一种淡紫拟青霉微菌核的生产方法及其应用与流程

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种生防真菌的中试生产方法。


背景技术：

2.植物线虫是一种世界性病害，可侵染3000种作物，包括绝大多数粮食和经济作物，也是造成作物连作障碍的主要原因。线虫感染后，农作物生长受阻，产量、品质严重下降，据统计，每年由植物线虫造成的损失高达1570亿美元。由于线虫可以在土壤和病残体中越冬存活，难于清除，一旦有适宜的环境和寄主，线虫便可以再次侵染，并且感染后极易大面积扩散、流行，给病害的防控带来巨大的压力。植物寄生线虫中又以根结线虫和胞囊线虫危害最为严重，其中根结线虫常见的种有15个，可侵染大多数粮食作物、油料作物、纤维作物、蔬菜、果树、烟草、茶叶、中草药、花卉等，在我国每年损失超过700亿元。受到侵染后植物的根会形成大量根结，阻碍养分和水的吸收和传输，同时，造成的伤口又容易感染其他真菌和细菌病害，根结线虫发生严重时可造成作物绝产。胞囊线虫主要危害小麦、水稻、马铃薯和大豆，严重时可减产70~80%。
3.在生产中可通过轮作、种植抗病品种、合理施肥、高温闷棚等方法控制线虫病害的发生，但都存在一定的局限性，难以大面积实行。目前，主要还是依靠化学农药，通过土壤处理，以及种子和苗木处理实现线虫的防治。但是长期大量施用化学农药不可避免地造成农田土壤环境污染、农产品农药残留超标，同时，还易出现苗期药害、病原物产生抗药性等问题。人们发现，植物线虫有众多天敌，如真菌、细菌、捕食性线虫。淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus，又名淡紫紫孢菌purpureocillium lilacinum）是一类丝状真菌，也是一类重要的食线虫真菌，属于半知菌亚门的丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，分布极其广泛。淡紫拟青霉可以寄生根结线虫、胞囊线虫等植物线虫的卵、雌虫和胞囊，产生几丁质酶、葡聚糖酶等细胞壁水解酶，还可以分泌多种杀线虫化合物和抑菌活性物质。前期我们对我国11个省市农田土壤中80余种作物上根结线虫寄生菌物调查发现，淡紫拟青霉分离频率最高，且在多地为优势种。自1979年jatala首次发现了该菌对线虫的寄生作用以来，淡紫拟青霉已显示出巨大的生防潜力，并且，已有一些商品化制剂登记和应用。目前，淡紫拟青霉制剂的主要活性组分为分生孢子和菌丝，抗逆性差、货架期短，难以满足农业生产的要求，也很大程度上限制了淡紫拟青霉菌剂的大规模生产和应用。
4.研究发现，淡紫拟青霉在一定条件下可以形成一种特殊的抗性结构—微菌核（microsclerotia）。微菌核是由大量菌丝缠绕特化而成，是丝状真菌抵御高温、低温、干旱等不良环境的抗性休眠体。与那些体积较大，且具有明显菌丝变异分化和组织结构的菌核不同，微菌核有时不存在特定的组织分化，其菌丝聚集的紧密程度也存在很大差异。一些植物病原真菌，如大丽轮枝菌、大豆炭疽病菌等，它们可以在植物衰老组织中产生微菌核，帮助其越冬存活，当温湿度条件合适时，微菌核重新萌发。近期研究发现，绿僵菌、野村菌和白僵菌等虫生真菌在特定液体培养基中也可以产生微菌核。微菌核抗性结构对延长生防真菌制剂的货架期，促进真菌生防菌剂的商品化具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明主要针对当前生产中淡紫拟青霉孢子制剂货架期短、田间防效不稳定的问题，提供一种可中试生产的淡紫拟青霉微菌核液体发酵和制剂加工方法，制备抗逆性强、生防效果显著的淡紫拟青霉微菌核制剂，并在防治根结线虫和胞囊线虫等重要植物线虫中进行应用。因此本发明的第一个目的是提出一种淡紫拟青霉微菌核的生产方法。
6.本发明的第二个目的是提供所述生产方法的应用。
