一株产植物生长素IAA的菌株及其应用的制作方法

一株产植物生长素iaa的菌株及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株菌株及其应用。


背景技术：

2.细菌既是分解者，又可作为水生生物的间接或直接饵料，与此同时，水体中细菌对腐质碳的矿化作用在水体碳循环中也发挥着重要作用。大量实验证明，稻田土壤微生物群落在推动土壤有机质积累、转换、矿化及氮的释放过程中扮演着十分重要的角色。鉴于微生物在生态系统中的重要作用，深入研究不同养殖模式下环境中微生物数量和功能，对于进一步理解微生物在人工生态系统中的作用及其机制具有十分重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明提供了一株产植物生长素iaa的菌株及其应用。
4.本发明一株产植物生长素iaa的菌株为pantoea ananatis xbh-10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.24197。
5.本发明上述产植物生长素iaa的菌株在水稻种植中的用途。
6.本发明上述产植物生长素iaa的菌株在稻田养蟹中的用途。
7.本发明pantoea ananatis xbh-10菌落为圆形，呈乳白色，不透明，单菌落偏小且边缘较为整齐，经革兰氏染色为革兰氏阴性菌；具有iaa分泌能力，对植物具有促生作用。pantoea ananatis xbh-10在蒙金娜有机磷固体培养基上的解磷圈直径d为10.90mm，菌落直径d为2.43mm，d/d为4.49；具有较强的解有机磷能力。
8.在37℃条件下本发明pantoea ananatis xbh-10在胆盐浓度为0.6％的环境中存活率仍保持为75％；且pantoea ananatis xbh-10具有优异的耐酸性。
9.本发明pantoea ananatis xbh-10是从中华绒螯蟹肠道内容物中分离纯化获得，溶血实验结果为阴性，安全性高，并可促进植物生长和增加农作物产量，适合水稻种植，特别是稻田养蟹中使用。
10.pantoea ananatis xbh-10为菠萝泛菌pantoea ananatis，属于泛菌属(pantoea)；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.24197，保藏日期为2021年12月27日。
附图说明
11.图1是pantoea ananatis xbh-10进行salkowski比色法测定产iaa能力的结果图；
12.图2是pantoea ananatis xbh-10在蒙金娜有机磷固体培养基上的解磷试验结果图；
13.图3是由pantoea ananatis xbh-10构建的系统发育树；
14.图4是实施例5中28℃培养7天后各处理组水稻种子根芽的生长对比图。
具体实施方式
15.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
17.具体实施方式一：本实施方式一株产植物生长素iaa的菌株为pantoea ananatis xbh-10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.24197。
18.2021年8月，选取辽宁省盘锦市大洼区盘锦光合蟹业有限公司大水面养殖的中华绒螯蟹，将中华绒螯蟹肠道内含物置于含玻璃珠和50mlpbs的锥形瓶中，以180r/min的转速室温振荡30min，再进行梯度稀释，将10-3
、10-4
、10-5
梯度取100μl涂布于蒙金娜有机磷培养基平板上，每个梯度重复3次，置于28℃培养24～48h。观察是否有溶磷圈出现，挑取产生透明圈的菌株进行分离纯化。然后，将纯化的菌株接种于含有l-色氨酸的r2a液体培养基中，置于28℃恒温摇床180r/min震荡培养4d；再吸取50μl菌悬液滴于白色陶瓷板上，加入50μl的salkowski比色液，将白色陶瓷板置于室温避光条件下保存30min，观察颜色变化(若颜色变红，表示该菌株具有产生iaa的功能)，其中菌株xbh-10菌悬液滴加salkowski比色液后，室温避光条件下白瓷板中颜色变成微红色，如图1所示，说明菌株xbh-10具有产植物生长素的能力，对植物具有较强的促生作用。
