喹诺里西啶类生物碱及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种农作物的农药，特别是一种喹诺里西啶类生物碱及其制备方法和应用。


背景技术：

2.在植物缺乏免疫系统，以及植物病毒对于植物细胞存在绝对地寄生特性下，植物病毒对于植物的危害非常大，会造成严重损失，并且其防治是非常困难且复杂的，这使得植物病毒有“植物癌症”之称。病毒复制所需的材料、能量和场所都在植物细胞中获得，并且病毒可以强迫宿主细胞的完成生化机制的行动，使寄主细胞的生理机制和病毒的生命活动交织在一起，很难识别出寄主细胞和病毒的差别，因此很难做到只攻击病毒而不攻击宿主细胞，不造成宿主细胞的损害，所以具有高选择性的化学的抗病毒药剂面临着巨大的困难，一直没有获得重大的突破。
3.目前并没有一种国际公认的抗植物病毒药物。烟草花叶病毒(to bacco mosaic virus；tmv)，是一种单链的rna病毒，只能感染植物，特别是烟草和其他茄科的植物，能让这些受到侵染的叶片看来非常斑驳污损；根据科学研究价值和经济重要性的研究，将tmv排在全球10大危害性植物病毒中的第一位。而化学药剂因为其效果迅速且显著的特点被人们广泛利用，已成为了防治植物病毒病最主要的手段。当前国内外用于防治tmv药剂主要有两种，一类是天然药物，另一类则是合成类药物。盐酸吗琳呱病毒灵、菌毒清、菇类蛋白质多糖抗毒剂号等是比较常用的防治烟草花叶病毒病的化学药剂，但是这些药剂的控制效果不显著，并药效不稳定，很难满足农业的需求。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，提供一种喹诺里西啶类生物碱及其制备方法和应用。它具有能够预防与治疗烟草花叶病毒的特点。
5.本发明的技术方案：喹诺里西啶类生物碱，该喹诺里西啶类生物碱中包含化合物1～化合物7中的任意一种或多种的组合：
6.化合物1为
7.化合物2为
8.化合物3为
9.化合物4为
10.化合物5为
11.化合物6为
12.化合物7为
13.前述的喹诺里西啶类生物碱中，所述喹诺里西啶类生物碱是从披针叶野决明种子中通过提取分离或人工合成获得。
14.基于前述的喹诺里西啶类生物碱的制备方法，包括以下步骤:
15.①
取干燥的披针叶野决明种子以乙醇回流提取，合并提取液浓缩，得浸膏；
16.②
将浸膏经大孔吸附树脂df01层析，用乙醇:水以体积比为10:90～0:100为流动相进行梯度洗脱，得馏分a、馏分b、馏分c和馏分d；
17.③
将馏分c经rp-18柱层析，用甲醇:水以体积比为10:90～100:0为流动相进行梯度洗脱，得c1品、c2品、c3品和c4品；
18.④
将c1品经甲醇凝胶纯化，再通过300～400目硅胶柱层析，用二氯甲烷:甲醇以体积比为100:0～0:100为流动相进行梯度洗脱，得化合物7、化合物3和化合物4；
19.⑤
将c3品经甲醇凝胶纯化，再经半制备hplc纯化，流动相为乙腈-水，体积比为15:85，得化合物1和化合物2；
20.⑥
将c4品经300～400目硅胶柱层析，用石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为50:1:0.1～1:1:0.1为流动相进行梯度洗脱，再经半制备hplc纯化，流动相为乙腈-水，体积比为35:65，得化合物5和化合物6。
21.前述的制备方法中，所述步骤
①
中的回流提取次数为3次，每次2～3小时。
22.前述的制备方法中，所述步骤
①
中的披针叶野决明为豆科野决明属植物。
23.前述的制备方法中，所述步骤
②
中馏分a是由乙醇:水以10:90的体积比洗脱得到，馏分b是由乙醇:水以25:75的体积比洗脱得到，馏分c是由乙醇:水以50:50的体积比洗脱得到，馏分d是由乙醇:水以75:25的体积比洗脱得到。
24.前述的制备方法中，所述步骤
③
中的c1品是由甲醇:水以30:70的体积比洗脱得到，c2品是由甲醇:水以50:50的体积比洗脱得到，c3品是由甲醇:水以70:30的体积比洗脱得到，c4品是由甲醇:水以90:10的体积比洗脱得到。
25.前述的制备方法中，所述步骤
④
中的化合物7是由二氯甲烷:甲醇以50:1的体积比洗脱得到，化合物3是由二氯甲烷:甲醇以20:1的体积比洗脱得到，化合物4是由二氯甲烷:
甲醇以5:1的体积比洗脱得到。
26.上述方法制备得到的喹诺里西啶类生物碱化合物3和化合物4为无色透明晶体，其余为无色油状物，化合物1～化合物6的核磁氢谱(1h-nmr)和碳谱(
13
c-nmr)数据如表1和表2，其中表1为化合物1～化合物6的氢谱(1h-nmr)数据，表2化合物1～化合物6的碳谱(
13
c-nmr)数据。
27.表1化合物1～6的1h nmr数据(δin ppm,j in hz)
28.29.[0030][0031]a600mhz in cdcl3；b600mhz in dmso-d6.
[0032]
表2化合物1～6的13c nmr数据(δin ppm,j in hz)
[0033]
[0034][0035]a600mhz in cdcl3；b600 mhz in dmso-d6.
[0036]
经过上述结构鉴定，得化合物1～化合物6为：
[0037]
化合物1：无色油状物；uv(meoh)λ
max
(logε)：303(4.03),256(3.03),229(3.75)nm；ir(kbr)v
max 3430,2931,2356,1646,1550,1448,1344,1143,1058,804cm-1
；1h and 13
c nmr数据(cdcl3，600and 150mhz)见表1和表2；hresims m/z527.22644[m na]