7.实现本发明上述目的的技术方案为：一种淡紫拟青霉微菌核的生产方法，包括以下步骤：1）将淡紫拟青霉菌株在pda平板培养基上培养1周，洗脱孢子，或用接种环刮取平板上的菌丝及孢子，接种于摇瓶种子培养基中；2）将接种淡紫拟青霉的摇瓶振荡培养，经一级或二级摇瓶培养制得种子液；3）将种子液接种于发酵罐中，制备微菌核发酵液；所述种子液与液体发酵培养基的体积比为1：(100~200)，发酵培养温度为25~28℃，搅拌速度150~200 r/min，通气量为0.3~1，发酵罐中的培养时间为3~4天；发酵罐中发酵培养基单位体积内所含各种原料干物质重量如下：蔗糖30~50 g/l、酵母浸粉7.5~15 g/l、豆粕粉5~8 g/l、吐温-80 0.01~0.05ml/l、kh2po
4 4.0~5.0 g/l、无水cacl
2 0.7~1.2 g/l、mgso4•
7h2o 0.5~1.0 g/l、feso4•
7h2o 0.05~0.1 g/l、znso4•
7h2o 15~30 mg/l、mnso
4 15~30 mg/l、na2moo4•
2h2o 10~30 mg/l、硫胺素0.5~1mg/l，调节ph值为5.0~6.5。
8.4）将发酵液中加入载体填料，干燥，过筛，制备微菌核制剂。
9.其中，步骤1）中所述种子培养基单位体积内所含各种原料干物质重量如下：蔗糖20~40 g/l、酵母浸粉7.5~15 g/l、k2hpo4•
3h2o 0.5~1 g/l、mgso4•
7h2o 0.5~1g/l、nacl 0.5~1 g/l、znso4•
7h2o15~30 mg/l，调节ph值为6.0~6.5。
10.其中，步骤2）中所述种子培养条件为25~28℃，150~200 r/min，经二级摇瓶培养的第2级种子液接种量2~3%。
11.进一步优选地，步骤2）中，经一级摇瓶培养制得种子液，培养时间是3~4天；或经二级摇瓶培养制得种子液，其中第1级种子液振荡培养2~3天，第2级种子液振荡培养2~4天。
12.基于本发明的摇瓶培养条件，摇瓶培养得到的种子液浓度为2~10
×
108孢子/ml。
13.步骤3）中，通气量为0.3~1，其起始通气量0.3~0.4，发酵过程中需要调节，调节方式为本领域公知的方式。
14.步骤3）中所述发酵罐装液系数可以为0.5~0.7。
15.优选地，步骤4）中所述填料为硅藻土、淀粉和稻壳粉中的一种或几种；所述微菌核发酵液与填料的重量比为1：(0.7~1.5)。
16.因为硅藻土吸附性好、吸水力强，稻壳粉吸附后易于分散，因此步骤4）中所述填料优选为硅藻土和稻壳粉的组合，两者的重量比为（2~4）：1。
17.采用本发明的发酵条件，步骤3）中所述发酵液中含有1.0~5.0
×
104个/ml微菌核，微菌核大小为200~600 μm；所述微菌核的形成过程为首先孢子聚集、萌发，进而菌丝不断缠绕，形成紧实的抗逆结构。
18.其中，步骤4）中所述微菌核制剂干燥温度为30~35℃，干燥至含水量在13％以下。
干燥时间可以为6~24 h。
19.本发明所述的淡紫拟青霉微菌核的生产方法在防治根结线虫和胞囊线虫中的应用。
20.本发明的有益效果在于：本发明首次提出了淡紫拟青霉微菌核中试发酵生产的制备技术和生产工艺参数，实现了淡紫拟青霉微菌核大规模生产。
21.本发明人发现，在本发明限定的培养条件下，接种后的淡紫拟青霉孢子开始大量聚集、萌发，然后菌丝交织形成微菌核雏形，最终形成紧实的成熟微菌核，而非通过大量弥散的菌丝聚集形成。通过种子和发酵培养，可大量稳定地生产形态规则、大小均一的淡紫拟青霉微菌核，发酵时间可缩短到3~4天。与分生孢子和菌丝体相比，微菌核细胞具有较厚的细胞壁，更多的糖类物质和脂类物质，具有较强的耐干燥性、耐高盐胁迫能力，并且对农业生产中常用的杀菌剂、杀虫剂有较强的耐受性，研发的淡紫拟青霉微菌核制剂货架期可达到1~2年，能适应40℃以上的高温环境，从而有效地解决真菌制剂货架期短、产品稳定性差的问题。并且，本微菌核制剂含量高、用量少、持效期长、作用稳定、不易漂移，对研发淡紫拟青霉新型生物农药，提高产品稳定性和田间作用效果具有重要的意义。
