一种调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的方法

一种调控植物基因组dna特定区域甲基化水平的方法
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种调控植物基因组dna特定区域甲基化水平的方法。


背景技术：

2.甲基化是植物基因组dna修饰的一种重要形式，对染色质结构及邻近基因表达具有重要的调控作用，参与沉默转座子元件维持基因组稳定性，进而影响植物的生长发育。同时dna甲基化是一种表观遗传修饰，部分dna甲基化修饰状态可以遗传到下一代，形成稳定的表观等位基因，例如拟南芥中的floweringwageningen基因(gallego-bartolom
é
,gardiner et al.2018)和水稻中的epi-d1位点(miura,agetsuma et al.2009)。dna甲基化在高等真核生物、真菌、细菌中都广泛存在，在高等真核生物中主要以5mc的形式存在，分布于异染色质区、转座子区和部分基因的启动子区，可以调控异染色质形成和维持、维持转座子沉默状态、参与基因表达调控。研究发现dna甲基化调控在水稻种子发育过程、非生物胁迫响应中具有重要作用(kim,ono et al.2019,rajkumar,shankar et al.2019)。但是在植物中尤其是重要粮食作物如水稻、小麦、玉米中，对dna甲基化的修饰位点、对临近基因的调控作用和作用机制等了解的不十分清楚。crispr/cas9系统是近年发展的一种基因编辑方法，cas9蛋白可通过sgrna上的特异性序列结合到基因组特定位点，并通过cas9蛋白中的ruvc和hnh结构域切割dna的两条链，形成dna双链断裂,通过在ruvc和hnh结构域中引入点突变可使其失去切割dna的活性。使失活的cas9蛋白与具有其他功能的蛋白融合表达，例如与提高转录水平的蛋白融合表达，可通过cas9结合特定基因组dna位点从而提高下游基因的转录水平。在之前的研究中，研究者通过将人的去甲基化酶ten-eleventranslocation1(tet1cd)与人工锌指蛋白融合表达靶向fwa基因的启动子，可以高效的在拟南芥fwa基因启动子区去甲基化，使fwa基因表达量上调，并产生可遗传的晚花表型(johnson,du et al.2014)。在另一项研究中，将拟南芥rddm途径中的一个蛋白su(var)3-9homolog 9(suvh9)与人工锌指蛋白融合表达靶向fwa基因的启动子，可以提高fwa基因启动子的甲基化水平，抑制fwa基因表达，并恢复fwa-4突变体的晚花表型。
3.水稻是一种主要粮食作物，也是基因功能研究中一种重要的单子叶模式植物。与拟南芥相比水稻dna甲基化具有如下特点：1.水稻中cg、chg、chh三种甲基化水平远高于拟南芥。2.cg和chg甲基化主要集中在异染色质区，修饰转座元件，chh甲基化主要集中在水稻的常染色质区，修饰一些长度较短的转座元件。水稻基因组中有大量分布于基因间区的mites(miniature inverted-repeat transposable elements)短小dna转座元件，mites主要发生chh甲基化修饰，并且chh甲基化修饰在调控附近基因表达中起着非常重要的作用。3.水稻中很多功能基因都有甲基化修饰，说明甲基化修饰可能参与抑制这些基因的表达。dna甲基化修饰可通过影响染色质状态调控附近基因表达，从而影响生长发育及对环境条件的响应，已鉴定出的参与dna甲基化调控的因子参与了种子发育、组织器官建成、花发育等，从而对水稻产量产生影响。通过crispr系统特异的改变特异基因区域的甲基化水平是
研究dna甲基化修饰调控基因表达的一种重要方式，但是在水稻等单子叶植物中并未有类似的工具可以特异调控靶向位点的甲基化水平。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种调控植物基因组dna特定区域甲基化水平的方法。
5.第一方面，本发明要求保护一种用于调控植物基因组dna特定区域甲基化水平的系统(产品)。所述特定区域为靶序列及其附近区域。
6.本发明要求保护的用于调控植物基因组dna特定区域甲基化水平的系统，包含(或为)以下中任一项：
7.i、甲基化调控融合蛋白，和向导rna。
8.ii、包含编码甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体(记为表达构建体1)，和向导rna。
9.iii、甲基化调控融合蛋白，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体。
