菌菌粉的制备方法，包括如下步骤：
51.1)菌种的活化：将-40℃冷冻保存的菌株(干酪乳杆菌zhang、动物双歧杆菌乳亚种v9、植物乳杆菌p-8、鼠李糖乳杆菌probio-m9和乳双歧杆菌probio-m8)分别接种于121℃15min灭菌后对应的液体培养基中，37℃厌氧培养18-24h，如此传代培养1-2次得到活化菌种；乳酸菌(干酪乳杆菌zhang、植物乳杆菌p-8、鼠李糖乳杆菌probio-m9)对应的液体培养基为mrs液体培养基，双歧杆菌(动物双歧杆菌乳亚种v9和和乳双歧杆菌 probio-m8)对应的液体培养基为tpy液体培养基。
52.2)优化培养基的配制：
53.将优化培养基各成分按比例配制，混合均匀后调ph值为6.5,121℃下灭菌15min；
54.双歧杆菌优化培养基组成如下：乳糖12.0kg，牛肉膏7.0kg，酵母粉 7.0kg，酪蛋白胨12.0kg，大豆蛋白胨7.0kg，kh2po
4 4.0kg，k2hpo
4 1.0kg， mgso
4 0.05kg，吐温-80 0.15kg，l-半胱氨酸盐酸盐0.7kg，碳酸钙1.2kg，蒸馏水1000l。
55.乳酸菌优化培养基组成如下：蔗糖23.5kg，乳糖12.0kg，大豆蛋白胨 15.0kg，酵母粉5.0kg，酵母胨12kg，na2hpo
3 21.0kg，柠檬酸2.0kg， mgso4
·
7h2o 0.6kg，mnso
4 5h2o 0.3kg，吐温-80 1.0kg，l-半胱氨酸盐酸盐0.3kg，蒸馏水1000l。
56.3)种子液的制备：
57.取步骤1)中活化好的各个菌种对应接种于2)中配制的优化培养基中， 37℃厌氧培养至ph值为4.5-4.8时停止；
58.4)接种与发酵：
59.将步骤3)的种子液，分别按1
‰
对应接种于2)中配制的优化培养基中，在控制的发酵条件下发酵18h；
60.发酵条件控制为：发酵前期30℃恒温培养，自然发酵至ph为5.0；再调整发酵温度为37℃恒温培养，并控制ph保持6.0，保持厌氧发酵达到总发酵时间为18h。
61.上述过程中通过流加中和剂的方法控制ph，其中中和剂是naoh。
62.其中厌氧条件通过每两个小时通氮气一次的方法实现。
63.5)终止发酵
64.当菌体产酸停止时终止发酵，得到各菌株的高密度发酵液，发酵液活菌数达到2
×
10
10
cfu/ml以上。
65.其中可根据ph不再降低，中和剂流加停止来判断产酸是否停止。
66.6)冷冻干燥
67.a.菌体浓缩：高密度发酵液经12000g离心浓缩菌体；
68.b.添加保护剂：菌体浓缩液添加3-8倍体积倍数的保护剂溶液；保护剂溶液组成如下：脱脂乳10-15kg，乳糖8-12kg，维生素c1-2kg，谷氨酸钠 1-2kg，蒸馏水1000l。
69.c.干燥：将上述添加保护剂后的菌悬液经冷冻干燥，分别得到每株菌的冻干菌粉，
每株菌粉中活菌总数达到6.0
×
10
11
cfu/g以上。
70.实施例1
71.一种复合益生菌组合物，配方：干酪乳杆菌zhang菌粉0.01g、动物双歧杆菌乳亚种v9菌粉0.01g、植物乳杆菌p-8菌粉0.01g、鼠李糖乳杆菌 probio-m9菌粉0.01g和乳双歧杆菌probio-m8菌粉0.01g，以及辅料麦芽糊精0.6mg。
72.上述复合益生菌组合物的制备方法，按照配方称取每株菌的冻干粉，混合均匀，然后加入辅料，混合均匀。
73.实施例2
74.一种复合益生菌组合物，配方：干酪乳杆菌zhang菌粉0.01g、动物双歧杆菌乳亚种v9菌粉0.01g、植物乳杆菌p-8菌粉0.01g、鼠李糖乳杆菌 probio-m9菌粉0.01g和乳双歧杆菌probio-m8菌粉0.01g，以及辅料菊粉 50mg。
75.上述复合益生菌组合物的制备方法，按照配方称取每株菌的冻干粉，混合均匀，然后加入辅料，混合均匀。
76.实施例3