附图说明
22.图1为发酵液中形成的淡紫拟青霉微菌核。左图为摇瓶培养照片，右图为体式显微镜下观察到的微菌核形态，放大倍数4倍。
23.图2为发酵液中淡紫拟青霉微菌核的形成过程。a：4 h；b：8 h；c：14 h；d：96 h；图2中的标尺尺寸：a：10μm；b：20μm；c：50μm；d：200μm。
24.图3为发酵液中培养4d的淡紫拟青霉微菌核形态结构照片。a、b：微菌核内部结构（半薄切片）；c、d：微菌核表面结构（扫描电镜）。
25.图4为发酵液中培养4d的淡紫拟青霉微菌核细胞结构照片（透射电镜）。a、b：常规培养的分生孢子及菌丝；c、d：微菌核中的孢子及菌丝。
26.图5为淡紫拟青霉微菌核中糖类物质积累。a：微菌核中的孢子；b：常规培养的分生孢子；c：微菌核菌丝；d：常规培养的菌丝。
27.图6为淡紫拟青霉微菌核中脂类物质积累。a：微菌核中的孢子及菌丝；b：常规培养的分生孢子及菌丝。
28.图7为淡紫拟青霉微菌核发酵滤液对病原菌生长和菌核形成的抑制作用对比图。
29.图8为淡紫拟青霉微菌核对根结线虫卵的寄生照片。
30.图9为用硅藻土和稻壳粉吸附的淡紫拟青霉微菌核制剂照片。
31.图10为施用淡紫拟青霉微菌核制剂对黄瓜根部根结形成的影响。a：对照；b：施用微菌核制剂。
32.图11为室温放置1年后淡紫拟青霉微菌核的萌发情况。图中a为新培养的微菌核，b为放置1年的微菌核。
具体实施方式
33.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
34.如无特别说明，说明书中使用的试验原料、测试仪器均可市购。
35.如无特别说明，实施例中的份数均为质量份，百分比例均为质量百分比。
36.本发明所用的淡紫拟青霉菌株由本研究团队分离自根结线虫样品，菌种的分类命名为淡紫紫孢菌（purpureocillium lilacinum），菌种保藏号cgmcc no.9344，保藏时间为2014年7月4日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。
37.实施例1淡紫拟青霉微菌核的形态与结构观察摇瓶培养淡紫拟青霉微菌核，采用的培养基为：蔗糖：40 g/l、酵母浸粉：10 g/l、豆粕粉：6 g/l、吐温-80：0.05 ml/l、kh2po4：5g/l、无水cacl2：1 g/l、mgso4•
7h2o：0.5 g/l、feso4•
7h2o：0.05 g/l、znso4•
7h2o：30 mg/l、mnso4：15 mg/l、na2moo4•
2h2o：10 mg/l、硫胺素：0.5mg/l，调节ph值为5.5。
38.不同时间点取样，观察发酵液中微菌核形态及形成过程，结果见图1、图2。显微镜下观察发现，接种4~8 h，淡紫拟青霉分生孢子聚集并开始萌发，14 h后菌丝交织，逐渐形成微菌核雏形，此后，菌丝不断聚集缠绕、微菌核继续生长，第4天时形成大小一致、结构紧实的微菌核，此时发酵液呈红褐色，微菌核数量不再变化，由此确定摇瓶培养时间最优在4天。
39.用150 μm孔径的筛网收集微菌核，制备半薄切片，观察微菌核内部结构，结果见图3之a-b。发现淡紫拟青霉微菌核可分为内外两层，外部紧密，主要为菌丝，内部菌丝较为疏松，同时含有一定数量的孢子。将微菌核固定，扫描电镜下观察微菌核表面结构，结果见图3之c-d。发现成熟的微菌核呈球形或椭球形，较为紧实，由大量菌丝交织缠绕而成。透射显微镜下还可以看到，微菌核菌丝与孢子的细胞壁比常规营养生长的细胞壁明显增厚，并且细胞中含有黑色素颗粒，参见图4。图4之a、b为常规培养的分生孢子及菌丝。常规培养1 l培养液中含有蔗糖20 g、酵母浸粉15 g、k2hpo4•