10.iv、包含编码甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体(即表达构建体1)，和包含编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体(记为表达构建体2)。
11.v、包含编码甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列和编码向导rna的核苷酸序列的表达构建体(记为表达构建体3)。
12.所述甲基化调控融合蛋白包含核酸酶失活的cas9结构域(即失去核酸内切酶活性但是保留靶dna结合活性的cas9蛋白，如dcas9)和甲基化调控结构域。进一步地，所述甲基化调控融合蛋白由所述核酸酶失活的cas9结构域和所述甲基化调控结构域融合而成。
13.所述向导rna能够将所述甲基化调控融合蛋白靶向植物基因组dna中的靶序列。依靠所述向导rna上的间隔序列(spacer)识别植物基因组dna中的靶序列。
14.所述甲基化调控结构域为上调甲基化水平的tet1cd结构域或下调甲基化水平的ossuvh2结构域。
15.进一步地，所述核酸酶失活的cas9结构域的氨基酸序列可如seq id no.12的第742-2243位(或者seq id no.14的第685-2186位)。
16.进一步地，所述tet1cd结构域的氨基酸序列可如seq id no.12的第1-741位所示；所述ossuvh2结构域的氨基酸序列可如seq id no.14的第1-684位所示。
17.更进一步地，所述甲基化调控融合蛋白的氨基酸序列可如seq id no.12或seq id no.14所示。
18.当所述甲基化调控结构域是上调甲基化水平的tet1cd结构域时，所述甲基化调控融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.12所示。当所述甲基化调控结构域是下调甲基化水平的ossuvh2结构域时，所述甲基化调控融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.14所示。
19.对应于基因水平，编码所述核酸酶失活的cas9结构域的核苷酸序列可如seq id no.11的第2224-6732位(或者seq id no.13的第2053-6561位)所示；编码所述tet1cd结构域的核苷酸序列可如seq id no.11的第1-2223位所示；编码所述ossuvh2结构域的核苷酸序列如seq id no.13的第1-2052位所示。
20.进一步地，编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列可如seq id no.11或seq id no.13所示。
21.当所述甲基化调控结构域是上调甲基化水平的tet1cd结构域时，编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列如seq id no.11所示。当所述甲基化调控结构域是下调甲基化水平的ossuvh2结构域时，编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列如seq id no.13所示。
22.在所述表达构建体1和所述表达构建体3中，启动编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列转录启动子可以是ubi启动子(即玉米泛素启动子)。在所述表达构建体2和所述表达构建体3中，启动编码所述向导rna的核苷酸序列转录启动子可以是u3启动子(如水稻u3启动子)。
23.在本发明中，所述表达构建体具体可为表达载体。
24.第二方面，本发明要求保护一种表达载体。
25.本发明要求保护的表达载体包括表达盒a和表达盒b；
26.所述表达盒a用于表达前文第一方面中所述的甲基化调控融合蛋白；
27.所述表达盒b用于表达不含有间隔序列(spacer)的向导rna骨架。
28.进一步地，在所述表达盒b中，可含有用于插入编码间隔序列(spacer)的dna序列的酶切位点(如bsai)。
29.进一步地，在所述表达盒a中，启动编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列转录启动子可以是ubi启动子(即玉米泛素启动子)。在所述表达盒b中，启动编码所述不含有间隔序列(spacer)的向导rna骨架的核苷酸序列转录启动子可以是u3启动子(如水稻u3启动子)。
30.第三方面，本发明要求保护成套表达载体。
31.本发明要求保护的成套表达载体由表达载体甲和表达载体乙组成。
32.所述表达载体甲用于表达前文第一方面中所述的甲基化调控融合蛋白；
33.所述表达载体乙用于表达不含有间隔序列(spacer)的向导rna骨架。
34.进一步地，在所述表达载体乙中，可含有用于插入编码间隔序列(spacer)的dna序列的酶切位点(如bsai)。