77.一种复合益生菌组合物，配方：干酪乳杆菌zhang菌粉1g、动物双歧杆菌乳亚种v9菌粉1g、植物乳杆菌p-8菌粉1g、鼠李糖乳杆菌probio-m9 菌粉1g和乳双歧杆菌probio-m8菌粉1g，以及辅料聚葡萄糖1.5g。
78.上述复合益生菌组合物的制备方法，按照配方称取每株菌的冻干粉，混合均匀，然后加入辅料，混合均匀。
79.实验例 (一)试验设计：
80.受试人群：受试者应为18-70周岁，男女不限，符合以下任意一项或者同时满足两项：甘油三酯≥1.8mmol/l，总胆固醇≥5.7mmol/l。未曾使用且短期内不计划使用降脂药物治疗。
81.入选标准：只有当受试者符合以下所有标准，才适合入组本研究。
82.1.男性或女性均可，年龄在18-70周岁之间；
83.2.bmi(body mass indx)在24kg/m
2-30kg/m2之间；
84.3.男性腰围≥90cm，女性腰围≥85cm；
85.4.入组前1月未使用抗生素；
86.5.无慢性胃肠道疾病史；
87.6.同意参加此研究，并签署书面知情同意书；
88.7.新发现或既往有高脂血症患者均可，无其他并发症，未使用过降脂药物治疗；
89.排除标准：若受试者符合以下任一条者，则不能入选：
90.1.处于妊娠期、哺乳期或者6个月内计划妊娠的妇女；
91.2.肝功能不全者：谷丙转氨酶及谷草转氨酶≥正常值高限2倍及以上者； 3.肾功能不全者：肾小球滤过率≤90ml/min/1.72m2；
92.4.高血压，且使用2种以上降压药物治疗血压仍高于160/100mmhg者；
93.5.心功能不全者；
94.6.患有贫血或者其他血液病者；
95.7.糖尿病患者；
96.8.有乳酸菌及其制品过敏史或高敏体质者；
97.9.筛选前3个月内接受过其他药物研究者；
98.样本量：共200例。单纯甘油三酯高组100例；单纯总胆固醇高组100 例。
99.主要疗效指标：治疗三个月末血甘油三酯和血总胆固醇水平达标(甘油三酯＜1.8mmol/l，总胆固醇＜5.7mmol/l)；
100.(二)研究方法
101.1.肠道益生菌制剂及安慰剂说明
102.本研究采用双盲法，益生菌组和安慰剂组均给予相同的饮食及运动指导，益生菌组每日服用实施例1复合益生菌组合物2g(总活菌数不低于300 亿cfu/d)，安慰剂组给予包装、颜色、气味和益生菌完全相同的安慰剂(麦芽糊精)2g/日，进行三个月的随访观察并采集试验开始(0d)和结束(90d) 的血液和粪便样品。(随机双盲、非干预性、平行对照临床研究，患者按1∶ 1随机分配至安慰剂组和益生菌组。)
103.2.肠道益生菌制剂使用方法
104.直接口服，或温水送服(40℃以下)，1日1次，1次1包。
105.3.疗程
106.疗程总计3个月，随访观察期3个月。
107.4.合并用药
108.在治疗过程中，其他合并药物如果对于受试者的安全和健康而言是必须的，可在研究者的指导下予以使用，只要该药物的服用对本研究药物的疗效评价无任何影响。所有的合并用药及合并用药的剂量、剂量调整、服用起止时间均记录于crf上。
109.5.禁用药物
110.下列药物在治疗研究期间不得使用：抗生素、其他肠道菌群制剂或对肠道菌群可能产生干扰的药物
111.6.停药标准处理
112.(1)alt或ast大于正常上限2倍：
113.(2)scr大于正常值上限；
114.(3)白细胞计数《3.0
×
109/l；
115.(4)血小板计数《80
×
109/l；
116.(5)中性粒细胞绝对值《1.5
×
109/l。
117.出现以上任一情况时，需停药7天，复查指标。若达不到用药标准，终止研究；若恢复正常，继续用药。研究过程中若出现两次符合“停药标准”的情况，终止研究。
118.(三)试验方法和结果
119.1.本研究采用双盲法，将最终被纳入的70名受试者按1∶1随机分配至安慰剂组(35人)和益生菌组(35人)，两组均给予相同的饮食及运动指导，益生菌组每日服用复合益生菌组合物2g(300亿cfu/d，安慰剂组给予包装、颜色、气味和益生菌完全相同的安慰剂(麦芽糊精)2g/日，进行三个月的随访观察并采集试验开始(0d)和结束(90d)的血液和粪便样品，综合观察对高脂血症患者的临床效果以及糖脂代谢过程中脂肪因子的变化。
