一种防御素样免疫调节十四肽RV14及其制备方法和应用与流程

一种防御素样免疫调节十四肽rv14及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种防御素样免疫调节十四肽rv14及其制备方法和应用。


背景技术：

2.尽管抗生素一直是人类治疗由病原菌感染引起的各种疾病的有效药物。但是随着抗生素的大量滥用，使动物机体产生耐药性，抗生素时代正逐渐走向终点。因此，寻找新的替代抗生素的方法成为人们关注的焦点。抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)存在于自然界多种生物体内。具有广谱的抑菌活性，因其特殊的抑菌机制，使其不易产生耐药性，具有替代抗生素使用的巨大潜力。可是仍然有一些不足限制了应用。比如较贵的合成成本，天然提取的困难，较高的溶血活性和较低的抑菌活性等方面。
3.对天然抗菌肽分子进行改造仍是应用抗菌肽的有效途径之一，抗菌肽的改造大多数是以天然抗菌肽为模板，达到设计要求后，将肽通过固相化学合成法进行合成。β防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，广泛分布于真菌、植物与动物中，是生物免疫系统中的重要调节分子。其具有良好的免疫调节活性，但在体外或盐离子溶液中却没有抑菌活性。因此，对β防御素进行改造，使其仍然保留其天然的免疫调节活性，同时又能在体外具有良好的抑菌活性。