，(计算值c
28h32
n4o5na,527.22649)。
[0038]
化合物2：无色油状物；uv(meoh)λ
max
(logε)：305(4.51),256(3.69),226(4.38)nm；ir(kbr)v
max 3436,2929,2852,2350,1652,1544,1444,1351,1145,806cm-11
h and 13
c nmr数据(cdcl3，600and 150mhz)见表1和表2；hresims m/z527.22614[m na]

(计算值c
28h32
n4o5na,527.22649)。
[0039]
化合物3：无色透明晶体；mp268-270℃；270℃；uv(meoh)λ
max
(logε)：292(4.16),276(4.41),250(3.66),226(4.19)nm；ir(kbr)v
max 2925,2356,1625,1565,1455,1322,1166,1058,804,603cm-1
；1h and 13
c nmr数据(cdcl3，600and 150mhz)见表1和表2；hresims m/z 497.21463[m na]

(计算值c
27h30
n4o4na,497.21593)。
[0040]
化合物4：无色透明晶体；mp273-275℃；；275℃；；uv(meoh)λ
max
(logε)：349(3.12),292(4.39),250(3.69),223(4.31)nm；ir(kbr)v
max 2925,2854,2356,1648,1544,1461,1349,1282,1149,806cm-1
；1h and 13
c nmr数据(cdcl3，600and 150mhz)见表1和表2；hresims m/z 469.21982[m na]

(计算值c
26h30
n4o3na,469.22101)。
[0041]
化合物5：无色油状物；uv(meoh)λ
max
(logε)：308(4.08),250(3.10),233(4.06),227(4.02)nm；ir(kbr)v
max 3388,2931,2364,1768,1648,1548,1375,1145,1047,802cm-1
；1h and 13
c nmr数据(dmso-d6，600and 150mhz)见表1和表2；hresims m/z 357.14139[m na]

(计算值c
17h22
n2o5na,357.14209)。
[0042]
化合物6：无色油状物；uv(meoh)λ
max
(logε)：308(4.08),251(3.11),231(4.08),220(4.01)nm；ir(kbr)v
max 3382,2937,2360,1768,1648,1548,1357,1145,1047,802cm-1
；1h and 13
c nmr数据(dmso-d6，600and 150mhz)见表1和表2；hresims m/z357.14139[m na]