120.2.指标测试
121.检测初始(0d)和三个月末(90d)益生菌组和安慰剂组受试者体内的 ldl-c含量、
血液中的tc的含量、hdl-c含量、d-乳酸含量、二胺氧化酶含量和内脏脂肪含量变化。ldl-c(正常值《3.37mmol/l)，tc(正常值《5.18mmol/l)，hdl-c(正常值》1.04mmol/l)，d-乳酸(正常值《15 mmol/l)，二胺氧化酶(正常值《10mmol/l)，内脏脂肪(正常值《100cm2)。
122.采集各组受试者在第0个月(第0天未服药)和治疗3个月(第90天) 后的血液测定以下各指标：
123.ldl-c含量：本次试验试剂盒由提供，型号e-bc-k221-m。通过联合遮蔽法定量测定ldl-c的检测方法。本方法采用液体双试剂，由分别放置的试剂1和试剂2组成，其中，所述试剂1含二价金属氯化物氯化钙，其浓度范围在0.4g/l-0.5g/l，ldl-c单克隆抗体为载脂蛋白b单克隆抗体，其浓度范围在50ml/l-150ml/l，及定量酶试剂；所述试剂2含有表面活性剂，显色剂，防腐剂，抗干扰物质及反应促进剂。该方法显色特性好，准确度高，试剂成分稳定。
124.血液中的tc的含量：使用试剂盒检测法，由北京雷根生物技术有限公司提供，名称为总胆固醇(tc)检测试剂盒(cod-pap单试剂微板法)；
125.hdl-c含量：使用试剂盒检测法，由伊利康提供，名称为高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)检测试剂盒(直接法)，货号l7003；
126.d-乳酸含量：使用试剂盒检测法，由北京雷根生物技术有限公司提供，名称为d-乳酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶比色法)；
127.二胺氧化酶含量：使用试剂盒检测法，由北京索莱宝科技有限公司提供，名称为二胺氧化酶活性检测试剂盒，货号bc1285；
128.内脏脂肪含量：使用双能x线吸收测量法完成检测。
129.3.试验结果
130.(1)由图1可得，与安慰剂组相比，益生菌组可显著降低高脂血症患者血液中ldl-c的含量(23/35人降低，p＝0.0086)。
131.(2)由图2可得，益生菌也可显著降低血液中tc的含量(24/35人降低，p＝0.0017)，而安慰剂干预无显著变化(p＝0.10)。
132.(3)由图3可得，益生菌干预可显著提升受试者体内hdl-c的含量(15/35人上升，p＝0.023)，而安慰剂干预后志愿者体内的hdl-c含量显著下降(26/35人下降，p＝0.0016)。
133.(4)由图4可得，与安慰剂相比，益生菌可显著抑制受试者血液中 d-乳酸含量的上升，同时也使部分受试者血液中的d-乳酸出现极显著下降 (p《0.0001)，且初使含量越高下降幅度越大(r＝0.93,p《0.0001)。
134.(5)由图5可得，尽管绝大部分受试者(67/70人)血液中的二胺氧化酶均在正常范围，但安慰剂组志愿者血液中的二胺氧化酶呈显著上升(p＝0.0014)，而益生菌却能使志愿者体内的二胺氧化酶显著下降 (p＝0.0023)。
135.(6)由图6可得，益生菌组和安慰剂组内脏脂肪均显著下降(p《0.05)，但与安慰剂组相比，益生菌组的下降幅度更大。表明益生菌组可显著改善高脂血的相关症状。
136.综上所述，服用本发明的复合益生菌组合物安全性良好，可有效用于高脂血症患者的治疗，进一步说明复合益生菌组合物对高脂血症患者症状具有一定的改善作用。
137.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或
变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。