技术实现要素：

4.基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种防御素样免疫调节十四肽rv14，使其同时具有抑菌活性和免疫活性。
5.本发明通过如下技术实现：一种防御素样免疫调节十四肽rv14，其序列如seq id no.1所示。
6.本发明的另一目的是还提供一种防御素样免疫调节十四肽rv14的制备方法，如下：通过对β防御素家族氨基酸序列进行比对分析，筛选出了β防御素家族所共有的氨基酸序列，通过改造，设计出含有一对二硫键的β防御素片段crrgvc，分别在其n端采用wrwr氨基酸序列、在其c端采用rwrw氨基酸序列进行序列添加，并将该肽的羧基末端酰胺化，得到的序列如seq id no.1所示，命名为十四肽rv14，将设计得到的多肽通过多肽合成仪，采用固相化学合成法进行合成和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽的制备。
7.本发明的另一目的是提供如上所述的一种防御素样免疫调节十四肽rv14在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
8.本发明的优点及有效果：本发明得到的抗菌肽rv14较好的保留了β防御素的免疫调节活性，并且在体外对革兰氏阳性菌和阴性菌具有良好的抑菌活性。在不同的盐离子环境下也非常稳定，除在钠离子环境下轻微影响外，其他盐离子中抑菌效果均不受影响，证明有很好的盐离子稳定性，且完全不引起溶血。同时，拥有较短的序列长度，降低了化学合成成本。具有成为抗菌调节药物的潜力。说明通过基于天然抗菌肽特征的改造，以及功能性片
段的加入，可以很好的设计出具有特定功能的抗菌肽，进一步验证了抗菌肽设计原则，为抗菌肽的设计和应用提供了理论的基础。
附图说明
9.图1是rv14的螺旋轮预测图。
10.图2是rv14的溶血活性图。
11.图3是rv14的免疫调节图，
12.(a)il-6基因的表达量，(b)il-1β基因的表达量，(c)tnf-α基因的表达量。
具体实施方式
13.实施例1抗菌肽的设计合成
14.步骤1：通过防御素序列比对，得到了具有防御素特征的中心骨架cxxgyc,其中x为阳离子氨基酸，y为疏水性氨基酸，尽可能保留β防御素的免疫调节特征，且该骨架序列较短，更有利于实际合成和应用。通过治疗指数的筛选，从14条肽中选择治疗指数最高的rv14作为目标肽。其骨架为crrgvc。
15.步骤2：在骨架的n端和c端添加wrwr和rwrw氨基酸序列。此片段具有良好的抑菌活性，使其具有良好抑菌活性，同时在c末端进行酰胺化来增加其阳离子性和稳定性。最终序列为wrwrcrrgvcrwrw-nh2。
16.步骤3：抗菌肽均由上海吉尔生化有限公司(gl biochem(shanghai)ltd)采用固相合成方式合成；并通过反相高效液相色谱(rp-hplc)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)对合成的多肽进行纯化和鉴定，多肽纯度＞95％。经鉴定无误的抗菌肽分装后置于-30℃或者更低温度中长期保存，每次取小包装用无菌超纯水溶解，并过滤除菌，将溶解后的多肽母液分装到0.2ml的ep管中，多肽母液浓度为2560μm。
17.抗菌肽rv14的螺旋轮预测图如图1所示。使用多肽合成仪，利用固相合成法合成上述抗菌肽。肽的序列及理化参数如表1所示。
18.表1 rv14的序列及理化参数
19.肽序列理论分子量实际分子量电荷数疏水率rv14wrwrcrrgvcrwrw-nh22059.452059.45 750％
20.实施例2抗菌肽的二级结构分析
21.通过cd光谱对抗菌肽的二级结构进行分析。结果表明，在水环境中，肽rv14呈现β折叠结构，仍然保留了β防御素的折叠结构。证明所设计的肽具有很强的结构性，与其他肽在水中呈现无规则卷曲结构所不同，rv14即使在水中也能呈现出结构。意味着在水中也能发挥其功能。而在模拟微生物膜的疏水环境(50％tfe)和带负电荷的原核细胞膜环境(30mm sds)中，肽的β折叠结构较弱。大多数抗菌肽在水环境中呈现无规则卷曲，而在细胞膜环境下呈现出结构。
22.实施例3抗菌肽的盐离子稳定性
23.在bsa溶液溶液加入盐离子，配置不同盐离子bsa溶液。并按照抑菌活性的方法再测定抗菌能力。测定的盐离子终浓度分别为：150mm nacl，4.5mm kcl，6mm nh4cl，8mm zncl2，1mm mgcl2，2.5mm cacl2和4mm fecl3。结果如表2所示，抗菌肽在七种盐离子中都具
有良好的稳定性。除在钠离子环境下，抑菌效果略微减弱外，在其他六种盐离子环境下均保持抑菌活性不变。
24.表2 rv14在盐离子环境下对细菌的抑菌活性
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实施例4抗菌肽的抑菌活性、溶血活性和免疫调节活性
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1抑菌活性
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将肽配置成为2.56mm/l储存液备用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％bsa)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表3所示，rv14对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有较好的抑菌活性。
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表3 rv14对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌活性
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注：最低抑制浓度是抗菌肽可以抑制细菌生长的最低浓度。测试至少进行三次重复。
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2溶血活性
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抗菌肽的溶血活性是采健康人血1ml，在肝素钠抗凝管中储存；离心血液5min，弃上清，获取红细胞。使用无菌pbs洗涤红细胞三次，并再重悬；使96孔板的每行第1孔填入80μl pbs，其余加入50μl pbs。将20μl抗菌肽原液(2560μm)加入到96孔板第一行中，充分混匀后，进行多肽倍比稀释。以此类推，最后一行混匀后弃去50μl稀释液，保持每孔均有50μl的溶液体系。使96孔板每孔中填入50μl红细胞悬液。加入50μl pbs的无抗菌肽处理作为阴性对照，以加入50μl，0.2％triton x-100作为为阳性对照；放入培养箱中37℃孵育1h后，离心96孔板5min；重新吸取上清液，用酶标仪测定od570nm条件下的吸光度值。与对照组的蜂毒素随着浓度增加，溶血增加相比，rv14在2到128μm浓度下均完全不引起溶血。
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3免疫调节活性
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将巨噬细胞raw264.7在96孔板上进行铺板，每孔密度达到1-2
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105cell/ml。在抗菌肽存在条件下，37℃下与巨噬细胞进行孵育24小时。抗菌肽的浓度为10μm，没有肽组作为阳性空白对照。通过检测炎症因子il-6，il-1β，tnf-α基因的表达量，来判断肽对细胞因子的调节活性。免疫系统细胞的增殖、分化和功能受到一系列细胞因子的调节。根据细胞因子
的结构同源性可将其分为白细胞介素家族、肿瘤坏死因子家族等。与对照组相比，经过肽rv14作用后的小鼠巨噬细胞raw中的细胞因子il-6，il-1β，tnf-α基因表达量均有所下调。
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综上，rv14在抗菌活性方面有较大的提高，同时不引起溶血，并且具有免疫调节活性。说明通过功能性片段的添加可增强抗菌肽的抗菌活性，提高细胞免疫调节性，进一步验证了其抗菌机理，为抗菌肽的应用提供了理论的基础。