用于基因治疗的金脂质纳米颗粒

1.本发明涉及基因治疗领域。特别地，本发明提供了可用作核酸转染载体的固体脂质纳米颗粒(sln)，以及用于获得所述sln的方法和包括所述sln的药物组合物。


背景技术：

2.在过去的几十年中，为了在体外和体内调节基因表达，已经开发了广泛的用于将核酸转移到细胞中的试剂和技术。
3.特别是，已经鉴定了许多参与病理过程的基因，并因此基因治疗被视为一种非常有前途的治疗工具以用于逆转所述病理中的遗传改变，这包括例如由单个基因缺陷引起的常染色体隐性疾病，例如囊性纤维化、血友病、法布里病(fabry disease)；常染色体显性疾病；一些癌症；hiv和其他传染病；炎性疾病；或眼科疾病，诸如视网膜劈裂症等等。
4.为了开发基因治疗产品，不仅要考虑待治疗的疾病和待给药的治疗性核酸，核酸的递送方法(即基因的给药系统)也起着至关重要的作用。所使用的遗传载体必须能够穿透靶细胞的细胞膜，并保护核酸免受酶降解，以及最终必须在细胞内的靶位点处释放核酸。
5.用于核酸的给药系统可分为病毒或非病毒载体。
6.病毒载体是最有效的，但具有较大的免疫原性和致癌性问题。另一个缺点是它们只能包括小型基因。
7.因此，在过去几年中，许多重点已放在开发非病毒载体上，这提供了一种更安全且更通用的替代方案。在各种非病毒基因载体中，已提出基于脂质的系统作为有前景的平台。这些系统缺少在病毒中存在的免疫原性蛋白，并且通常可以有力地浓缩核酸，并且还通常相对容易制备。然而，它们的转染效力或它们提供的基因表达水平通常仍大大低于病毒载体。
8.在过去的几十年里，已经开发了不同类型的基于脂质的转染系统。
9.二十多年前，脂质体被引入作为用于递送用于基因治疗的核酸的载体，并且迄今为止仍然代表最广泛研究的用于基因递送的载体。用于基因递送的脂质体通常是纳米级的，并且由具有被脂质双层膜包围的水性内腔的球形囊泡定义。然而，这些系统并非没有稳定性和功效问题。
10.最近开发了固体脂质纳米颗粒(sln)，目的尤其是解决上述脂质体基因转染背后的问题。虽然共有脂质成分，但sln在结构上不同于脂质体。sln是球形颗粒，具有由表面活性剂稳定的固体脂质核心基质。根据脂质和表面活性剂组分的选择以及制备方法，sln可用于容纳亲水性和疏水性药物二者。本发明人的欧洲专利ep 2460516 b1描述了适合作为基因治疗载体的sln。
11.尽管最近取得了进展，但始终需要对现有系统的改进，且特别是非常需要推进现有技术载体在转染和表达效率方面和/或在载体的物理性质方面的能力的基因递送平台。


技术实现要素：

12.本发明人现已发现，将金与sln一起使用在转染和表达效率方面和/或在sln的物理性质方面具有很大的优势。
13.虽然过去曾提出过在脂质体的背景下使用金，但通常是为了为其水性核心提供稳健性并因此提供稳定性，据发明人所知，从未有人建议将其用于sln，sln与脂质体相反，不需要核心稳定，因为它们已经拥有固体脂质核心。然而，如上所述，已令人惊讶地发现金仍然可以有利地用于sln载体。
14.因此，在第一方面，本发明涉及一种sln，其包括：
[0015]-在核心处的在室温下为固体的脂质；
[0016]-阳离子表面活性剂；
[0017]-非离子表面活性剂；
[0018]-金；以及
[0019]-核酸。
[0020]
本发明人还惊奇地发现，制备本发明第一方面的sln的方法可以对sln的上述转染和表达效率和/或物理性质产生影响，因此具有很大的通用性以靶向不同的多种类型的细胞。
[0021]
因此，本发明的第二方面涉及用于制备根据本发明的第一方面的sln的方法(以下称为“方法au”)，该方法包括：
[0022]
a)制备前体sln的悬浮液，所述前体sln包括：
[0023]-在所述前体sln的核心处的在室温下为固体的脂质；
[0024]-阳离子表面活性剂；以及
[0025]-非离子表面活性剂；
[0026]
b)制备溶液，所述溶液包括：
[0027]-核酸；以及
[0028]-金；
[0029]
c)将步骤(a)中获得的前体sln的悬浮液与步骤(b)中获得的溶液混合。
[0030]
类似地，本发明的第三方面涉及用于制备根据本发明的第一方面的sln的另一种方法(以下称为“方法oro”)，该方法包括：
[0031]
a)制备前体金sln的悬浮液，所述前体金sln包括：
[0032]-在核心处的在室温下为固体的脂质；
[0033]-阳离子表面活性剂；
[0034]-非离子表面活性剂；以及
[0035]-金；
[0036]
b)制备包括核酸的溶液；
[0037]
c)将步骤(a)中获得的前体金sln的悬浮液与步骤(b)中获得的溶液混合。
[0038]
同样地，本发明还提供了包括本发明第一方面的sln的药物组合物。
[0039]
在另一方面，本发明涉及本发明第一方面的sln用作药物的用途，并且更特别地用于基因治疗的用途。
附图说明
[0040]
图1描绘了根据本技术实施例1中描述的turkevich方法获得的多个金纳米颗粒。
[0041]
图2图示了根据本发明的多个sln。特别地，其为根据本技术的实施例9的多个sln_au-p-ha纳米颗粒的tem图像。
[0042]
图3显示了用对比制剂(a)sln-p-ha-mrna；或用根据本发明的制剂(b)sln_au-p-ha-mrna、(c)sln_au-p-dx-dna或(d)sln_oro-p-dx-dna进行局部处理后的角膜组织的免疫荧光染色图像。圈起来的区域标识gfp荧光。
具体实施方式
[0043]
在本发明的上下文中，术语“固体脂质纳米颗粒”或“sln”是指包括亲脂性脂质核心的结构，该亲脂性脂质核被包封该核心的亲水相包围。
[0044]
特别地，本发明涉及根据本发明的多个sln。这样的多个sln在本文中也被称为本发明的“系统”。本文针对本发明的sln描述的实施方式被理解为同样适用于多个sln。术语“多个”是指在实践中通常用于存储或给药于受试者的任何数量的sln，并且范围可以从少至102到任何对于预期目的合理的数量，例如治疗有效但无毒的量的sln。
[0045]
在实施方式中，本发明的sln具有包括在1和1000nm之间、更特别地在100和800nm之间的尺寸。
[0046]
类似地，本发明的sln系统优选地呈现包括在1和1000nm之间、更特别地在100和800nm之间的平均sln尺寸。“平均尺寸”被理解为多个sln的平均尺寸，所述sln包括在sln的核心处的亲脂相、围绕所述核心的亲水相以及吸附在其上的sln的任何组分。在一些情况下，仍然有可能在本发明的系统内找到范围高达约10μm的孤立群体，通常是sln的聚集体，然而只要系统的平均尺寸在上述范围内，这些仍将落入本发明的范围内。
[0047]
这些系统中sln的平均尺寸可以通过本领域技术人员已知的标准方法测量，诸如通过显微术(例如，光学显微术、负染色电子显微术、透射电子显微术(tem)、冷冻-tem、扫描电子显微术(sem)、共焦显微镜和扫描探针显微术)、衍射和散射技术(激光散射和光子相关光谱)和流体动力学技术(场流分级、凝胶渗透色谱、超速离心和离心沉降)。优选的技术是动态光散射(dls)，并且更特别是光子相关光谱。由dls测量的尺寸对应于以与被测量颗粒相同的速度扩散的球体的直径。
[0048]
本发明的sln系统优选呈现0.7或更低，更特别地在0.2和0.5之间的多分散性指数(pdi)。术语“多分散性”(或iupac推荐的“分散性”)用于描述给定样品中尺寸群体的分布，并从而观察所述样品尺寸的不均匀程度。pdi是无量纲的，且数值范围从0.0(对于在粒度方面完全均匀的样品)到1.0(对于具有多个粒度群体的高度多分散样品)。pdi可以通过上面提到的用于测量sln尺寸的本领域技术人员已知的标准方法来测量。
[0049]
在本发明的上下文中，用于确定尺寸和pdi参数的方法优选地是在iso标准13321:1996e和iso 22412:2008(两种情况下都是第1版)中定义的那些方法。这些测量可以使用适当的malvern instruments ltd.zetasizer设备进行(例如参见对于nano zs系列装置的zetasizer nano user manual,man0317,issue 5.0,august 2009中描述的测量)。
[0050]
本发明人现已惊奇地发现，在sln中并入金能够降低其尺寸和多分散性。降低这些关键物理参数并随之改善它们的可调节性的可能性在本发明的领域中是至关重要的，如
danaei et al.,pharmaceutics.2018jun；10(2):57中综述的。发明人进一步观察到，当sln包括糖胺聚糖(gag)，优选透明质酸作为多糖时，这种效果尤为明显。
[0051]
此外，本发明的sln显示ζ电位可以在-50mv至 80mv，并且更特别地 5mv至 50mv变化。ζ电位最通常地通过激光多普勒测速法或激光多普勒电泳法(一种结合了电泳和激光多普勒测速法的技术)测量。该技术测量当施加电场时颗粒在液体中移动得多快——即它的速度。在本发明的上下文中，ζ电位是根据iso标准iso 13099-2:2012测量的。这些测量可以使用适当的malvern instruments ltd.zetasizer设备诸如zetasizer nano/pro/ultra进行。
[0052]
在优选的实施方式中，sln还包括带正电荷的肽。
