一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用的制作方法

1.本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用。


背景技术：

2.氧化还原酶可以分为氢酶、氧化酶、还原酶、过氧化物酶、加氧酶、过氧化氢酶和羟化酶等。这些酶在发挥催化活性时都需要其辅因子如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadp)、黄素单核苷酸(fmn)、黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)、吡咯并喹啉醌(pqq)或者辅酶q(coq)的参与。nad(p)h作为一种常见的辅助因子，广泛应用于大多数的酶催化氧化还原反应和生物燃料电池中。内源性nad(p)h是通过生物体内的初级代谢产生的。外源性nad(p)h的供应因为成本高、稳定性低的特点而面临挑战；
3.近年来，一些化学、光化学、酶催化和电化学nad(p)h再生系统在解决外源nad(p)h再生体系中起到了一些作用。其中，酶催化法因其反应速度快、选择性好、再生体系与合成体系具有较好的相容性而受到越来越多的关注。大多数nad(p)h再生体系都是以一些价格便宜的原料为底物如单糖、乙醇等，其中单糖中因葡萄糖价格低，通常使用最多。
4.nad(p)依赖的葡萄糖脱氢酶以nad 或nadp 为辅因子，产生d-葡萄糖酸-δ-内酯和nad(p)h，已广泛用于nad(p)h再生的许多氧化还原反应中，在工业生物催化制药前体的合成方面具有巨大的应用潜力。一般而言，当辅酶特异性逆转时，酶的催化活性就会降低。一些研究结果表明，当辅酶从nad切换到nadp时，得到了更好的效果。此外，通过对比nad 和nadh、nadp 和nadph之间的价格可知，nadh是nad 价格的3倍，而nadph是nadp 价格的7倍左右，这表明在工业生物催化制药过程中寻找具有生产高活性的以nadp 作为辅因子的催化酶对于加速nadph特异性的生物催化过程至关重要。因此，本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种葡萄糖脱氢酶突变体及其蛋白质晶体和应用。
6.本发明的具体技术方案包括：
7.本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体，所述葡萄糖脱氢酶突变体是通过将葡萄糖脱氢酶(以下简称野生型gox2015)的蛋白序列的第259位的天冬氨酸突变成半胱氨酸后得到的，该葡萄糖脱氢酶突变体(以下简称gox2015突变体)的蛋白序列如seq id no.1所示。
8.作为本发明的进一步优化方案，所述gox2015突变体的表达载体为pet-28a，表达gox2015突变体的菌株为大肠杆菌bl21。
9.作为本发明的进一步优化方案，所述gox2015突变体的编码基因如seq id no.2所示。
10.本发明还提供了一种如上述gox2015突变体在氧化还原反应中辅酶nadh及nadph再生中的应用。
11.本发明还提供了一种基于上述gox2015突变体的蛋白质晶体，所述蛋白质晶体是将纯化得到的gox2015突变体采用坐滴法进行结晶后得到的。
12.作为本发明的进一步优化方案，所述蛋白质晶体的出晶条件为0.1m氯化镁、0.1m柠檬酸三钠,ph 5.0及15％peg4000。
13.本发明还提供了一种如上述蛋白质晶体在改造高活性高稳定性的葡萄糖脱氢酶中的应用。
14.综上所述，本发明的有益效果为：
15.本发明提供了一种以葡萄糖为底物的来源于氧和葡萄球菌的葡萄糖脱氢酶突变体，该突变体通过将葡萄糖脱氢酶蛋白序列的第259位的天冬氨酸突变成半胱氨酸，使其与野生型的葡萄糖脱氢酶相比具有更高的热稳定性，野生型tm值为64℃、突变体tm值为73℃，较野生型增加了近10℃，具有与嗜热菌相似的tm值，为该酶在工业生物催化制药过程中的应用提供了良好的应用场景。此外，该突变体的产量也比野生型高出2倍；
16.此外，本发明提供的葡萄糖脱氢酶还具有氧化还原反应中辅酶nadh以及nadph的再生中的应用，其还原nadp 活性比其他已报道的葡萄糖脱氢酶要高3.5倍，更适合nadph再生中的应用，为工业生物催化制药过程nadph的再生提供了更好的催化酶；
17.最后，本发明还提供了该酶的蛋白质晶体，为进一步改造高活性、高稳定性的酶提供了研究基础。
附图说明
18.图1为野生型gox2015及gox2015突变体蛋白小量表达sds-page检测结果；
19.图2为野生型gox2015及gox2015突变体蛋白亲和纯化结果；
20.图3为野生型gox2015的蛋白质量检测结果；
21.图4为gox2015突变体的蛋白质量检测结果；
22.图5为gox2015及gox2015突变体热稳定性检测结果；