35.进一步地，在所述表达载体甲中，启动编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列转录启动子可以是ubi启动子(即玉米泛素启动子)。在所述表达载体乙中，启动编码所述不含有间隔序列(spacer)的向导rna骨架的核苷酸序列转录启动子可以是u3启动子(如水稻u3启动子)。
36.第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
37.p1、前文第一方面所述的系统或前文第二方面所述的表达载体或前文第三方面所述的成套表达载体在调控植物基因组dna特定区域(即靶序列及其附近区域)甲基化水平中的应用。
38.p2、前文第一方面所述的系统或前文第二方面所述的表达载体或前文第三方面所述的成套表达载体在植物育种中的应用。
39.p3、前文第二方面所述的表达载体或前文第三方面所述的成套表达载体在制备前文第一方面所述的系统中的应用。
40.第五方面，本发明要求保护一种调控植物基因组dna特定区域甲基化水平的方法。所述特定区域为靶序列及其附近区域。
41.本发明要求保护的调控植物基因组dna特定区域甲基化水平的方法，可包括将前文第一方面所述系统导入受体植物中得到转基因植物的步骤。
42.进一步地，将所述系统导入所述受体植物，具体可为：通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
43.上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
44.当将所述系统导入受体植物中后，由所述向导rna将所述甲基化调控融合蛋白靶向所述植物基因组dna中的靶序列，导致靶序列及附近区域甲基化水平发生改变。
45.当要上调植物基因组dna特定区域(即靶序列及其附近区域)甲基化水平时，所述甲基化调控结构域选择上调甲基化水平的所述tet1cd结构域。当要下调植物基因组dna特定区域(即靶序列及其附近区域)甲基化水平时，所述甲基化调控结构域选择下调甲基化水平的所述ossuvh2结构域。
46.第六方面，本发明要求保护一种植物育种方法，包括如下步骤：将通过前文第五方面所述方法获得的在特异位点(即所述特定区域)甲基化水平改变的第一植物与所述特异位点(即所述特定区域)的甲基化水平没有改变的第二植物杂交，从而将所述特异位点(即所述特定区域)的甲基化水平的改变导入所述第二植物。
47.其中，所述第一植物和所述第二植物为可杂交的植物，优选为同种植物。
48.在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物；优选为禾本科植物；更优选为水稻。
49.在上述各方面中，所述特定区域可为ipa1基因启动子区；所述靶序列如seq id no.1(高甲基化水平区靶点)或seq id no.2(低甲基化水平区靶点)所示。
50.进一步地，所述向导rna如seq id no.3(对应seq id no.1)或seq id no.7(对应seq id no.2)所示。
51.相应地，编码所述向导rna的核苷酸序列如seq id no.4(对应seq id no.3)或seq id no.8(对应seq id no.7)所示。
52.在本发明的具体实施方式中，seq id no.3所示的所述向导rna与用于上调甲基化水平的所述甲基化调控融合蛋白配合使用；seq id no.4所示的所述向导rna与用于下调甲基化水平的所述甲基化调控融合蛋白配合使用。
53.实验证明，本发明所提供的系统和方法能够有效调控植物如水稻基因组dna特定区域甲基化水平，本发明对于研究植物特别是水稻dna甲基化修饰调控基因表达，进而培育植物如水稻新品种具有重要意义。对于深入研究物种间及物种内dna甲基化的不同特征及其对重要农艺性状的调控作用，及dna甲基化的维持机制等具有重要意义。通过调控基因组dna甲基化可在不改变基因序列的前提下调控基因的时空表达模式和水平，从而能精细调控作物在不同环境条件及逆境压力下的表型特点及胁迫响应，进而培育优良的作物品种，有助于保障世界粮食安全。
附图说明
54.图1为构建体a1的质粒图谱。
55.图2为构建体a2的质粒图谱。
56.图3为b1转化水稻原生质体中靶点附近甲基化水平。
57.图4为b2转化水稻原生质体中靶点附近甲基化水平。
58.图5为b1转基因当代水稻群体的生长情况。
59.图6为b2转基因当代水稻群体的生长情况。
60.图7为b1转基因当代水稻和b2转基因当代水稻的分子鉴定。
61.图8为b1转基因当代水稻材料中靶点附近甲基化水平。
62.图9为b2转基因当代水稻材料中靶点附近甲基化水平。
具体实施方式