[0053]
在另一优选的实施方式中，sln还包括多糖。
[0054]
在另一优选的实施方式中，sln还包括多糖和带正电荷的肽二者。
[0055]
尽管sln的结构已经暗示，但本发明的sln既不是脂质体也不是基于脂质体的系统，特别地它不是包括水性核心的系统。
[0056]
下面详细描述本发明的sln的不同组分。
[0057]
脂质组分
[0058]
本发明的sln包括形成sln核心的一部分的在室温下为固体的至少一种脂质。
[0059]
在本发明的上下文中，“在室温下为固体的脂质”是指在45℃下保持为固体并且可以是饱和或不饱和的脂质。所述定义包括甘油三酯(例如硬脂酸甘油酯)、甘油单酯或甘油二酯(例如)、脂肪酸(例如硬脂酸)、类固醇(例如胆固醇)和蜡(例如棕榈酸鲸蜡酯)。
[0060]
在特定的实施方式中，在室温下为固体的脂质选自酰基甘油、具有至少10个碳原子的链的饱和脂肪酸或其衍生物及其混合物。
[0061]
酰基甘油包括甘油单酯、二酰甘油、三酰甘油及其混合物。在优选的实施方式中，酰基甘油选自硬脂酸棕榈酸甘油酯(ato5)、单硬脂酸甘油酯900)和山嵛酸甘油酯(888ato)。
[0062]
在特定的实施方式中，脂肪酸是饱和的并且具有至少10个碳原子的链。同样，可以使用这些脂肪酸的衍生物，其被理解为由于酸基团与醇或胺反应而产生的那些化合物，诸如例如所述脂肪酸的酯或酰胺。类似地，具有羟基作为烃链取代基的那些脂肪酸、它们的酯或它们的酰胺包括在脂肪酸衍生物的定义中。
[0063]
在优选的实施方式中，使用硬脂酸棕榈酸甘油酯(ato5)作为脂肪酸衍生物。
[0064]
在优选的实施方式中，使用硬脂酸棕榈酸甘油酯ato5)或单硬脂酸甘油酯作为在室温下为固体的脂质。更优选地，在室温下为固体的脂质是硬脂酸棕榈酸甘油酯。
[0065]
在另一特定的实施方式中，本发明的sln还包括另一种脂质组分，特别是在低于45℃的温度下为液体的脂质，其可以是饱和的或不饱和的。在室温下为液体的脂质选自具有少于10个碳原子的链的不饱和或饱和脂肪酸酯、油、脂肪酸和甘油三酯，以及它们的混合物(例如大豆油、肉豆蔻酸异丙酯、蓖麻油)。在优选的实施方式中，mygliol 212用作液体脂质。
[0066]
阳离子表面活性剂
[0067]
如本文所用，术语“阳离子表面活性剂”是指具有疏水部分和亲水部分的化合物，其在溶液中形成带正电荷的离子，通常是结合到疏水尾部的带正电荷的头部基团。疏水部分嵌入sln的脂质核心中，而亲水阳离子部分围绕并包裹所述核心，从而形成sln的亲水相。
[0068]
该组分为本发明的sln提供正电荷，这有助于其通过阳离子生物环境的吸收或在其上的吸附。
[0069]
在实施方式中，在本发明的多个sln中，至少50％、优选至少70％、更优选至少90％的sln不包括吸附在sln的表面上或形成吸附在sln的表面上的任何复合物的一部分的阳离子表面活性剂。百分比上限是根据用于制备sln的方法的精度确定的，并且可以高达90％、高达95％、高达99％或高达99.9％。
[0070]
在本发明的特定的实施方式中，阳离子表面活性剂选自线性或环状结构的伯、仲、叔和季铵盐，及其混合物，诸如例如吡啶、哌嗪盐。
[0071]
同样，可以使用这些铵盐的衍生物。铵盐衍生物被理解为在相同结构中并入至少两个伯、仲、叔和/或季氨基的那些盐，诸如例如胍盐、哌嗪盐和咪唑盐。该定义还包括氨基酸盐，诸如例如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或色氨酸盐。同样，该定义将涵盖其中正电荷在磷原子上而不是氮原子上的那些铵盐，诸如例如，双十四烷基(三甲基乙基膦)甲基膦酸碘化物、双十四烷基(丁基二甲基膦)甲基膦酸碘化物、双十四烷基(二甲基异丙基膦)甲基膦酸碘化物)或砷(双十四烷基(三甲基胂)甲基膦酸碘化物、二油烯基(三甲基膦)甲基膦酸碘化物)。
[0072]
在本发明的优选实施方式中，铵盐为四烷基铵盐、烷基苄基二甲基铵盐或杂环铵盐，更优选为鲸蜡基三甲基溴化铵(ctab)、n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)或n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)或1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)。
[0073]
在实施方式中，本发明的sln包括至少两种阳离子表面活性剂，诸如两种阳离子表面活性剂。更特别地，这两种阳离子表面活性剂是如上所述的铵盐，且最特别地它们选自dotap、dodap、dotma或ctab。
[0074]
非离子表面活性剂
[0075]
本发明的sln还包括非离子表面活性剂，其主要功能是控制sln的粒度并赋予其稳定性，防止后者破裂及其聚集体的形成。
[0076]
如本文所用，术语“非离子表面活性剂”是指具有疏水部分和亲水部分的允许产生乳液的化合物。
[0077]
在本发明的特定的实施方式中，非离子表面活性剂选自聚乙氧基化脱水山梨糖醇-脂肪酸酯，诸如聚山梨醇酯、聚乙二醇共聚物和聚丙二醇共聚物，诸如例如吐温、司盘、泊洛沙姆。优选地，非离子表面活性剂是聚乙氧基化脱水山梨糖醇-脂肪酸酯，更优选地它是聚山梨醇酯，特别是聚氧乙烯脱水山梨糖醇油酸酯，且最特别是吐温/聚山梨醇酯80。在另一优选的实施方式中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆。
[0078]
在实施方式中，本发明的sln包括至少两种非离子表面活性剂，诸如两种非离子表面活性剂。更特别地，两种非离子表面活性剂可以是如上所述的聚山梨醇酯和泊洛沙姆。
[0079]
金
[0080]
本发明的sln中的金可以是选自纳米棒、纳米椭圆体、纳米棱柱、纳米星、纳米笼和
纳米壳的纳米颗粒或纳米结构的形式。在优选的实施方式中，金是纳米颗粒的形式。这些金形式通常具有包括在1和100nm之间，更优选在2和50nm之间，诸如在2和8nm之间，或诸如在15和25nm之间的尺寸。
[0081]
本发明的多个sln还呈现多个金纳米颗粒或纳米结构，其平均尺寸包括在1和100nm之间，更优选在2和50nm之间，诸如在2和8nm之间，或诸如在15和25nm之间。“平均尺寸”被理解为多个金纳米颗粒或纳米结构的平均尺寸。仍然有可能找到尺寸大于上述规定的尺寸的孤立的金纳米颗粒或纳米结构，只要多个的平均尺寸在上述范围内即可。
[0082]
多个金通常呈现0.7或更低，更特别地在0.1和0.4之间的多分散性指数(pdi)。术语“多分散性”具有上述含义。
[0083]
此外，金纳米颗粒或纳米结构通常显示可以在-60mv至-20mv变化，并且更特别地在-50mv至-40mv变化的ζ电位。
[0084]
金纳米颗粒或纳米结构的尺寸、pdi和ζ电位以与上文针对本发明的sln所述相同的方式测量。
[0085]
该组分可以是sln结构的一部分或可以吸附在其表面上。当金是sln结构的一部分时，它与阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂一起存在于sln的亲水相中。
[0086]
已出乎意料地发现，将金、尤其是通常带负电荷的金纳米颗粒并入sln中，且特别是并入到sln的亲水相中或吸附在其上，对细胞穿透无害，即使理论上预期对同样带负电荷的细胞膜具有更大的排斥力/更低的亲和力。事实上，通过并入金纳米颗粒或纳米结构，可以显著提高核酸转染和表达水平。
[0087]
在实施方式中，在本发明的多个sln中，至少50％、优选至少70％、更优选至少90％的包括金的sln包括处于sln的亲水相或吸附在其上的金。百分比上限是根据用于制备sln的方法的精度确定的，并且可以高达90％、高达95％、高达99％或高达99.9％。
[0088]
在实施方式中，在本发明的多个sln中，至少50％、优选至少70％、更优选至少90％的包括金的sln包括处于sln的亲水相的金。百分比上限是根据用于制备sln的方法的精度确定的，并且可以高达90％、高达95％、高达99％或高达99.9％。
[0089]
在实施方式中，在本发明的多个sln中，至少50％、优选至少70％、更优选至少90％的包括金的sln包括吸附在sln的亲水相上的金。百分比上限是根据用于制备sln的方法的精度确定的，并且可以高达90％、高达95％、高达99％或高达99.9％。
[0090]
在本发明的sln中，金不与核酸共价结合。在多个sln中，至少50％、优选至少70％、更优选至少90％的金纳米颗粒或纳米结构没有与核酸共价结合。
[0091]
在本发明的上下文中，至少50％、优选至少70％、更优选至少90％的包括金的sln不包括处于sln的脂质核心的金。百分比上限是根据用于制备sln的方法的精度确定的，并且可以高达90％、高达95％、高达99％或高达99.9％。
[0092]
核酸
[0093]
本发明的sln可以包含核酸并将它们递送到细胞中，在那里它们被释放以发挥它们的治疗作用。
[0094]
核酸可以是sln结构的一部分或可以吸附在其表面上。当核酸是sln结构的一部分时，它与阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂一起存在于sln的亲水相中。