19.精确称取iaa 10mg，先用少量的无水乙醇溶解，然后加入蒸馏水定容至100ml，配置成浓度为100μg/ml的iaa溶液作为贮备液，然后将贮备液稀释配置成浓度分别为0(空白)、0.5μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、15.0μg/ml、20.0μg/ml、25.0μg/ml的系列标准液，作为工作液。分别取上述工作液2ml按顺序加入到8支试管中，加入2倍体积的salkowski比色液，置于40℃避光条件下保温30min，然后测在波长530nm处的吸光值。以od
530
为横坐标，iaa浓度为纵坐标，绘制iaa标准曲线。
20.将纯化的菌株xbh-10接种于含有l-色氨酸的r2a液体培养基中，置于28℃恒温摇床180r/min震荡培养4d；再吸取xbh-10菌悬液用分光光度法测定波长600nm处的xbh-10菌悬液od值，再取xbh-10菌悬液以10000r/min的转速离心10min，取上清液加入等体积salkowski比色液，在40℃条件下避光放置30min使其显色，测定波长530nm处的od值。计算od
600
值为1时，单位体积发酵液中iaa的浓度，结果如表1所示。定量分析结果表明，每毫升菌株xbh-10发酵液中含有86.53μgiaa，菌株xbh-10的iaa分泌能力强。
21.表1
[0022][0023]
菌株xbh-10在蒙金娜有机磷固体培养基上的解磷圈直径d为10.90mm，菌落直径d为2.43mm，d/d为4.49(如图2所示)。
[0024]
菌株xbh-10的16s rrna鉴定：采用北京索莱宝生物科技公司的细菌基因组dna提
取试剂盒，提取分离纯化后的菌株dna。采用细菌通用引物27f/1492r进行pcr扩增，pcr扩增体系为25μl体系：10
×
缓冲液2.5μl、taq酶0.5μl、dntps 2μl、引物27f 0.5μl、引物1492r0.5μl、dna模板1μl、ddh2o 18μl。pcr扩增反应程序设定为：95℃预变性5min；94℃变性50s、56℃退火30s、72℃延伸1.5min，循环次数30次；72℃再延伸10min，4℃保存。将pcr扩增产物送往ruibiotech公司测序，菌株xbh-10的16s rrna与pantoea ananatis(ky458567.1)基因序列相似度为99％。通过ncbi数据库比对菌株16s rrna的测序结果，并构建系统进化树(如图3所示)。由图3菌株xbh-10的系统发育树可以看出菌株xbh-10与pantoea ananatis(ky458567.1)同处最小的一个分支，进化距离较近。
[0025]
菌株xbh-10的生理生化鉴定：将菌株xbh-10在固体lb培养基平板上三区划线，分离出单菌落并对其形态进行描述，根据《常用细菌系统鉴定手册》对菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定。菌株xbh-10菌落为圆形，呈乳白色，不透明，单菌落偏小且边缘较为整齐，经革兰氏染色为革兰氏阴性菌。菌株xbh-10的部分生理生化指标如表2所示。
[0026]
xbh-10在lb固体培养基上的菌落特征为：菌落为圆形，呈乳白色，不透明，单菌落偏小且边缘较为整齐，经革兰氏染色为革兰氏阴性菌。xbh-10的部分生理生化指标见下表。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对泛菌属生理特征的描述，xbh-10与pantoea ananatis模式种的生理生化具有相同特征，由各项生理生化推断xcr-1菌株可能为pantoea ananatis。
[0027]
表2
[0028][0029]
菌株xbh-10与pantoea ananatis模式种的生理生化具有相同特征，由各项生理生化以及16s rrna鉴定结果，确定菌株xbh-10为pantoea ananatis，将其命名为pantoea ananatis xbh-10。
[0030]
具体实施方式二：本实施方式配制pantoea ananatis xbh-10菌液。
[0031]
黄豆芽500g加水100ml，煮沸1h，过滤后补足水分，121℃湿热灭菌后存放备用，此即质量分数为50％的豆芽汁。
[0032]
pantoea ananatis xbh-10菌液培养基由1000ml质量分数为10％豆芽汁、18.87葡萄糖、2.23g氯化铵和0.47g磷酸二氢钾组成。
[0033]
以0.2％的接种量将pantoea ananatis xbh-10种子液接种于pantoea ananatis xbh-10菌液培养基，37℃、180r/min、培养24h，pantoea ananatis xbh-10菌液的活菌数达到2.13