(计算值c
17h22
n2o5na,357.14209)。
[0043]
一种药物组合物，包括前述的喹诺里西啶类生物碱，或其在农药学上可接受的衍生物及其盐类，或者其农药上可接受的载体。
[0044]
该药物组合物为药物制剂。该药物制剂包括：粉剂、可湿性粉剂、乳油、颗粒剂、悬浮剂、可溶性液剂、乳粉、水剂、烟剂、种衣剂和微囊剂等。
[0045]
本发明还提供前述的喹诺里西啶类生物碱或前述的药物组合物在制备抗烟草花叶病毒农药中的应用。
[0046]
与现有技术相比，本发明以披针叶野决明种子为原料，采用了一种新的提取分离方式，制备方法简便易操作，提取出了新化合物，结构新颖，鉴定为喹诺里西啶类生物碱。经
试验验证，该喹诺里西啶类生物碱对番茄斑萎病毒，在治疗和预预防面均具有较强的抗tmv活性。
附图说明
[0047]
图1为烟草叶片在化合物3 tmv、ck (tmv)、ck-(dmso)和化合物3的诱导下,烟草叶片上苯丙氨酸解氨酶的酶活性的测定结果图；
[0048]
图2为烟草叶片在化合物3 tmv、ck (tmv)、ck-(dmso)和化合物3的诱导下,烟草叶片上天然多酚氧化酶的酶活性的测定结果图；
[0049]
图3为烟草叶片在化合物3 tmv、ck (tmv)、ck-(dmso)和化合物3的诱导下,烟草叶片上过氧化物酶的酶活性的测定结果图；
[0050]
图4为烟草叶片在化合物3 tmv、ck (tmv)、ck-(dmso)和化合物3的诱导下,烟草叶片上超氧化物歧化酶的酶活性的测定结果图。
具体实施方式
[0051]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
[0052]
实施例。喹诺里西啶类生物碱，该喹诺里西啶类生物碱中包含化合物1～化合物7的任意一种或多种的组合：
[0053]
化合物1为
[0054]
化合物2为
[0055]
化合物3为
[0056]
化合物4为
[0057]
化合物5为
[0058]
化合物6为
[0059]
化合物7为
[0060]
所述喹诺里西啶类生物碱是从披针叶野决明种子中通过提取分离或人工合成获得。
[0061]
所述的喹诺里西啶类生物碱的制备方法包括以下步骤:
[0062]
①
取干燥的披针叶野决明种子1kg以乙醇回流提取3次，每次2～3小时，合并提取液浓缩，得180g的浸膏；
[0063]
②
将浸膏经大孔吸附树脂柱层析，用乙醇:水以体积比为10:90～0:100为流动相进行梯度洗脱，得馏分a、馏分b、馏分c和馏分d，其中馏分a是由乙醇:水以10:90的体积比洗脱得到，馏分b是由乙醇:水以25:75的体积比洗脱得到，馏分c是由乙醇:水以50:50的体积比洗脱得到，馏分d是由乙醇:水以75:25的体积比洗脱得到；
[0064]
③
将馏分c经rp-18柱层析，用甲醇:水以体积比为10:90～100:0为流动相进行梯度洗脱，得c1品、c2品、c3品和c4品，其中c1品是由甲醇:水以30:70的体积比洗脱得到，c2品是由甲醇:水以50:50的体积比洗脱得到，c3品是由甲醇:水以70:30的体积比洗脱得到，c4品是由甲醇:水以90:10的体积比洗脱得到；
[0065]
④
将c1品经甲醇凝胶纯化，再通过300～400目硅胶柱层析，用二氯甲烷:甲醇以体积比为100:0～0:100为流动相进行梯度洗脱，得化合物7、化合物3和化合物4，其中化合物7是由二氯甲烷:甲醇以50:1的体积比洗脱得到，化合物7为156.4mg；化合物3是由二氯甲烷:甲醇以20:1的体积比洗脱得到，化合物3为156.4mg；化合物4是由二氯甲烷:甲醇以5:1的体积比洗脱得到，化合物4为19.5mg。
[0066]
⑤
将c3品经甲醇凝胶纯化，再经半制备hplc纯化，流动相为乙腈-水，体积比为15:85，得8.3mg的化合物1和7.9mg的化合物2；