[0095]
如本文所用，术语“核酸”是指共价键合在一起的两个或更多个核苷酸的任何链，
包括但不限于核糖核酸(rna)，例如i)参与蛋白质合成的rna，诸如信使rna(mrna)，例如锌指核酸酶(zfn)编码mrna、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)编码mrna或crispr/cas9编码mrna、转移rna(trna)、转移信使rna(tmrna)、核糖体rna(rrna)；ii)参与转录后修饰或dna复制的rna，诸如核小rna(snrna)、核仁小rna(snorna)、smy rna、小卡哈尔体特异性rna(scarna)、指导rna(grna)、核糖核酸酶p(rnase p)、核糖核酸酶mrp(rnase mrp)、y rna、端粒酶rna组分(terc)、剪接前导rna(sl rna)；iii)调节rna，诸如反义rna(arna或asrna)、顺式天然反义转录本(cis-nat)、crispr rna(crrna)、长链非编码rna(lncrna)、微rna(mirna)、piwi相互作用rna(pirna)、小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、反式作用sirna(tasirna)、重复相关sirna(rasirna)、7sk rna、增强子rna(erna)；脱氧核糖核酸(dna)，诸如质粒或诸如锌指核酸酶(zfn)编码dna、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)编码dna或crispr/cas9编码dna、基因组dna(gdna)、互补dna(cdna)、线粒体dna(mtdna)、支架/基质附着区dna(s/mar dna)、反义dna(asdna)；或dna/rna杂交体。优选的rna是mrna、sirna、mirna和asrna，最优选mrna。优选的dna是质粒dna和asdna。在优选的实施方式中，核酸是mrna或dna质粒。在特定的实施方式中，核酸是mrna。在另一特定的实施方式中，核酸是dna质粒。
[0096]
一类优选的核酸是反义核酸，即可以结合由受试者的基因产生的mrna并使其失活的核酸。
[0097]
核酸可以由天然存在的核苷酸构成，或者它可以包括合成核苷酸(也称为核苷酸类似物)。后一种核苷酸的实例是2'-o-甲基核苷酸、锁核苷酸(lna)、桥接核苷酸(bna)、吗啉代和肽核苷酸(pna)。
[0098]
核酸可以是线性的(例如mrna)、环状的(例如dna质粒)或分支的。优选的线性核酸是寡核苷酸，即由6至200个，诸如10至30个核苷酸或核苷酸对(如果是寡核苷酸双链)构成的核酸。
[0099]
核酸可以是单链的，或部分或完全双链的。当为双链的时，核酸可以采用a-、b-、z-或p-构型。在本发明的优选实施方式中，核酸是单链的，且更优选是单链rna。在本发明的另一优选实施方式中，核酸是双链的，且更优选是双链dna。
[0100]
多糖
[0101]
在一些实施方式中，本发明的sln另外包括多糖。
[0102]
该组分可以是sln结构的一部分或可以吸附在其表面上。当多糖是sln结构的一部分时，它与阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂一起存在于sln的亲水相中。
[0103]
多糖可以通过离子相互作用与核酸形成复合物。所述复合物与先前形成的前体sln接触，使得由多糖和活性成分形成的复合物吸附在所述纳米颗粒的表面上或并入到sln的亲水相中。
[0104]
根据特定的实施方式，多糖包括至少三个单糖的结合。根据另一实施方式，多糖不是脂多糖。
[0105]
在实施方式中，多糖选自壳聚糖、右旋糖酐、卡拉胶、多聚乙酰神经氨酸、黄原胶、环糊精、糖胺聚糖及其混合物。优选地，多糖是右旋糖酐或糖胺聚糖。糖胺聚糖的实例是肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。优选地，糖胺聚糖是透明质酸。在特定的实施方式中，多糖是右旋糖酐。在另一特定的实施方式中，多糖是透明
质酸。
[0106]
带正电荷的肽
[0107]
在一些实施方式中，本发明的sln另外包括带正电荷的肽，即在溶液中电离成净正电荷的肽。优选地，带正电荷的肽是当处于10或更低的ph，诸如选自2.5至10的ph时，优选地当处于生理ph(ph 7.4)时带正电荷的肽。带正电荷的肽在本文中也称为“具有净正电荷的肽”。
[0108]
带正电荷的肽可以是sln结构的一部分或可以吸附在其表面上。当带正电荷的肽是sln的结构的一部分时，它与阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂一起存在于sln的亲水相中。
[0109]
替代地，带正电荷的肽可以通过离子相互作用与多糖和/或核酸一起形成复合物。所述复合物与先前形成的前体sln接触，使得由带正电荷的肽和多糖和/或核酸形成的复合物吸附在所述纳米颗粒的表面上。
[0110]
在本发明的特定的实施方式中，带正电荷的肽选自核信号肽和线粒体信号肽、精氨酰甘氨酰天冬氨酸(rgd)肽和细胞穿透肽(cpp)。所述肽优选选自鱼精蛋白和组蛋白，且最优选鱼精蛋白。
[0111]
在一个方面，本发明涉及一种悬浮液，其包括分散在悬浮介质中，诸如在水性悬浮介质，例如水或盐水中的如上文任何实施方式中所述的本发明的多个sln。相对于悬浮液的总重量，悬浮液可包括按重量计1至50％，优选按重量计10％至20％的本发明的sln。悬浮液可以包括另外的组分，诸如药学上可接受的赋形剂，如下文进一步描述。在实施方式中，悬浮液由本发明的sln和悬浮介质组成。
[0112]
在实施方式中，本发明的sln是冻干形式。这种形式适合于sln的储存及其在以后的重构，诸如重构为如上所述的悬浮液。发明人已经发现这样的程序基本上不会改变本发明的sln的转染能力。
[0113]
在另一方面，本发明涉及用于制备如任何上述实施方式中所述的sln或多个sln的不同方法。特别地，本文提供了两种类型的方法，并且称为“方法au”和“方法oro”。本发明人已出乎意料地发现，通过这些方法获得的sln(虽然包括相同的组分)在它们的物理性质和生物活性方面不同。这允许微调本发明的载体以适应不同的生物学环境，诸如不同特征的靶细胞。
[0114]
方法au
[0115]
在实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：
[0116]
a)制备前体sln的悬浮液，所述前体sln包括：
[0117]-在核心处的在室温下为固体的脂质；
[0118]-阳离子表面活性剂；以及
[0119]-非离子表面活性剂；
[0120]
b)制备溶液，所述溶液包括：
[0121]-核酸；
[0122]-金；以及
[0123]
c)将步骤a)中获得的前体sln的悬浮液与步骤b)中获得的溶液混合。
[0124]
步骤a)包括制备前体sln的悬浮液，诸如通过本领域技术人员熟知的方法。在实施
方式中，步骤a)包括：
[0125]
(i)制备包括在有机溶剂中的在室温下为固体的脂质的溶液；
[0126]
(ii)制备包括阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂的水性溶液；
[0127]
(iii)将水性溶液(ii)添加到有机溶液(i)中，并且搅拌所得混合物直至得到乳液；以及
[0128]
(iv)蒸发有机溶剂。
[0129]
步骤(i)包括制备包括在有机溶剂中的在室温下为固体的脂质的溶液，诸如通过本领域技术人员熟知的方法，诸如通过将在室温下为固体的脂质溶解在有机溶剂中。在实施方式中，相对于有机溶液的总重量，脂质组分的比例为按重量计至少0.1％，优选在0.1和40％之间。
[0130]
有机溶剂的选择在很大程度上取决于脂质组分以及如果合适还取决于待并入的核酸。尽管以上，仍优选使用药学上可接受的有机溶剂和使用尽可能少的量，因为它必须随后在得到前体sln的方法的最后步骤中被除去。
[0131]
在本发明的特定的实施方式中，有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮、氯仿，且更优选二氯甲烷。相对于在步骤(iii)中获得的乳液的总重量，有机溶剂的比例范围可以在按重量计1和60％之间，优选10和30％之间。
[0132]
当要使用在室温下为液体的脂质时，可以在步骤(i)中将其添加到有机溶液中。
[0133]
步骤(ii)包括制备包括阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂的水性溶液，诸如通过本领域技术人员熟知的方法，诸如通过将阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂溶解在水溶剂中。
[0134]
在步骤(iii)中，将水相添加到有机(脂质)相中。这种特定的添加顺序是优选的。对所得混合物进行剧烈搅拌直至获得乳液。一种优选的搅拌形式是超声处理。该步骤得到的乳液为水包油乳液。
[0135]