23.图6为gox2015突变体和gdh再生nadph活性检测结果；
24.图7为gox2015突变体蛋白质晶体照片。
具体实施方式
25.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术做出一些非本质的改进和调整。
26.一、材料
27.本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
28.二、方法
29.1、重组质粒的构建及表达
30.(1)野生型gox2015及gox2015突变体的基因序列均是通过基因合成获得，分别在n
端带有6his和strepⅱ融合标签，表达载体为pet-28a，重组质粒均经测序验证与目标序列完全一致，gox2015突变体是在野生型gox2015的原始序列基础上将259位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，gox2015突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示，其编码基因如seq id no.2所示。将野生型gox2015和gox2015突变体两种类型的重组质粒分别按照常规分子生物学手段分别转化bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌斑至5ml lb液体培养基中，37℃培养，待菌液od600至0.6-0.8时取少量菌液用loading buffer进行固定，并取少量菌液加入甘油冻至-80℃，剩余菌液加入0.5mm iptg诱导4个小时后，收集菌体并取诱导后菌液进行sds-page检测。根据sds-page结果可知，野生型gox2015和gox2015突变体在bl21(de3)大肠杆菌中均明显表达(图1)。
31.(2)诱导表达融合蛋白：将明显表达的两种类型的菌株分别接种至50ml lb液体培养基中37℃培养过夜，将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1l lb液体培养基中，37℃培养至菌液od600为0.6-0.8时加入0.5mm iptg 15℃培养过夜，5000rpm离心收集菌体。
32.(3)蛋白纯化：将收集的两种类型的菌块进行称重，再分别按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mm tris-hcl(ph8.0)，500mm nacl，5％甘油)，使用高压均质机破碎菌体，16000rpm高速离心收集上清。再使用亲和层析柱his ff富集纯化蛋白，纯化前先用裂解buffer平衡his ff柱，将所有细胞上清挂柱后，用不同梯度的咪唑溶液洗脱，收集不同梯度咪唑洗脱下的蛋白进行sds-page检测，收集纯度较好的蛋白用nanodrop测定蛋白浓度，计算蛋白产量。根据sds-page结果可知，通过亲和纯化获得了纯度较高的野生型gox2015蛋白和gox2015突变体蛋白。再根据nanodrop测定的蛋白浓度计算得到的野生型gox2015的产量为67.2mg/l，gox2015突变体的蛋白产量高达116.4mg/l。证明通过将野生型gox2015蛋白序列第259位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，gox2015突变体的蛋白产量相比于野生型gox2015提高了近2倍。结果见图2。
33.(4)蛋白质量检测：为了获得均一性好的蛋白，将亲和层析后的两种蛋白分别进行凝胶过滤层析，凝胶层析柱的型号为：superdex 200increase 10/300gl，凝胶层析的buffer为：25mm hepes(ph7.5)，100mm nacl。收集凝胶过滤层析后的两种样品，分别进行蛋白质量检测，即分别进行sds-page纯度检测、质谱分析和分析型分子筛的检测；
34.根据sds-page结果可知，野生型gox2015和gox2015突变体蛋白纯度均大于99％。质谱检测结果显示野生型gox2015和gox2015突变体蛋白检测的分子量分别为28717da和28706da，与两者的理论分子量28715da和28703da非常接近，说明纯化后蛋白为目标蛋白。此外，分析型分子筛的结果显示，两个蛋白在溶液中的状态均接近四聚体。检测结果如图3-4所示。
35.2、野生型gox2015和gox2015突变体重组蛋白的热稳定性检测
36.野生型gox2015和gox2015突变体重组蛋白热稳定性的检测技术选用微量差示扫描荧光技术(nano differential scanning fluorimetry，nanodsf)。该技术通过检测色氨酸自发荧光的微小变化来进行蛋白质稳定性的研究，通过检测蛋白内源荧光的变化来跟踪其折叠状态，荧光信号的比值会随温度的增加而变化，从而测定蛋白稳定性参数tm值，实现在非标记环境下检测蛋白的热稳定性或化学稳定性，具体的实验方法如下：