63.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的生物化学、分子生物学、遗传学等相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的重组dna技术和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：sambrook，j.，fritsch，e.f.和maniatis，t.，molecular cloning：a laboratory manual；cold spring harbor laboratory press：cold spring harbor，1989。本发明中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0064]“cas9核酸酶”和“cas9”在本文中可互换使用，指的是包括cas9蛋白或其片段(如包含cas9的核酸内切酶结构域和/或向导rna结合结构域的蛋白)的rna指导的核酸酶。cas9是crispr/cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白)基因组编辑系统的组分，能通过向导rna指导靶向并切割dna靶序列形成dna双链断裂(dsb)。
[0065]“向导rna”和“grna”在本文中可互换使用，通常由crispr rna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)通过部分互补形成的复合物构成，其中crrna包含能与靶序列互补并特异性指导crispr复合体(cas9 crrna tracrrna)与靶序列结合的序列，在使用crispr系统进行基因编辑及其他应用时，可人工设计单向导rna(sgrna)，在一条rna链中同时包含crrna和tracrrna的特征，并指导crispr复合体特异与靶序列结合。
[0066]“甲基化调控酶”是提高或降低基因组dna甲基化水平的酶。在本发明中，所述甲基化调控酶指人的去甲基化酶ten-eleven translocation1(tet1cd)或水稻的甲基化酶su(var)3-9homologs 2(loc_os07g25450)，其分别具有降低和提高基因组dna甲基化水平的作用。
[0067]“基因组”用于植物时不仅指细胞核中的染色体dna，还包括存在于叶绿体、线粒体等细胞器中的dna。
[0068]
水稻品种中花11，属于粳型常规稻品种，用zh11表示。
[0069]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
biotechnology 35.5(2017):438.”一文中)，通过将原始载体中的cas9蛋白编码区替换为ossuvh2-dcas9编码区得到构建体a2。
[0080]
二、表达构建体b1和表达构建体b2的制备
[0081]
靶标区域：水稻基因组ipa1基因启动子区。
[0082]
1、靶点的选择
[0083]
根据spcas9的pam序列ngg找出ipa1启动子区上的靶点，使用blast检索水稻基因组dna排除可能靶向基因组其他位置的靶点，并结合之前文献中对ipa1启动子区甲基化修饰状态的描述，选出1个位于高甲基化水平区域的靶点t1(seq id no.1)验证甲基化调控构建体a1，选出一个位于低甲基化水平区域的靶点t2(seq id no.2)验证提高甲基化水平的构建体a2。靶点序列如表1所示。
[0084]
表1、使用的靶点
[0085][0086][0087]
2、构建体的制备
[0088]
根据表1中的序列，分别设计t1、t2对应的grna及其编码序列，如表2所示(seq id no.3、seq id no.4、seq id no.7、seq id no.8)。
[0089]
以seq id no.5和seq id no.6为引物，将退火后形成的退火产物(所述退火产物为带有粘性末端的双链dna)与经过限制性内切酶bsai酶切后的步骤一制备的构建体a1连接，得到构建体b1。所述构建体b1为在构建体a1的bsai酶切位点处插入t1对应的grna编码序列(即seq id no.5和seq id no.6退火后的片段)并保持构建体a1其他部分序列不变的重组构建体。
[0090]
以seq id no.9和seq id no.10为引物，将退火后形成的退火产物(所述退火产物为带有粘性末端的双链dna)与经过限制性内切酶bsai酶切后的步骤一制备的构建体a2连接，得到构建体b2。所述构建体b2为在构建体a2的bsai酶切位点处插入t2对应的grna编码序列(即seq id no.9和seq id no.10退火后的片段)并保持构建体a2其他部分序列不变的重组构建体。
[0091]
表2、两个靶点的grna以及引物信息
[0092][0093]