随后，在步骤(iv)，通过本领域技术人员已知的任何方法蒸发有机溶剂。在特定的实施方式中，通过将乳液保持在机械搅拌下至少五分钟，随后使其经受真空至少五分钟来进行有机溶剂蒸发步骤。在除去有机溶剂后，使脂质相固化，从而获得水性悬浮液形式的前体sln。
[0136]
在特定的实施方式中，步骤a)进一步包括从在步骤iv)中获得的前体sln悬浮液分离前体sln的步骤v)，诸如通过离心。在更特定的实施方式中，分离步骤包括将前体sln悬浮液冷却至包括在4和8℃之间的温度，并随后通过离心过滤前体sln。
[0137]
在实施方式中，可以将经过或不经过分离的前体sln冻干。冻干的sln可以被储存，并在以后重悬于任何悬浮介质中以用于本发明方法的步骤c)。
[0138]
在另一实施方式中，步骤a)包括：
[0139]
(i)熔化在室温下为固体的脂质，
[0140]
(ii)制备包括阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂的水性溶液，
[0141]
(iii)将水性溶液(ii)添加到熔化的脂质(i)中，并且搅拌所得混合物直至得到乳液；以及
[0142]
(iv)任选地，使乳液(iii)经受具有至少30psi的压力的均化过程。
[0143]
在步骤(i)中，在室温下为固体的脂质在高于其熔点的温度下被熔化。当要使用在
室温下为液体的脂质时，可以在此阶段将其添加到熔化的脂质中。
[0144]
步骤(ii)包括制备包括阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂的水性溶液，诸如通过本领域技术人员熟知的方法，诸如通过将阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂溶解在水溶剂中。
[0145]
在实施方式中，步骤(ii)包括将水性溶液加热至等于或高于步骤(i)的在室温下为固体的脂质的熔点的温度。例如，将步骤(i)中的在室温下为固体的脂质和步骤(ii)中的水性溶液独立地加热到相同的温度。
[0146]
在步骤(iii)中，将水相添加到有机(脂质)相中。这种特定的添加顺序是优选的。优选地，在水相和脂质相处于等于或高于步骤(i)的在室温下为固体的脂质的熔点的温度时进行添加。
[0147]
对所得混合物进行搅拌。一种优选的搅拌形式是超声处理。搅拌优选在等于或大于步骤(i)的在室温下为固体的脂质的熔点的温度下进行。该步骤中得到的乳液为水包油乳液。
[0148]
可以使获得的乳液冷却至低于步骤(i)的在室温下为固体的脂质的熔点。以这种方式，所述脂质沉淀并获得前体sln悬浮液。可以通过简单地去除加热并将乳液暴露于室温来自然进行冷却，或者优选通过使乳液经受低于室温的温度，诸如通过将包含乳液的容器置于冰浴中来加速冷却。
[0149]
任选地，在步骤(iv)中，通过本领域技术人员已知的任何方法对由步骤(iii)得到的乳液进行均化步骤，以获得前体sln的悬浮液。
[0150]“均化”被理解为允许通过机械方式减小由于进行步骤(i)至(iii)而在乳液中形成的小球的尺寸的任何方法。均化方法的实例包括高压均化、超声处理、高剪切混合或施加机械应力或冲击力。在步骤(iv)中，乳液(iii)可以用相同或不同的均化方法进行均化超过一次。
[0151]
当步骤(iii)的搅拌足以将乳液小球尺寸减小，并从而将悬浮液前体sln颗粒尺寸减小到期望的尺寸时，可以省略均化步骤。搅拌技术和时间会影响颗粒的尺寸。例如，当超声处理用作搅拌技术时，约30min的搅拌时间将产生约100-150nm的前体sln颗粒，而更少的时间将产生更大的尺寸，并且可能需要随后的压力均化步骤以进一步减小粒度。
[0152]
在特定的实施方式中，步骤a)进一步包括从在步骤iv)中获得的前体sln悬浮液分离前体sln的步骤v)，诸如通过离心。在更特定的实施方式中，分离步骤包括将前体sln悬浮液冷却至包括在4和8℃之间的温度并随后分离前体sln，诸如通过借助离心来过滤前体sln。
[0153]
在实施方式中，可以将经过或不经过分离的前体sln冻干。冻干的sln可以被储存，并在以后重悬于任何悬浮介质中以用于本发明方法的步骤c)。
[0154]
在实施方式中，包括在分离的前体sln或其多个中的在室温下为固体的脂质的量相对于分离的前体sln或其多个的总重量分别在按重量计10％和90％之间，优选在40％和80％之间，特别是约65％。这些值不包括任何悬浮介质。在另一实施方式中，当呈悬浮液形式时，在室温下为固体的脂质的量相对于前体sln悬浮液的总重量包括在按重量计0.1％和20％之间，优选在0.5％和5％之间。
[0155]
在另一实施方式中，包括在分离的前体sln或其多个中的在室温下为液体的脂质
的量相对于分离的前体sln或其多个的总重量分别在按重量计0.1和30％之间，优选在1和20％之间，特别是约7％。这些值不包括任何悬浮介质。在另一实施方式中，当呈悬浮液形式时，在室温下为液体的脂质的量相对于前体sln悬浮液的总重量包括在按重量计0.01和5％之间，优选在0.05和2％之间。
[0156]
在另一实施方式中，包括在分离的前体sln或其多个中的阳离子表面活性剂的量相对于分离的前体sln或其多个的总重量分别在按重量计2.5％和50％之间，优选在15％和35％之间，特别是约25％。这些值不包括任何悬浮介质。在另一实施方式中，当呈悬浮液形式时，阳离子表面活性剂的量相对于前体sln悬浮液的总重量范围在按重量计0.05％和10％之间，优选在0.1％和2％之间。
[0157]
在另一实施方式中，包括在分离的前体sln或其多个中的非离子表面活性剂的量相对于分离的前体sln或其多个的总重量分别在按重量计0.1和25％之间，优选在1和15％之间，特别是约7％。这些值不包括任何悬浮介质。在另一实施方式中，当呈悬浮液形式时，非离子表面活性剂的量相对于前体sln悬浮液的总重量包括在按重量计0.001和10％之间，优选在0.01和3％之间。
[0158]
应当理解，为前体sln、其多个或其悬浮液的每种组分选择的特定量的总和加起来将至多为分别相对于前体sln、其多个或其悬浮液的总重量100％的重量。
[0159]
在另一实施方式中，在本发明的方法期间添加的金的量为每mg分离的前体sln 105至9*10
17
个金颗粒数，优选在107和9*10
16
个金颗粒数之间。替代地，当前体sln处于悬浮液中时，每ml前体sln悬浮液中添加的金的量范围在106和9*10
19
个金颗粒数之间，优选在108和9*10
17
个金颗粒数之间。
[0160]
待添加的核酸的量在每种情况下将取决于待并入的核酸的性质、其使用的适应症和给药效率。在实施方式中，相对于分离的前体sln或其多个的总重量，添加的核酸的量按重量计在0.001％和95％之间，优选在0.1和60％之间，特别是约7％。替代地，当前体sln处于悬浮液中时，相对于前体sln悬浮液的总重量，添加的核酸的量为按重量计至多20％，优选在按重量计0.00001％和20％之间，优选在0.001和10％之间。
[0161]
在本发明的另一个变体中，当存在多糖时，相对于分离的前体sln或其多个的总重量，待添加的多糖的量按重量计在0.01和95％之间，优选在0.05和60％之间，特别是约15％。替代地，当前体sln处于悬浮液中时，相对于前体sln悬浮液的总重量，所添加的多糖的量包括在按重量计0.0001和20％之间，优选在0.001％和10％之间。
[0162]
在本发明的另一个变体中，当存在带正电荷的肽时，相对于分离的前体sln或其多个的总重量，待添加的带正电荷的肽的量包括在按重量计0.1％和95％之间，优选在0.5％和60％之间，特别是约15％。替代地，当前体sln处于悬浮液中时，相对于前体sln悬浮液的总重量，所添加的带正电荷的肽的量包括在按重量计0.001和20％之间，优选在0.01％和10％之间。
[0163]
前体sln悬浮液中前体sln的量的范围为每ml悬浮介质0.5至100、优选5至30mg前体sln。
[0164]
每种组分的上述量可以全部满足，或者可以仅满足它们中的一些，在这种情况下，以上针对每种组分指出的单独量的任何组合都被认为涵盖在本技术中。
[0165]
步骤b)包括制备包括核酸和金的溶液，诸如通过本领域技术人员熟知的方法，诸
如通过将核酸和金溶解在溶剂中。如果sln要包括多糖和/或带正电荷的肽，则将它们添加到步骤b)的溶液中。在实施方式中，首先制备核酸和金的溶液，然后——优选在搅拌之后——向其中添加多糖和/或带正电荷的肽。当要添加多糖和带正电荷的肽两者时，优选先添加带正电荷的肽，然后添加多糖，优选在两次添加之间进行搅拌。在优选的实施方式中，溶液是水性溶液，诸如水溶液。
[0166]
步骤c)涉及使步骤b)的溶液与在步骤a)中获得的前体sln接触。优选地，该接触在室温下进行诸如至少五分钟，以产生根据本发明的悬浮液。
[0167]
在替代的实施方式中，方法au进一步包括从在步骤c)获得的混合物中分离sln的步骤d)，诸如通过离心。在更特定的实施方式中，分离步骤包括将混合物冷却至包括在4和8℃之间的温度，并随后通过离心过滤sln。
[0168]
在实施方式中，可以将经过或不经过分离的sln冻干。冻干的sln可以被储存，并在以后重悬于任何悬浮介质中以产生根据本发明的悬浮液。
[0169]
