一种快速鉴别鹿茸种属来源的特征多肽库及其应用的制作方法

1.本发明属于鹿茸种属鉴别领域，具体涉及一种快速鉴别鹿茸种属来源的特征多肽库及其应用。


背景技术：

2.鹿科动物浑身是宝。自古以来鹿制品就一直是皇室和达官贵族的长寿补品，现在也已经成为普通百姓防病强身、滋补美容、延年益寿的保健佳品。随着现代养鹿业的飞速发展，人类开发出的鹿制品越来越多，极大的丰富了鹿制品在医疗保健中的神奇功效，使广大民众受益无穷。鹿制品给人类提供了极其丰富的产品，其中最贵重的产品之一就是鹿茸，具有着极高的药用价值和保健功效。由于鹿科动物种类繁多，市场上的鹿茸来源无法通过显微鉴别及薄层色谱、液相色谱等传统鉴别手段区别。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种快速鉴别鹿茸种属来源的特征多肽库。
4.本发明还提供了一种上述特征多肽库在鉴别鹿茸种属来源中的应用。
5.本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：本发明提供了一种快速鉴别鹿茸种属来源的特征多肽库，所述特征多肽库如seq id no.1-11所示，具体序列为：
上述特征多肽，其中：肽段7：序列ffehfgdlssadavmgnpk，m为m的氧化翻译后修饰；肽段9：序列ffehfgdlstpdavmgnpk，m为m的氧化翻译后修饰；肽段10：序列vvagvanalahr，n为n的脱酰胺翻译后修饰；肽段11：序列ffehfgdlstadavmgnpk，m为m的氧化翻译后修饰。
6.本发明还提供了一种利用上述特征多肽库在快速鉴别鹿茸种属来源中的应用，判定原则为：（1）样品中检出与驼鹿对照药材相应的肽段1或肽段2或肽段3，则认为样品为驼鹿来源；（2）样品中检出与驯鹿对照药材相应的肽段4或肽段5或肽段6，则认为样品为驯鹿来源；
（3）样品中检出与白尾鹿对照药材相应的肽段7，则认为样品为白尾鹿来源；（4）样品中检出与白唇鹿对照药材相应的肽段8，则认为样品为白唇鹿来源；（5）样品中检出与黇鹿对照药材相应的肽段9，且未检出肽段8与肽段11，则认为样品为黇鹿来源；（6）样品中检出与梅花鹿对照药材相应的肽段10，且检出肽段11，则认为样品为梅花鹿来源；（7）样品中检出与马鹿对照药材相应的肽段11，且未检出肽段10，则认为样品为马鹿来源。
7.进一步的，具体包括以下步骤：（1）样品制备方法：样品粉碎，过筛，称取粉末50mg，加入10ml变性缓冲液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，12000r离心10分钟，取500μl样品提取液，使用分子量3kda的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解，即得；（2）采用高效液相-三重四极杆质谱联用进行鉴定。
8.本发明所使用的变性缓冲液为6m盐酸胍，1m tris，2.5mm乙二胺四乙酸，加浓盐酸调ph至8.0。
9.进一步的，所述脱盐和酶解的具体过程为：将样品提取液加入超滤离心管上层，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μl水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μl水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μl1% nh4hco3溶液和10μl 10mg/ml的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15分钟，取出放冷至室温，离心，取上清液即可。
10.进一步的，所述液相条件为：色谱柱为agilent sb c18 (2.1
×
100mm，1.8μm)，柱温43℃，流速0.3ml/min，流动相a为0.1%甲酸溶液，b为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，进样量为5 μl。
11.上述梯度洗脱的条件为：0~9min,3%b
→
7.5%b; 9~13min, 7.5%b
→
25%b; 13~14min,25%b
→
90%b; 14~17min, 90%b; 17~17.5min, 90%b
→
97%b, 17.5~21min,97%b。
12.进一步的，所述质谱条件为：采用质谱检测器，电喷雾离子化（esi），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46l/hr；辅助气流速850 l/hr；喷雾电压3.5kv；离子源温度150℃；辅助气温度400℃。锥孔电压30v，碰撞电压35v，溶剂延迟（solvent delay）为0～4min和16～20min。
13.本发明提供了一种鹿茸特征多肽库，可以同时鉴别7种鹿科动物的鹿茸。本发明的特征肽段来源为β珠蛋白，广泛存在鹿科动物血液中，故只要含有微量血液的样品都可适用。
14.本发明的有益效果为：（1）本发明使用高效液相-三重四级杆质谱联用的方法，可以同时对7种鹿科动物实现鉴别鉴定，高效且专属性好。
15.（2）本发明通过大量的实验研究，得到了能够进行区别鉴定的特征多肽，专属性强，检测方法简单快捷，提高了鹿科动物相关产品的质量控制水平，提高了临床用药的安全性和有效性，且检出限低，检测样品用量少。
附图说明
16.图1为实施例1中利用特征多肽库检测的判定原则流程图。
17.图2为肽段1、2、3正确序列以及b、y离子归属。
18.图3为肽段4、5、6正确序列以及b、y离子归属。