37.(1)分别取20μl浓度为0.5mg/ml的野生型gox2015和gox2015突变体蛋白加到384孔实验板中，震荡离心后(避免样品不均匀或吸样过程中吸进气泡)，将实验板置于取样架
上，使用nano dsf毛细管吸样，保证样品充满整个毛细管。将毛细管放入nanodsf仪器中，设置初始温度为20℃，以每分钟升温2.0℃的速度最终上升到90℃终止。仪器会依照设置好的参数进行升温和实时检测，tm值测试的结果见图5。
38.(2)结果分析：野生型gox2015的tm值为64℃，gox2015突变体的tm值为73℃。当野生型gox2015蛋白序列的第259位的天冬氨酸(d)突变成半胱氨酸(c)后，tm值增加了9.35℃，具有与嗜热菌相似的tm值。蛋白的热稳定性大大提高，已知在工业生物催化制药过程中，存在一些酶因为在高温下不稳定而限制了其应用，通过定向进化筛选出具有热稳定性的突变株已经成为一种常规的生物学手段，而本发明通过对野生型gox2015蛋白序列的第259位氨基酸进行突变，大大提高了蛋白的热稳定性，也为gox2015在工业生物催化制药中的应用提供了更好的应用场景。
39.3、gox2015突变体重组蛋白活性检测
40.gox2015作为一种葡萄糖脱氢酶，可以以葡萄糖为底物，将nad(p) 转化为nad(p)h。本发明提供的测活体系以葡萄糖和nad(p) 作为底物，因nad(p) 为无色，而nad(p)h在340nm处有荧光吸收，当反应体系中将nad(p) 转换成而nad(p)h后，就可以在340nm处检测荧光信号。本发明以每纳摩尔gox2015每秒产生的荧光信号强度表示酶活参数。为了更好地比较gox2015突变体与其他葡萄糖脱氢酶的酶活，我们将其与已报道的来源于巨大芽胞杆菌的gdh进行对比，蛋白序列见seq id no.3。具体的实验操作如下：
41.(1)准备缓冲液：50mm tris ph8.0、底物为5mm glucose和2mm nadp 、反应温度为20℃。用缓冲液分别将gox2015突变体及gdh从1μm以2倍梯度稀释，共稀释12个浓度。将30μl底物转移至384孔板中并设置两个复孔，转移30μl待测gox2015突变体或gdh至相应的孔板中，立即离心并振荡混匀，使用tecan f200酶标仪收集反应产生的荧光信号值。运用graphpad prism9分析软件进行数据分析，最终获得待测蛋白酶的酶活参数，结果如图6所示。
42.(2)结果分析：根据酶活数据可知gdh的酶活参数为7.7
×
10-5
，gox2015突变体蛋白的酶活参数为2.7
×
10-4
，比gdh高出3.5倍。本发明提供的gox2015突变体具有很高的将nadp 转化成nadph的活性，在氧化还原反应中辅酶nadph的再生中的应用具有更高的价值。
43.4、gox2015突变体重组蛋白结晶
44.将纯化得到的gox2015突变体蛋白用坐滴法进行结晶。选取hampton research公司生产的peg kit，index kit及qiagen公司生产的morpheusⅱ、morpheusⅲkit，proplex进行结晶筛选，取15μl结晶试剂于96孔结晶板中作为缓冲液，使用mosquito lcp蛋白结晶筛选仪点样，取200nl蛋白 200nl结晶溶液。将microamp optical adhesive膜密封后的96孔板放置在20℃的恒温培养箱进行培养，定期观察晶体生长情况；
45.通过对gox2015突变体蛋白的结晶筛选，在11.72mg/ml的蛋白浓度下，约5-7天获得了gox2015突变体晶体，结晶条件为0.1m mgcl2，0.1m柠檬酸三钠,ph 5.0，15％peg4000，晶体照片如图7所示，蛋白质的三维结构决定了蛋白质的功能，了解蛋白质的信息对于蛋白功能的提升具有很好的指导意义。本发明提供的gox2015突变体晶体为使用x射线解析gox2015突变体的结构提供了基础，提供了基于结构定向改造gox2015突变体，为设计具有更高活性、更高稳定性的葡萄糖脱氢酶提供分子基础。
46.三、结论
47.本发明提供了一种以葡萄糖为底物的来源于氧和葡萄球菌的gox2015突变体，该突变体与野生型gox2015相比具有更高的热稳定性，野生型gox2015的tm值为64℃、突变体的tm值为73℃，较野生型增加了近10℃。此外，突变体的产量也较野生型高出2倍。本发明提供的突变体还具有氧化还原反应中辅酶nadh以及nadph的再生中的应用，其还原nadp 活性比其他已报道的葡萄糖脱氢酶要高3.5倍，更适合nadph再生中的应用，为工业生物催化制药过程nadph的再生提供了更好的催化酶。本发明还提供了该酶的蛋白质晶体，为进一步改造高活性、高稳定性的酶提供了研究基础。
48.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。