本发明的药物组合物中使用的赋形剂可以在任何阶段添加到sln中。根据特定赋形剂的性质，将其在如上所述的前体sln的制备过程中添加到前体sln的亲脂或亲水相中，或在前体sln制备后添加到前体sln中，或在sln的制备过程中或制备后添加到sln中，或在悬浮液的制备过程中或制备后添加到悬浮液中。
[0170]
方法oro
[0171]
本发明的第二种方法与方法au的不同之处在于，在前体sln与核酸混合之前将金添加到前体sln中。因此，方法oro包括：
[0172]
a)制备前体金sln的悬浮液，所述前体金sln包括：
[0173]-在核心处的在室温下为固体的脂质；
[0174]-阳离子表面活性剂；
[0175]-非离子表面活性剂；以及
[0176]-金；
[0177]
b)制备包括核酸的溶液；以及
[0178]
c)将步骤a)中获得的前体金sln的悬浮液与步骤b)中获得的溶液混合。
[0179]
以上对于方法au描述的所有实施方式加上必要的更改适用于方法oro，但以下除外。
[0180]
不是在步骤b)中引入金，而是在步骤a)的过程中引入金。在实施方式中，在制备包括阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂的水性溶液的步骤(ii)期间添加金。在另一实施方式中，在步骤(iv)之后添加金，特别是将其添加到在步骤(iv)获得的前体sln悬浮液中，或者如果省略步骤(iv)，则将其添加到在步骤(iii)获得的前体sln悬浮液中。在任何一种情况下，待添加的金的量与以上对于方法au限定的量相同。如此获得的包含金的前体sln(前体金sln)可以如对于方法au描述的进行分离、冻干和重悬。类似地，其余组分的量是对于方法au限定的量。
[0181]
方法au和oro中使用的金可以通过本领域技术人员已知的多种方式获得，诸如以下中描述的那些：kimling et al.,j.phys.chem.b 2006,110,15700-15707；huang et al.,chem.eng.sci.volume 189,2november 2018,pages 422-430；li et al.,nanomedicine(lond).2015jan；10(2):299
–
320；或song et al.,langmuir 2011,27,
13854
–
13860。替代地，金可以从商业来源获得，诸如来自sigma aldrich(id 741949或741965)。
[0182]
在实施方式中，金通过turkevich方法获得。该方法包括在高温下，诸如在至少80℃，且优选在80℃和100℃之间，例如在90℃下，向氯金酸溶液中添加柠檬酸盐溶液，诸如柠檬酸钠。优选地，氯金酸溶液以水溶液提供。在实施方式中，氯金酸溶液被加热到刚刚高于所述的温度，并且一旦达到目标温度就添加柠檬酸钠，优选地以水溶液的形式，并且优选地被预先加热以避免反应混合物中温度下降。可以将另外的水加入到反应混合物中以调节反应体积的任何损失。反应混合物的搅拌可以最初在刚刚高于所述温度下进行，并随后在较低温度下进行，诸如在室温下。
[0183]
因此，在实施方式中，当通过turkevich方法制备金时，可以在本发明的方法期间以包含柠檬酸盐的溶液、优选水性溶液的形式添加金。替代地，在添加金之前，可以从所述溶液中去除柠檬酸盐。用于去除柠檬酸盐的方法是本领域技术人员已知的任何方法，诸如以下中描述的那些：g.s.perera et al.,journal of colloid and interface science 511(2018)335
–
343。
[0184]
因此，在相关实施方式中，本发明的sln或多个sln或悬浮液包括柠檬酸盐。
[0185]
在方法au或oro中的任一个中，添加的金与核酸的比例如下。
[0186]
在本文所述的任何实施方式中，核酸与金纳米颗粒的比例可以在每μg核酸1*107至9*10
12
个金纳米颗粒的范围内。影响待添加的金纳米颗粒的量的一个因素是金纳米颗粒的尺寸，对于较小尺寸需要更多数量的纳米颗粒。
[0187]
在实施方式中，根据方法au制备sln。优选地，在该sln中，核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸3.36*108至5.36*108个，诸如4.36*108个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸7.72*108至9.72*108个，诸如8.72*108个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸1.64*109至1.84*109个，诸如1.74*109个金纳米颗粒。在不同的实施方式中，这些比例也适用，但是根据方法oro制备sln。在本段的任何实施方式中，金可以具有在15和25nm之间，诸如20nm的尺寸。
[0188]
在实施方式中，sln还包括带正电荷的肽，优选鱼精蛋白，并且sln是根据方法au制备的。优选地，在该sln中，核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸3.36*108至5.36*108个，诸如4.36*108个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸7.72*108至9.72*108个，诸如8.72*108个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸1.64*109至1.84*109个，诸如1.74*109个金纳米颗粒。在不同的实施方式中，这些比例也适用，但是根据方法oro制备sln。在本段的任何实施方式中，金可以具有在15和25nm之间，诸如20nm的尺寸。
[0189]
在实施方式中，sln还包括带正电荷的肽，优选鱼精蛋白，以及多糖，优选右旋糖酐，并且sln是根据方法au制备的。优选地，在该sln中，核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸3.36*108至5.36*108个，诸如4.36*108个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸7.72*108至9.72*108个，诸如8.72*108个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例
范围为每μg核酸1.64*109至1.84*109个，诸如1.74*109个金纳米颗粒。在不同的实施方式中，这些比例也适用，但是根据方法oro制备sln。在本段的任何实施方式中，sln包括至少两种阳离子表面活性剂，优选dotap和dodap。在本段的任何实施方式中，金可以具有在15和25nm之间，诸如20nm的尺寸。
[0190]
在实施方式中，sln还包括带正电荷的肽，优选鱼精蛋白，以及多糖，优选透明质酸，并且sln是根据方法au制备的。优选地，在该sln中，核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸3.36*108至5.36*108个，诸如4.36*108个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸7.72*108至9.72*108个，诸如8.72*108个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸1.64*109至1.84*109个，诸如1.74*109个金纳米颗粒。在不同的实施方式中，这些比例也适用，但是根据方法oro制备sln。在本段的任何实施方式中，金可以具有在15和25nm之间，诸如20nm的尺寸。
[0191]
在实施方式中，根据方法au制备sln。优选地，在该sln中，核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸1.4*10
10
至0.1*10
10
个，诸如0.73*10
10
个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸2.67*10
10
至4.67*10
10
个，诸如3.67*10
10
个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸6.33*10
10
至8.33*10
10
个，诸如7.33*10
10
个金纳米颗粒。在不同的实施方式中，这些比例也适用，但是根据方法oro制备sln。在本段的任何实施方式中，金可以具有在2和8nm之间，诸如5nm的尺寸。
[0192]
在实施方式中，sln还包括带正电荷的肽，优选鱼精蛋白，并且sln是根据方法au制备的。优选地，在该sln中，核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸1.73*10
10
至0.1*10
10
个，诸如0.73*10
10
个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸2.67*10
10
至4.67*10
10
