PARP-1shRNA重组慢病毒载体、该载体稳定转染HaCaT的细胞系及其应用

技术特征：
1.一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体是在plvx-shrna2-puro载体质粒的多克隆位点中插入了parp-1shrna片段，其中所述parp-1shrna片段中含有seq id no：1所示的序列。2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，所述parp-1shrna片段由seq id no：2所示的上游序列片段和seq id no：3所示的下游序列片段退火后形成。3.权利要求1或2所述重组慢病毒载体的制备方法，其包括以下步骤：(1)以seq id no：1所示的序列为基础，合成parp-1shrna片段的上游序列片段和下游序列片段；优选的，所述上游序列片段的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述下游序列片段的核苷酸序列如seq id no：3所示；(2)对plvx-shrna2-puro载体质粒用ecor i bamh i进行双酶切；(3)将步骤(1)中所述的上游序列片段和下游序列片段与步骤(2)中经过双酶切后的载体质粒进行连接；优选的，连接条件为22℃水浴过夜。4.一种慢病毒颗粒，其特征在于，所述慢病毒颗粒是通过将权利要求1或2所述的重组慢病毒载体与包装质粒共转染至hek293t细胞中，并将所述细胞在完全培养基中进行培养后收集得到的；优选的，所述包装质粒为pspax2和pmd2.g的混合物，所述完全培养基为dmem 10％fbs。5.一种稳定表达parp-1shrna的hacat细胞系，其特征在于，所述细胞系是通过将权利要求4所述的慢病毒颗粒转染至hacat细胞中制备得到的；优选的，所述稳定表达parp-1shrna的hacat细胞系为单克隆细胞系。6.一种制备稳定表达parp-1shrna的hacat细胞系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将权利要求4所述的慢病毒颗粒添加至hacat细胞中，其中所述慢病毒颗粒与所述hacat细胞之间的数量比为100：1～1：1；(2)20～28小时后，在培养基中加入1～6μg/ml的嘌呤霉素进行筛选；(3)筛选4～7天后，将所述细胞转移至新的培养板中，待细胞长满后转移至培养瓶中进行扩大培养，从而得到稳定表达parp-1shrna的hacat细胞系。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述慢病毒颗粒与所述hacat细胞之间的数量比为100：1，步骤(2)中所述嘌呤霉素的浓度为3μg/ml。8.根据权利要求6或7所述的方法，其进一步包括以下步骤：(4)通过极限稀释法，将步骤(3)中所述细胞系重新接种到96孔板中，每孔接种量为100μl、细胞悬液浓度为1个细胞/100μl；待细胞贴壁生长后，置于显微镜下观察，标记至含1个细胞的培养孔，培养12～18天后，得到稳定表达parp-1shrna的单克隆hacat细胞系；优选的，细胞培养的时间为15天。9.利用权利要求5所述的稳定表达parp-1shrna的hacat细胞系在筛选预防或治疗皮肤癌的药物中的应用。10.利用权利要求5所述的稳定表达parp-1shrna的hacat细胞系在筛选预防或治疗正常皮肤细胞dna损伤的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及PARP-1shRNA重组慢病毒载体、该载体稳定转染HaCaT的细胞系及其应用。本发明提供了一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体是在pLVX-ShRNA2-puro载体质粒的多克隆位点中插入了PARP-1shRNA片段，其中所述PARP-1shRNA片段中含有SEQ ID NO：1所示的序列。将包装后的慢病毒转染至HaCaT细胞，获得4株稳定表达PARP-1shRNA的单克隆细胞系。Western Blot结果显示本发明构建的单克隆细胞系敲降效率高。本发明构建的稳定敲降PARP-1的HaCaT单克隆细胞系，可用于预防或治疗皮肤癌药物的筛选及正常皮肤细胞DNA损伤机制的研究。制的研究。制的研究。


技术研发人员：周文霞 刘峰 张永祥 蒋宁 肖智勇 程军平
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2021.02.01
技术公布日：2022/8/1