×
109cfu/ml，(而xbh-10种子液中活菌数为9.82
×
108cfu/ml；xbh-10种子液由pantoea ananatis xbh-10接种lb液体培养基制成)。
[0034]
实施例1
[0035]
pantoea ananatis xbh-10耐酸实验：
[0036]
配制lb液体培养基并用0.1mol/l盐酸调节液体培养基ph值分别为2.0、3.0、4.0，再以2％的接种量将pantoea ananatis xbh-10菌液(菌液活菌数2.13
×
109cfu/ml)分别接种于上述液体培养基中，并设置不加盐酸的培养基作为对照。37℃培养3h，之后活菌计数。选择合适的稀释度，吸取100μl液体涂布平板，每个稀释度两个平板，在超净台内吹干。
[0037]
存活率＝酸调节培养液的活菌数/不加盐酸培养液的活菌数
×
100％。
[0038]
pantoea ananatis xbh-10耐酸实验结果如表3所示。说明pantoea ananatis xbh-10具有优异的耐酸性。
[0039]
表3
[0040][0041]
实施例2
[0042]
pantoea ananatis xbh-10耐胆盐实验：
[0043]
将pantoea ananatis xbh-10菌液(菌液活菌数2.13
×
109cfu/ml)以2％的接种量分别接种于不同胆盐浓度0.2％、0.4％和0.6％的液体培养基中，设置无胆盐培养基做对照，37℃培养4h，之后活菌计数。每个稀释度两个平板，在超净台内吹干。
[0044]
存活率＝胆盐培养液的活菌数/不加胆盐培养液的活菌数
×
100％。
[0045]
pantoea ananatis xbh-10耐胆盐实验结果如表4所示。说明pantoea ananatis xbh-10具有优异的耐胆盐性能。
[0046]
表4
[0047][0048]
实施例3
[0049]
将活化的pantoea ananatis xbh-10点接到tsa平板上，一个平板点接4个接菌点，并在4个接菌点的中央点接病原真菌f.moniliforme，30℃培养1周并观察结果。如果对病原真菌有拮抗作用，病原真菌就无法覆盖细菌生长，即能够形成明显的抑菌圈。
[0050]
pantoea ananatis xbh-10没有形成抑菌圈，不具有抗菌活性。
[0051]
实施例4
[0052]
在每个新鲜的血平板上划线接种pantoea ananatis xbh-10，30℃培养48h后观察。溶血分为α溶血(不完全性溶血，产生草绿色溶血环)、β溶血(完全性溶血，呈界限分明、无色透明的溶血环)以及不溶血。
[0053]
pantoea ananatis xbh-10溶血实验结果为阴性，可初步说明pantoea ananatis xbh-10没有人畜致病的风险。
[0054]
实施例5
[0055]
将pantoea ananatis xbh-10接入50ml lb液体培养基中，28℃、180r/min振荡培
养过夜，用无菌水将培养液稀释至菌体浓度为108cfu/ml，作为菌悬液，备用。
[0056]
选取完整饱满一致的龙粳31水稻种子置于小烧杯中加纯水将种子浸没并保持30min。然后剔除空秕粒，再用75％的乙醇表面消毒5min，之后用1％naclo浸泡5min，再用无菌水清洗3～5次；而后装入烧杯中加无菌水浸没水稻种子，于28℃催芽1d。
[0057]
将催芽1d的水稻种子在pantoea ananatis xbh-10菌悬液中浸泡1h后置于装有湿润滤纸的无菌培养皿中，每个培养皿中放置20粒。于人工气候培养箱中30℃、相对湿度70％、光暗比16h:8h条件下培养，注意补充水分，保持滤纸湿润。处理设置分为2组，其中，ck组注入10ml蒸馏水；处理组注入10ml两个不同浓度的pantoea ananatis xbh-10菌悬液(稀释至原浓度10-4
和10-5
)，每处理重复3次。放在恒温培养箱中28℃培养7天，测量根长、芽长。
[0058]
实验结果如表5所示，随着pantoea ananatis xbh-10菌悬液浓度的升高，在水稻种子萌发7天后，其芽长、根长和分根数较对照组有不同程度的升高，其中pantoea ananatis xbh-10菌悬液为10-4
组的芽长和根长较对照组有显著性升高(p》0.05)，从而说明pantoea ananatis xbh-10对于水稻种子的萌发具有较强的促生作用。
[0059]
表5
[0060]