个，诸如3.67*10
10
个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸6.33*10
10
至8.33*10
10
个，诸如7.33*10
10
个金纳米颗粒。在不同的实施方式中，这些比例也适用，但是根据方法oro制备sln。在本段的任何实施方式中，金可以具有在2和8nm之间，诸如5nm的尺寸。
[0193]
在实施方式中，sln还包括带正电荷的肽，优选鱼精蛋白，以及多糖，优选右旋糖酐，并且sln是根据方法au制备的。优选地，在该sln中，核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸1.73*10
10
至0.1*10
10
个，诸如0.73*10
10
个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸2.67*10
10
至4.67*10
10
个，诸如3.67*10
10
个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸6.33*10
10
至8.33*10
10
个，诸如7.33*10
10
个金纳米颗粒。在不同的实施方式中，这些比例也适用，但是根据方法oro制备sln。在本段的任何实施方式中，sln包括至少两种阳离子表面活性剂，优选dotap和dodap。在本段的任何实施方式中，金可以具有在2和8nm之间，诸如5nm的尺寸。
[0194]
在实施方式中，sln还包括带正电荷的肽，优选鱼精蛋白，以及多糖，优选透明质酸，并且sln是根据方法au制备的。优选地，在该sln中，核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸1.73*10
10
至0.1*10
10
个，诸如0.73*10
10
个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相
同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸2.67*10
10
至4.67*10
10
个，诸如3.67*10
10
个金纳米颗粒。另一实施方式涉及这种非常相同的sln，其中核酸与金纳米颗粒的比例范围为每μg核酸6.33*10
10
至8.33*10
10
个，诸如7.33*10
10
个金纳米颗粒。在不同的实施方式中，这些比例也适用，但是根据方法oro制备sln。在本段的任何实施方式中，金可以具有在2和8nm之间，诸如5nm的尺寸。
[0195]
在任何上述实施方式中，步骤a)期间添加的在室温下为固体的脂质与步骤b)期间添加的核酸的重量/重量比为1:1至10:1，优选3:1至7:1，更优选为5:1。
[0196]
本发明的悬浮液可以在不去除不在本发明的sln的亲水相中也不吸附在本发明的sln表面上的金、核酸、多糖或带正电荷的肽的情况下使用。这些组分在本文中被称为“游离”组分并且可以是本发明的系统或悬浮液的一些制备方法的副产物。
[0197]
因此，在相关的实施方式中，本发明的悬浮液还包括存在于悬浮介质中并且不存在于本发明的sln的亲水相中也不吸附到本发明的sln表面上的金。因此，在实施方式中，相对于所述悬浮液中金的总重量，本发明的悬浮液中的金的按重量计至多80％、优选至多50％、甚至更优选至多20％是游离金。
[0198]
类似地，在相关的实施方式中，本发明的悬浮液还包括存在于悬浮介质中并且不存在于本发明的sln的亲水相中也不吸附到本发明的sln表面上的核酸。因此，在实施方式中，相对于所述悬浮液中核酸的总重量，本发明的悬浮液中的核酸的按重量计至多80％、优选至多50％、甚至更优选至多20％是游离核酸。在单链和双链核酸的情况下，游离核酸的重量可能由于它们不同的分子结构以及因此与本发明的sln的不同相互作用而不同。因此，在实施方式中，对于这些核酸中的每一种，游离核酸的量独立地选自上述列表。
[0199]
类似地，在相关的实施方式中，本发明的悬浮液还包括存在于悬浮介质中并且不存在于本发明的sln的亲水相中也不吸附到本发明的sln表面上的多糖。因此，在实施方式中，相对于所述悬浮液中多糖的总重量，本发明的悬浮液中的多糖的按重量计至多80％、优选至多50％、甚至更优选至多20％是游离多糖。
[0200]
类似地，在相关的实施方式中，本发明的悬浮液还包括存在于悬浮介质中并且不存在于本发明的sln的亲水相中也不吸附到本发明的sln表面上的带正电荷的肽。因此，在实施方式中，相对于所述悬浮液中带正电荷的肽的总重量，本发明的悬浮液中的带正电荷的肽的按重量计至多80％、优选至多50％、甚至更优选至多20％是游离带正电荷的肽。
[0201]
类似地，本发明的悬浮液中也可以包括不具有在其亲水相中或吸附在sln表面上的金的sln。因此，在实施方式中，悬浮液中所有sln的按重量计至多80％、优选至多50％、甚至更优选至多20％是不具有在其亲水相中或吸附在sln表面上的金的sln。
[0202]
在另一重要方面，本发明涉及通过在任何上述实施方式中的本文所述的任何方法获得的sln，或多个sln，或其悬浮液。
[0203]
例如，本发明的悬浮液是通过制备如本文任何地方所述的前体sln悬浮液，诸如以本文所述的量，并且以本文所述的量添加金、核酸和任选的本发明的sln的其余组分而获得的悬浮液。
[0204]
在另一方面，本发明涉及如上所述的前体金sln。
[0205]
本发明的另一目的是药物组合物，其包括本发明的sln或多个sln，或本发明的悬浮液，以及药学上可接受的赋形剂。
disease)；视网膜母细胞瘤；颗粒状角膜营养不良；富克斯角膜营养不良(fuchs’corneal dystrophy)；胶滴状角膜营养不良；角膜移植排斥；以及与粘多糖贮积症相关的角膜表面混浊。优选的疾病是x连锁青少年视网膜劈裂症。
[0218]
在特定的实施方式中，待治疗的疾病是心脏病。这样的疾病的实例是心脏肥大，诸如心室肥大；心脏肥大相关或自噬性疾病，诸如肺静脉狭窄、心房或室间隔缺损、肥厚性非阻塞性或阻塞性心肌病或法布里病；和/或心脏功能障碍，诸如收缩功能障碍、心脏失代偿或心力衰竭、心肌梗塞后的心室重构或心肌炎。
[0219]
在特定的实施方式中，待治疗的疾病是溶酶体贮积病。溶酶体贮积病是一类大约50种不同的人类代谢疾病，由特定溶酶体蛋白的缺乏引起，导致各种物质在内体/溶酶体隔室内积累。这样的疾病的实例是蓬佩(pompe)病、法布里(fabry)病和戈谢(gaucher)病、mps i、mpsii、mps vii、泰-萨克斯病(tay sachs)、桑德霍夫病(sandhoff)、α-甘露糖贮积病或沃尔曼(wohlman)病。优选的疾病是法布里病。
[0220]
本发明还涉及本发明的sln或多个sln或悬浮液的美容用途，更特别地，美容基因治疗用途。这样的用途的实例是治疗油性皮肤、痤疮、皮肤干燥、不希望的肤色或老化或其影响，诸如皱纹或缺乏皮肤紧实度。如上述治疗用途所解释的，美容基因治疗涉及与上述美容状况相关的基因。
[0221]
下面描述了一些清楚地显示本发明的特征和优点的说明性实例，然而，它们不能被解释为限制如权利要求中定义的本发明的目的。
[0222]
实施例
[0223]
通过以下方法表征本发明的sln：
[0224]
1.显微镜图像
[0225]
通过透射电子显微镜(tem)观察金颗粒和sln。将10μl样品粘附在辉光放电的碳包覆的网格上60s。在通过滤纸吸干除去剩余液体后，用2％乙酸双氧铀进行染色60s。使用philips em208s tem对样品进行可视化，并在olympus sis紫色数码相机上获取数字图像。
[0226]
2.粒度和表面电荷
[0227]
通过动态光散射(dls)、更特别地光子相关光谱(pcs)测量金颗粒和sln的粒度和pdi。通过激光多普勒测速法测量表面电荷。两个参数均由zetasizer nano zs测量。
[0228]
3.转染和表达研究
[0229]
在arpe-19(人视网膜色素上皮细胞)、hek-293(人胚肾细胞)、hl-1(成年大鼠心肌细胞)和/或(永生化法布里内皮细胞系-1)细胞系中进行核酸转染和表达研究。arpe-19细胞保持在具有10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素抗生素的dulbecco改良的eagle培养基:营养素混合物f-12(dmem/f-12)中培养。hek293细胞保持在具有10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素抗生素的eagle最低必需培养基(emem)中培养。hek293细胞保持在具有10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素抗生素、0.1mm去甲肾上腺素和2mm l-谷氨酰胺的claycomb培养基中培养。imfe-1细胞保存在包含ebm
tm-2基础培养基和egm
tm-2singlequots
tm
补充剂中。将细胞培养物保持在37℃于5％co2的空气气氛中，每2或3天更换培养基。
[0230]