3、水稻原生质体中甲基化调控活性的验证
[0094]
将构建体b1转入水稻品种中花11(zh11)的原生质体，从转化的原生质体中提取基因组dna，使用zymo research公司的ez dna methylation-lightning kit试剂盒(货号：d5030)对基因组dna进行亚硫酸盐处理，使用如下特异性引物进行pcr测序检测靶点t1附近的甲基化水平：
[0095]
bspseq1-f1：5
’‑
ggttcgtcggagtagggg-3’；
[0096]
bspseq1-r1：5
’‑
atatcattaattatcttcttat-3’；
[0097]
bspseq1-f2：5
’‑
taggggcgttcggggagtttt-3’；
[0098]
bspseq1-r2：5
’‑
tttaacaaaatacaaaacaataa-3’。
[0099]
构建体b1转化后的原生质体在t1位点附近的甲基化水平较中花11(zh11)原生质体发生了下降，如图3所示，b1转化原生质体在靶点附近的甲基化水平显著下调(student’s t-test,*p《0.05)，说明b1构建体能在靶点附近负调控甲基化水平。
[0100]
将构建体b2转入水稻品种中花11(zh11)的原生质体，从转化的原生质体中提取基因组dna，使用zymo research公司的ez dna methylation-lightning kit试剂盒(货号：d5030)对基因组dna进行亚硫酸盐处理，使用特异性引物进行pcr测序检测靶点t2附近的甲基化水平：
[0101]
bspseq2-f：5
’‑
tgtgggtgyagtgtyatttagagtt-3’；
[0102]
bspseq2-r：5
’‑
cctcctccactrrccatctccatt-3’。
[0103]
其中，y为t或c。
[0104]
构建体b2转化后的原生质体在t2位点附近的甲基化水平较中花11(zh11)原生质体发生了上升，如图4所示，b2转化原生质体在靶点附近的甲基化水平显著上调(student’s t-test,***p《0.001)，说明b2构建体能在靶点附近正调控甲基化水平。
[0105]
4、转基因水稻的制备
[0106]
将构建体b1导入农杆菌eha105中，得到农杆菌b1，使用农杆菌b1转染中花11(zh11)水稻的愈伤组织，得到b1转基因当代水稻群体。所述b1转基因当代水稻群体的生长情况如图5所示。
[0107]
将构建体b2导入农杆菌eha105中，得到农杆菌b2，使用农杆菌b2转染中花11
(zh11)水稻的愈伤组织，得到b2转基因当代水稻群体。所述b2转基因当代水稻群体的生长情况如图6所示。
[0108]
从图5和图6中可以看出与中花11(zh11)相比，b1转基因当代水稻的分蘖更少，b2转基因当代水稻的分蘖更多。与之前文献中的描述一致(lin zhang et al.,2016,nat commun)。
[0109]
5、转基因阳性材料的鉴定
[0110]
使用ctab法提取步骤4中b1转基因当代水稻和b2转基因当代水稻叶片组织中的基因组dna，通过pcr扩增t-dna中的潮霉素基因，具体引物如下：
[0111]
hpt-f：5
’‑
atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgt-3’；
[0112]
hpt-r：5
’‑
ctatttctttgccctcggacgagt-3’。
[0113]
转基因阳性植株可扩增出1kb的片段，不含转基因的植株不能扩增出此片段，凝胶电泳结果如图7所示，表明所获得的b1转基因当代植株和b2转基因当代植株全部为转基因阳性植株。
[0114]
6、转基因当代水稻材料中靶点附近甲基化水平的测定
[0115]
分别使用中花11(zh11)、b1转基因当代水稻的基因组dna进行亚硫酸盐处理，使用特异性引物(见上文步骤3中相关序列)进行pcr测序检测靶点t1附近的甲基化水平。如图8所示，b1转基因当代水稻在靶点附近的甲基化水平显著下调(student’s t-test,***p《0.001)。
[0116]
分别使用中花11(zh11)、b2转基因当代水稻的基因组dna进行亚硫酸盐处理，使用特异性引物(见上文步骤3中相关序列)进行pcr测序检测靶点t2附近的甲基化水平。如图9所示，b2转基因水稻在靶点附近的甲基化水平显著上调(student’s t-test,***p《0.001)。
[0117]
由图8和图9所示，可见b1转基因当代水稻在t1位点附近的甲基化水平较中花11(zh11)发生了下降，b2转基因当代水稻在t2位点附近的甲基化水平较中花11(zh11)发生了上升。
[0118]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。