3h2o 1 g、mgso4•
7h2o 0.5 g和nacl 0.5 g，发酵温度为28℃。
40.采用高碘酸-希夫试剂对微菌核中的糖类物质染色，结果见图5。发现淡紫拟青霉微菌核中的孢子和菌丝中的糖类物质明显多于常规培养形成的分生孢子和菌丝中的糖类物质。
41.采用苏丹ⅲ对微菌核中的脂类物质染色，结果见图6。发现淡紫拟青霉微菌核菌丝中的脂类物质明显多于常规培养形成的菌丝中的脂类物质。
42.实验结果表明，本实施例培养基是培养淡紫拟青霉微菌核的适宜培养基，培养的微菌核具有更优的特性。本发酵条件也为发酵罐大规模生产提供了工艺条件参考。
43.实施例2：淡紫拟青霉微菌核中试发酵培养（1 t发酵罐）1、淡紫拟青霉接种体制备将-80℃甘油保藏的淡紫拟青霉菌株接到pda平板上活化，待产孢后转接到新鲜的pda平板中，28℃培养箱培养1周。移液器吸取10 ml 0.05%的无菌吐温-80溶液加入平板中，用灭菌涂布棒轻轻刮取孢子，然后将洗脱液转移至50 ml无菌离心管中，振荡器振荡混合均匀，制备淡紫拟青霉接种体。
44.2、淡紫拟青霉种子液制备配制种子培养基，所含成分如下：蔗糖：20 g/l、酵母浸粉：15 g/l、k2hpo4•
3h2o：1 g/l、mgso4•
7h2o：0.5 g/l、nacl：0.5 g/l、znso4•
7h2o：15 mg/l，ph值为6.0。将种子培养基分装到2000 ml三角瓶中，装液量600 ml，121℃高温灭菌30 min，冷却至室温备用。
45.吸取10 ml孢子悬浮液接种于种子培养基中，28℃，180 r/min摇瓶培养90h，制备种子液。
46.3、淡紫拟青霉微菌核发酵培养中试发酵在北京市启高生物科技有限公司完成，采用1 t自动发酵罐（hnd-bi06000型发酵罐智能控制系统）。发酵罐高温蒸汽空消后投料，物料成分如下：蔗糖：40 g/l、酵母浸粉：10 g/l、豆粕粉：6 g/l、吐温-80：0.05 ml/l、kh2po4：5g/l、无水cacl2：1 g/l、mgso4•
7h2o：0.5 g/l、feso4•
7h2o：0.05 g/l、znso4•
7h2o：30 mg/l、mnso4：15 mg/l、na2moo4•
2h2o：10 mg/l、硫胺素：0.5mg/l，调节ph值为5.5，装液系数0.6。
47.封盖后121℃灭菌30 min，待发酵罐温度将至30℃，火焰接种，接种量0.6%。发酵条件为温度28℃，转速180 r/min，通气量0.3~0.8，罐压0.03~0.05 mpa，发酵周期84h，发酵液中微菌核数量为2.8
×
104个/ml。
48.实施例3 淡紫拟青霉微菌核中试发酵培养（1 t发酵罐）1、淡紫拟青霉一级种子培养配制种子培养基，配方如下：蔗糖20 g/l、酵母浸粉15 g/l、k2hpo4•
3h2o 1 g/l、mgso4•
7h2o 0.5 g/l、nacl 0.5 g/l、znso4•
7h2o 15 mg/l，ph值6.0。将种子培养基分装到500 ml三角瓶中，装液量100 ml，121℃高温灭菌30 min，冷却至室温备用。
49.将淡紫拟青霉菌株接种于pda平板上，培养1周至产孢，用接种环刮取菌丝及孢子，接种于种子培养基中，28℃，180 r/min摇瓶培养48 h，制备一级种子液。
50.2、淡紫拟青霉二级种子培养依上述方法配制种子培养基，分装到2000 ml三角瓶中，装液量650 ml。按2%的接种量接入一级种子液，28℃，200 r/min培养72h，制得二级种子液，菌含量为1
×
109孢子/ml。
51.3、淡紫拟青霉微菌核发酵培养1 t发酵罐中进行淡紫拟青霉微菌核发酵培养。培养基成分如下：蔗糖50 g/l、酵母浸粉10 g/l、豆粕粉5 g/l、吐温-800.05 ml/l、kh2po44 g/l、无水cacl21 g/l、mgso4•