对于arpe-19细胞，转染研究在密度为每孔60,000个细胞的12孔板中进行。对于hek293细胞，转染研究在密度为每孔100,000个细胞的24孔板中进行。对于hl-1细胞，转染研究在密度为每孔150,000个细胞的24孔板中进行。对于imfe细胞，转染研究在每孔30,000
个细胞的24孔板中进行。将培养物孵育直至达到80-90％汇合。当达到80-90％汇合时，去除部分培养基，留下覆盖整个孔所必需的体积，然后添加待研究的纳米颗粒系统。将它们孵育4小时，并然后添加更多体积的新鲜培养基。添加到每个孔中的载体的量相当于2.5μg的dna或mrna。
[0231]
实施例1金纳米颗粒的制备
[0232]
金纳米颗粒(aunp)从sigma aldrich(参考号741965)获得或通过turkevich方法制备。将10ml的1mm四氯金酸(haucl4)溶液加热至90℃，并然后在连续搅拌下添加1ml的38.8mm柠檬酸钠(na3c6h5o7)溶液。在柠檬酸盐添加2分钟后，添加3ml蒸馏水以保持反应体积。在柠檬酸盐添加5分钟后(深红色)，添加1.5ml蒸馏水，停止加热并搅拌反应混合物。在柠檬酸盐添加8分钟后，停止搅拌并使反应混合物冷却。金纳米颗粒的tem图像如图1所示。
[0233]
实施例2(对比).不具有金、带正电荷的肽或多糖(sln)的sln的制备
[0234]
制备在二氯甲烷(2ml)中的5％precirol溶液。另外，制备0.4％dotap和0.1％吐温80的水性溶液(10ml)。将水相添加到油相中，使混合物经受剧烈搅拌直至获得乳液。然后蒸发有机溶剂，将乳液保持在机械搅拌下至少5分钟，随后将其置于真空中至少5分钟。脂质因此沉淀，获得sln悬浮液。在冷却至4和8℃之间的温度后，通过离心过滤sln并重悬于纯化水中。
[0235]
制备于蒸馏水中的0.2μg/μl核酸(pcdna3-egfp或egfp mrna)溶液。然后将sln悬浮液与包含核酸(mrna或dna)的溶液以5:1的比例(表示为dotap和核酸之间的重量/重量比)接触，并在室温下保持搅拌20分钟。所得混合物按原样进行测试。
[0236]
实施例3(对比).不具有金或多糖但具有带正电荷的肽的sln(sln-p)的制备。
[0237]
如实施例2中所述制备sln，只是将鱼精蛋白添加到包含核酸的溶液中，并将混合物搅拌5分钟，然后与sln悬浮液接触。
[0238]
实施例4(对比).不具有金但具有带正电荷的肽和多糖(右旋糖酐)的sln(sln-p-dx)的制备
[0239]
如实施例2所述制备sln，只是将鱼精蛋白和右旋糖酐添加到包含核酸的溶液中。将鱼精蛋白和核酸的混合物搅拌5分钟，然后与右旋糖酐接触。将鱼精蛋白、核酸和右旋糖酐的混合物搅拌15分钟，然后与sln悬浮液接触。
[0240]
实施例5(对比).不具有金但具有带正电荷的肽和多糖(透明质酸)的sln(sln-p-ha)的制备
[0241]
如实施例2所述制备sln，只是将鱼精蛋白和透明质酸添加到包含核酸的溶液中。将鱼精蛋白和核酸的混合物搅拌5分钟，然后与透明质酸接触。将鱼精蛋白、核酸和透明质酸的混合物搅拌15分钟，然后与sln悬浮液接触。
[0242]
实施例6.通过方法au制备具有金且不具有带正电荷的肽或多糖的sln(sln_au)
[0243]
如实施例2中所述制备sln，只是将实施例1的金纳米颗粒添加到包含核酸的溶液中，并将混合物搅拌15分钟，然后与sln悬浮液接触。
[0244]
实施例7.通过方法au制备具有金且不具有多糖但具有带正电荷的肽的sln(sln_au-p)
[0245]
如实施例2所述制备sln，只是将实施例1的金纳米颗粒以及鱼精蛋白添加到包含核酸的溶液中。将金纳米颗粒和核酸的混合物搅拌15分钟，然后与鱼精蛋白接触。将金纳米
颗粒、核酸和鱼精蛋白的混合物搅拌5分钟，然后与sln悬浮液接触。
[0246]
实施例8.通过方法au制备具有金、带正电荷的肽和多糖(右旋糖酐)的sln(sln_au-p-dx)
[0247]
如实施例2所述制备sln，只是将实施例1的金纳米颗粒以及鱼精蛋白和右旋糖酐添加到包含核酸的溶液中。将金纳米颗粒和核酸的混合物搅拌15分钟，然后与鱼精蛋白接触。将金纳米颗粒、核酸和鱼精蛋白的混合物搅拌5分钟，然后与右旋糖酐接触。将金纳米颗粒、核酸、鱼精蛋白和右旋糖酐的混合物搅拌15分钟，然后与sln悬浮液接触。
[0248]
实施例9.通过方法au制备具有金、带正电荷的肽和多糖(透明质酸)的sln(sln_au-p-ha)
[0249]
如实施例2所述制备sln，只是将实施例1的金纳米颗粒以及鱼精蛋白和透明质酸添加到包含核酸的溶液中。将金纳米颗粒和核酸的混合物搅拌15分钟，然后与鱼精蛋白接触。将金纳米颗粒、核酸和鱼精蛋白的混合物搅拌5分钟，然后与透明质酸接触。将金纳米颗粒、核酸、鱼精蛋白和透明质酸的混合物搅拌15分钟，然后与sln悬浮液接触。获得的sln系统的tem图像如图2所示。
[0250]
实施例10.通过方法oro制备具有金且不具有带正电荷的肽或多糖的sln(sln_oro)
[0251]
如实施例2中所述制备sln，只是在前体金sln的制备过程中将实施例1的金纳米颗粒添加到水相中。
[0252]
实施例11.通过方法oro制备具有金且不具有多糖但具有带正电荷的肽的sln(sln_oro-p)
[0253]
如实施例2中所述制备sln，只是在前体金sln的制备过程中将实施例1的金纳米颗粒添加到水相中，并将鱼精蛋白添加到包含核酸的溶液中；将鱼精蛋白和核酸的混合物搅拌5分钟，然后与前体金sln接触。
[0254]
实施例12.通过方法oro制备具有金、带正电荷的肽和多糖(右旋糖酐)的sln(sln_oro-p-dx)
[0255]
如实施例2所述制备sln，只是在前体金sln的制备过程中将实施例1的金纳米颗粒添加到水相中，并将鱼精蛋白和右旋糖酐添加到包含核酸的溶液中。将鱼精蛋白和核酸的混合物搅拌5分钟，然后与右旋糖酐接触。将鱼精蛋白、核酸和右旋糖酐的混合物搅拌15分钟，然后与前体金sln接触。
[0256]
实施例13.通过方法oro制备具有金、带正电荷的肽和多糖(透明质酸)的sln(sln_oro-p-ha)
[0257]
如实施例2所述制备sln，只是在前体金sln的制备过程中将实施例1的金纳米颗粒添加到水相中，并将鱼精蛋白和右旋糖酐添加到包含核酸的溶液中。将鱼精蛋白和核酸的混合物搅拌5分钟，然后与透明质酸接触。将鱼精蛋白、核酸和透明质酸的混合物搅拌15分钟，然后与前体金sln接触。
[0258]
实施例14.sln的物理性质
[0259]
测量包括mrna或质粒dna作为核酸的sln的尺寸、分散性和表面电荷。实例如下所示。sln本身表示不含金的固体脂质纳米颗粒。扩展_au或_oro分别表示根据方法au或方法oro制备的根据本发明的sln。
[0260] 尺寸/nmpdiζ电位/mv金27.1
±
2.10.37
±
0.03-45.1
±
1.4sln268.60
±
9.970.41
±
0.0236.07
±
0.80sln_oro267.23
±
6.600.42
±
0.0336.75
±
0.92sln-p167.00
±
3.940.22
±
0.0238.02
±
4.29sln_au-p164.53
±
0.060.23
±
0.0137.35
±
1.13sln-p-ha602.93
±
37.480.89
±
0.121.28
±
0.88sln_au-p-ha208.97
±
3.620.34
±
0.0129.35
±
0.39sln_p-dx*164.50
±
4.040.31
±
0.0348.17
±
5.47sln_au-p-dx*154.33
±
4.710.30
±
0.0447.77
±
1.90sln_oro-p-dx*151.33
±
1.700.28
±
0.0343.75
±
1.74
[0261]
*使用商业5nm金纳米颗粒和dna作为核酸进行测试。
[0262]
正如可以观察到的，尽管在sln系统中添加了另外的组分，但金的并入不会导致尺寸/pdi增加，甚至会产生具有较低尺寸/pdi的sln。这种效果在包括gag多糖的sln中特别显著。
[0263]
实施例15.sln的转染能力
[0264]
测量了利用不同sln系统在不同细胞系中实现的转染细胞的百分比。
[0265]
代表性实例如下所示。
[0266][0267][0268]
*使用商业5nm金纳米颗粒进行测试
[0269]
如可以观察到的，将金并入sln产生了提高的转染水平。对于mrna和dna两者以及
在非常不同的细胞系中都观察到提高的转染。
[0270]
实施例16.sln的表达能力
[0271]
测量在其中转染gfp-编码-核酸后细胞发射的荧光强度。代表性实例如下所示。
[0272] 细胞系核酸荧光强度/rfuslnarpe-19dna15823.35
±
2133sln_oroarpe-19dna274320.35
±
1800slnarpe-19dna15823.35
±
2133sln_auarpe-19dna260473.05
±
14960sln-p-dx*arpe-19dna195092.05
±
32068sln_au-p-dx*arpe-19dna283810.20
±
66701slnoro-p-dx*arpe-19dna230255.