19.图4为肽段7正确序列以及b、y离子归属。
20.图5为肽段8、9正确序列以及b、y离子归属。
21.图6为肽段10、11正确序列以及b、y离子归属。
22.图7为实施例1中各特征多肽段的出峰时间；其中，(a)驼鹿肽段1、2、3mrm出峰时间(b)驯鹿肽段4、5、6mrm出峰时间(c)白尾鹿肽段7mrm出峰时间(d)白唇鹿肽段8、9mrm出峰时间(e)梅花鹿肽段10、11mrm出峰时间。
具体实施方式
23.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
24.实施例1 特征多肽的筛选样品上清液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，将质谱数据导入peaks 8.5软件，使用
ꢀ“ꢀ
adult-beta globin of deer”蛋白的数据库，进行全部肽段的从头测序及肽段匹配。共从头测序到33185条肽段，数据库匹配，共鉴定到333条肽段。使用高效液相-三重四级杆质谱联用仪验证鉴定到的333条肽段对与马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白唇鹿、白尾鹿及黇鹿的专属性，考察并选择响应强度最高的母离子与子离子作为定性离子与定量离子。
25.实施例2（1）样品制备方法：马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品粉碎，过筛，称取粉末50mg，加入10ml变性缓冲液（6m盐酸胍，1m tris，2.5mm乙二胺四乙酸，加浓盐酸调ph至8.0），摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，12000r离心10分钟，取500μl，使用分子量3k的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解（12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μl水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μl水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μl 1% nh4hco3溶液和10μl牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15分钟，取出放冷至室温，离心，取上清液），即得；（1）对照样品的制备方法同样品制备方法；（3）液相条件：色谱柱为agilent sb c18 (2.1
×
100mm，1.8μm)，柱温43℃，流速0.3ml/min，流动相a为0.1%甲酸溶液，b为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。（0~9min,3%b
→
7.5%b; 9~13min, 7.5%b
→
25%b; 13~14min,25%b
→
90%b; 14~17min, 90%b; 17~17.5min, 90%b
ꢀ→
97%b,17.5~21min,97%b）进样量为5 μl。质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（esi），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46l/hr；辅助气流速850 l/hr；喷雾电压3.5kv；离子源温度150℃；辅助气温度400℃。锥孔电压30v，碰撞电压35v)。溶剂延迟（solvent delay）为0～4min和16～20min。
26.所使用的特征多肽库见表1。
27.表1
上述肽段的序列及离子归属如图2-6所示利用上述特征多肽库进行检测时，判定原则为：1.样品中检出与驼鹿对照药材相应的肽段1或肽段2或肽段3，则认为样品为驼鹿来源。
28.2.样品中检出与驯鹿对照药材相应的肽段4或肽段5或肽段6，则认为样品为驯鹿来源。
29.3.样品中检出与白尾鹿对照药材相应的肽段7，则认为样品为白尾鹿来源。
30.4.样品中检出与白唇鹿对照药材相应的肽段8，则认为样品为白唇鹿来源。
31.5.样品中检出与黇鹿对照药材相应的肽段9，且未检出肽段8与肽段11，则认为样品为黇鹿来源。
32.6.样品中检出与梅花鹿对照药材相应的肽段10，且检出肽段11，则认为样品为梅花鹿来源。
33.7.样品中检出与马鹿对照药材相应的肽段11，且未检出肽段10，则认为样品为马鹿来源。
34.具体判定流程图如图1所示。各特征多肽段的出峰时间如图7所示。
35.效果验证专属性验证：分别对马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品进行实验，各个鹿科动物茸中的专属肽段均可检出，且其他鹿科动物中未检出，故认为该方法专属性好。
36.耐用性实验：分别使用 agilent zorbax sb rrhd, agilent zorbax eclipse rrhd, waters acquity uplc hss色谱柱对马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品进行实验，各个鹿科动物茸中的专属肽段均可检出，故认为该方法耐用性好。
37.重复性实验：将马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品平行制备3份进行实验，各个鹿科动物茸中的专属肽段均可检出，故认为该方法重复性好。