7h2o 0.5 g/l、feso4•
7h2o0.1 g/l、znso4•
7h2o30 mg/l、mnso415 mg/l、na2moo4ꢀ•
2h2o10 mg/l、硫胺素0.5mg/l，调节ph值为5.2，装液系数0.7。
52.灭菌后火焰接种，接种量0.5%（体积比）。发酵条件为温度29℃，转速180 r/min，通气量0.3~1，罐压0.03~0.05 mpa，发酵周期76h。测定发酵液中微菌核数量为4.2
×
104个/ml。
53.实施例4淡紫拟青霉微菌核制剂的制备取实施例3所得100 l淡紫拟青霉发酵液，按重量比1：0.9的比例加入硅藻土和稻壳粉，二者重量比为7：3，混合器中充分搅拌，混合均匀，然后平铺在托盘中，采用鼓风干燥箱鼓风干燥，干燥温度为30~35℃，干燥至含水量小于13％。过18目筛，制备淡紫拟青霉微菌核细粒剂。产物照片见图9。
54.实施例5淡紫拟青霉微菌核发酵液的抑菌效果对实施例1制备的淡紫拟青霉微菌核发酵液进行抑菌活性测定。4000r/min离心10 min，过0.22μm微孔滤膜去除菌体，将得到的发酵滤液与pda培养基按体积比1：4充分混匀，制备含微菌核发酵滤液的pda平板。将直径为0.5 cm的立枯丝核菌和核盘菌菌饼接种于上
述平板中央，28℃培养，1周后测定病原菌生长情况。结果如图7所示，微菌核发酵滤液对立枯丝核菌和核盘菌的抑制率分别为53.5%和70.5%，并可有效抑制菌核的形成。
55.实施例6淡紫拟青霉微菌核对根结线虫卵的寄生作用收集实施例1制备的淡紫拟青霉微菌核，无菌水冲洗去除培养液，24孔组织培养板中分别加入300个微菌核和200粒根结线虫卵，再加入1 ml水，混合均匀，25℃培养7天，倒置显微镜下观察微菌核对根结线虫卵的寄生情况，结果见图8。淡紫拟青霉微菌核萌发产生菌丝，寄生线虫并在线虫体内生长繁殖，最终淡紫拟青霉的菌丝穿透线虫卵体壁，线虫消解。
56.实施例7淡紫拟青霉微菌核制剂防治黄瓜根结线虫的效果对实施例4制备的淡紫拟青霉微菌核制剂进行防治黄瓜根结线虫病试验。挑取根结线虫卵囊制备卵悬液，将灭菌土与卵悬液混合，使线虫浓度为300卵/100 g土。将病土装入直径7 cm的塑料花盆中，每盆150 g。
57.将中农6号黄瓜种子用2%naclo表面消毒5 min，冲洗，催芽后播种于育苗盘中。待长至2~3片真叶时，将黄瓜幼苗移栽至线虫病土中，每盆1株，同时穴施接种淡紫拟青霉微菌核制剂，浓度为300个/100g土。移栽30天后调查根部发病情况，结果见图10，施用淡紫拟青霉微菌核制剂后黄瓜根上根结数量明显减少，对根结线虫的防效达到62.5%。
58.实施例8淡紫拟青霉微菌核制剂耐热性对实施例4制备的淡紫拟青霉微菌核制剂进行耐热性测定。称取1 g微菌核制剂和分生孢子制剂，装入50ml离心管中，盖紧盖子，分别置于40℃和60℃干燥箱中加热。处理后加入无菌水稀释，吸取0.5 ml于加抗pda平板上，使微菌核均匀分布于平板中，28℃培养，24 h后显微镜下测定微菌核萌发率。结果显示，40℃下处理24h，微菌核制剂的萌发率保持在100%，60℃下加热8 h，微菌核的萌发率仍然可以达到60%以上，而孢子制剂的活性降为0。
59.实施例9淡紫拟青霉微菌核制剂储存性能测定将制备的淡紫拟青霉微菌核制剂置于通风干燥处，室温下保存6个月、12个月后测定其萌发率。称取1 g微菌核制剂，加水稀释，置于加抗pda平板上，每个平板微菌核数量大于100个。28℃培养24 h，测定萌发率。结果表明，12个月微菌核的萌发率为100%（参见图11）。
60.虽然，以上通过实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应了解，在不偏离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的改进和变型，均应属于本发明的保护范围内。