±
6449sln-phek-293mrna351519.20
±
12858sln_au-phek-293mrna419097.10
±
20998sln-p-haarpe-19mrna202270.10
±
111sln_oro-p-haarpe-19mrna453336.33
±
19sln-p-haarpe-19mrna202270.10
±
111sln_au-p-haarpe-19mrna267546.23
±
21sln-p-dxhek-293dna249593.90
±
10445sln_oro-p-dxhek-293dna482162.45
±
18800sln-p-dxarpe-19mrna125533.45
±
893sln_oro-p-dxarpe-19mrna495108.55
±
85slnhl-1mrna9543.77
±
1136sln_auhl-1mrna63564.67
±
2990sln-p-dximfe-1mrna109838.00
±
7745sln_au-p-dximfe-1mrna195672.63
±
23612sln-p-dx*imfe-1dna470962.17
±
13412sln_au-p-dx*imfe-1dna555295.83
±
31727sln_oro-p-dximfe-1dna535023.03
±
34748
[0273]
*使用商业5nm金纳米颗粒进行测试
[0274]
如可以观察到的，将金并入sln产生了提高的核酸表达水平。对于mrna和dna两者以及在非常不同的细胞系中都观察到提高的表达。
[0275]
实施例17.通过热熔乳化制备的sln和转染/表达能力
[0276]
将100mg precirol加热至75-85℃。另外，制备40mg dotap和10mg吐温80的水溶液(10ml h2o)并加热至75-85℃。将水相添加到油相中，在75-85℃的温度下对混合物进行30分钟的超声处理，并使所得混合物在冰中冷却以使脂质沉淀并获得sln悬浮液，向其中添加实施例1的金纳米颗粒。
[0277]
制备在蒸馏水中的egfp mrna溶液。首先将鱼精蛋白，并然后将右旋糖酐添加到溶液中，然后将其搅拌15min。然后使前体金sln悬浮液与包含核酸、鱼精蛋白和右旋糖酐的溶液以5:1比例(表示为dotap和核酸之间的重量/重量比)接触，并将混合物保
持在室温下搅拌20分钟。所得制剂在arpe-19细胞系中进行测试。
[0278]
测量转染细胞的百分比并与不包含金的sln制剂的转染细胞百分比进行比较：
[0279] 细胞系核酸％转染细胞sln-p-dxarpe-19mrna71.46
±
1.52sln_oro-p-dxarpe-19mrna75.27
±
1.08
[0280]
还测量了在其中转染gfp-编码-核酸后细胞发射的荧光的强度：
[0281] 细胞系核酸荧光强度/rfusln-p-dxarpe-19mrna263443
±
10700sln_oro-p-dxarpe-19mrna365073
±
23981
[0282]
实施例18.通过热熔乳化制备的sln和转染/表达能力
[0283]
如实施例17中所述制备sln，只是使用30mg ctab作为阳离子表面活性剂并且使用20mg泊洛沙姆338作为非离子表面活性剂。
[0284]
此外，用相同的组分制备第二组sln，但在与前体sln接触之前将金添加到核酸、鱼精蛋白和右旋糖酐中(方法au)。
[0285]
测量转染细胞的百分比并与不包含金的sln制剂的转染细胞百分比进行比较：
[0286] 细胞系核酸％转染细胞sln-p-dxarpe-19mrna5.91
±
1.25sln_oro-p-dxarpe-19mrna11.39
±
3.86sln_au-p-dxarpe-19mrna13.12
±
2.46
[0287]
还测量了在其中转染gfp-编码-核酸后细胞发射的荧光的强度：
[0288] 细胞系核酸荧光强度/rfusln-p-dxarpe-19mrna3013.80
±
228.78sln_oro-p-dxarpe-19mrna3540.03
±
428.27sln_au-p-dxarpe-19mrna3320.27
±
527.12
[0289]
实施例19.通过方法au制备具有金、带正电荷的肽和多糖(右旋糖酐)的sln(sln_au-p-dx)以及转染/表达能力
[0290]
如实施例8所述制备sln，只是将一半量的dotap替换为dodap。
[0291]
测量转染细胞的百分比并与不包含金的sln制剂的转染细胞百分比进行比较：
[0292] 细胞系核酸％转染细胞sln-p-dxhek-293mrna42.13
±
0.76sln_au-p-dxhek-293mrna56.40
±
2.31
[0293]
还测量了在其中转染gfp-编码-核酸后细胞发射的荧光的强度：
[0294] 细胞系核酸荧光强度/rfusln-p-dxarpe-19mrna311369
±
12034sln_au-p-dxarpe-19mrna395461
±
117
[0295]
实施例20.通过方法oro制备具有金、带正电荷的肽和多糖(右旋糖酐)的sln(sln_oro-p-dx)以及转染/表达能力
[0296]
如实施例12所述制备sln，只是将一半量的吐温80替换为泊洛沙姆338。
[0297]
测量转染细胞的百分比并与不包含金的sln制剂的转染细胞百分比进行比较：
[0298] 细胞系核酸％转染细胞sln-p-dxarpe-19mrna82.60
±
2.04sln_oro-p-dxarpe-19mrna88.03
±
0.59
[0299]
还测量了在其中转染gfp-编码-核酸后细胞发射的荧光的强度：
[0300] 细胞系核酸荧光强度/rfusln-p-dxarpe-19mrna660812
±
42769sln_oro-p-dxarpe-19mrna758814
±
12685
[0301]
实施例21.通过方法au(sln_au-p-dx)或方法oro(sln_oro-p-dx)制备具有金、带正电荷的肽和多糖(右旋糖酐)的sln以及转染/表达能力
[0302]
如实施例8或12中所述制备sln，只是使用单硬脂酸甘油酯代替precirol。
[0303]
测量转染细胞的百分比并与不包含金的sln制剂的转染细胞百分比进行比较：
[0304] 细胞系核酸％转染细胞sln-p-dxarpe-19mrna66.16
±
1.62sln_au-p-dxarpe-19mrna84.35
±
1.84sln_oro-p-dxarpe-19mrna74.96
±
0.90
[0305]
还测量了在其中转染gfp-编码-核酸后细胞发射的荧光的强度：
[0306] 细胞系核酸荧光强度/rfusln-p-dxarpe-19mrna142407
±
8993sln_au-p-dxarpe-19mrna239483
±
7875sln_oro-p-dxarpe-19mrna157815
±
3448
[0307]
实施例22.通过方法oro制备具有金、带正电荷的肽和多糖(右旋糖酐)的冻干sln(sln_oro-p-dx)以及转染能力
[0308]
如实施例12中所述制备sln，只是将前体金sln分离、冻干、以冻干状态储存一个月，并重构为悬浮液，然后与包括鱼精蛋白、右旋糖酐和核酸的溶液接触。
[0309]
评估了用根据实施例12的sln、用不包含金的等效制剂和用具有如上所述的中间冻干的根据实施例12的sln实现的转染细胞的百分比：
[0310][0311]
实施例23.体内试验
[0312]
为了评估本发明的sln转染角膜的能力，将包含具有cleancap
tm
egfp mrna(trilink biotechnologies)作为核酸的sln-p-ha或sln_au-p-ha的滴眼剂局部施用在c57bl/6小鼠的眼表面上。该mrna编码报告基因gfp，它是一种细胞内蛋白质。该体内研究得到了巴斯克大学动物实验伦理委员会upv/ehu的批准，并且程序符合西班牙和欧盟(eu)法律。
[0313]
在3天内每天施用总共4.5μg mrna。使用微量移液器向每只动物的一只眼睛(另一只眼睛作为对照)以3min间隔给药三个滴注剂的2.5μl制剂，两次间隔12h。
[0314]
最后一次给药后四十八小时，处死小鼠并取出眼球，固定，并且切片。进行免疫荧光染色以定性评估gfp表达。在zeiss lsm800共聚焦显微镜(zeiss显微镜，上科亨，德国)下检查组织切片。使用顺序采集来避免荧光发射光谱的重叠。
[0315]
获得的图像显示sln-p-ha(图3a)和sln_au-p-ha(图3b)都能够转染角膜组织；而对照证实没有荧光。然而，在用制剂sln_au-p-ha处理的小鼠角膜中，上皮和内皮层的荧光强度更高，并因此产生的蛋白质的量更高。对于也具有dna作为核酸的根据本发明的其他sln，诸如在制剂sln_au-p-dx(图3c)或sln_oro-p-dx(图3d)中，也证实了类似的表达模式。