[0067]
⑥
将c4品经300～400目硅胶柱层析，用石油醚:丙酮:二乙胺以体积比为50:1:0.1～1:1:0.1为流动相进行梯度洗脱(该梯度洗脱方式为依次采用体积比为50:1:0.1、25:1:0.1、10:1:0.1、5:1:0.1、2:1:0.1和1:1:0.1的石油醚-丙酮-二乙胺溶液作为流动相对c4品进行洗脱)，再经半制备hplc纯化，流动相为乙腈-水，体积比为35:65，得15.6mg的化合物5和18.9mg的化合物6。
[0068]
一种药物组合物，包括所述的喹诺里西啶类生物碱，或其在农药学上可接受的衍生物及其盐类，或者其农药上可接受的载体。
[0069]
本发明还提供所述喹诺里西啶类生物碱或所述药物组合物在制备抗烟草花叶病毒农药中的应用。
[0070]
实验例1：将经本发明制备得到的喹诺里西啶类生物碱进行抗tmv活性研究验证，具体方法如下：
[0071]
a、烟草花叶病毒准备：烟草花叶病毒普通株系u1，由云南省农业科学院生物技术
与种质资源研究所提供。繁殖于普通烟k326上，提纯后用紫外分光光度计测定其浓度为16mg/ml，保存于-70℃冰箱中，备用；
[0072]
b、接种病毒和施药：
[0073]
先施药后接毒：挑选健康、长势一致的心叶烟，每株烟挑选叶龄和叶片大小一致的3片叶片，供试喹诺里西啶类生物碱，稀释为100μg/ml，每片叶子的一半均匀施药，另一半施用相应浓度的dmso水溶液作为对照，24h后每片叶片摩擦接种tmv 200μl。接种病毒后10min用水将叶表面的金刚砂冲洗干净。在无虫温室中培养3～4天，待枯斑症状明显时统计试验结果。每个样品做三个重复，实验采用宁南霉素作为阳性对照。
[0074]
先接毒后施药：挑选健康、长势一致的心叶烟，每株烟挑选叶龄和叶片大小一致的3片叶片，每片烟叶摩擦接种tmv 200μl，10min后用水将叶表面的金刚砂冲洗干净。24h后每片叶子的一半均匀施用100μg/ml的喹诺里西啶类生物碱，另一半施用相应浓度的dmso溶液水溶液作为对照。在无虫温室中培养3～4天，待枯斑症状明显时统计试验结果，计算抑制率。每个样品做三个重复，实验采用宁南霉素作为阳性对照。实验结果如表3所示，其中
[0075]
抑制率＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数*100％；
[0076]
表3.化合物1-7抗tmv活性结果
[0077][0078]a三次平均值；b宁南霉素作为阳性对照.
[0079]
通过体内抗tmv试验表明；化合物3(100μg/ml)在先施药后接种病毒的处理中表现出较强的保护和治疗作用，其预防作用的抑制率为83.1％，高于阳性对照宁南霉素67.16％，其治疗作用的抑制率为65.8％，与阳性对照宁南霉素65.7％持平。
[0080]
由于化合物3活性优于阳性宁南霉素，测定其是否能增加相关防御酶活力，利用植物检测试剂盒(solarbio，北京，中国)测定化合物3和tmv的作用下烟草叶片上的苯丙氨酸解氨酶(pal)、过氧化物酶(pod)、超氧化物歧化酶(ppo)、天然多酚氧化酶(sod)活性是否发生改变。
[0081]
实验结果如图1-4所示[图1-4为烟草叶片在化合物3 tmv、ck (tmv)、ck-(dmso)和化合物3的诱导下,烟草叶片上pal、sod、pod和ppo酶活性的测定结果；图中x轴为接种后的
时间(天)]，通过实现结果表明：在pal活性中化合物3 tmv处理的烟叶高于ck 和ck-组，并在第4天时达到最大值；发现了化合物3 tmv处理下烟叶的sod活性在第3天和第5天时达到峰值，且明显高于其他方式处理下的活性。值得注意的是，化合物3 tmv处理后烟叶中的pod活性从第1天一直提升到第5天，并且在第5天显著高于另一种治疗组的活性；化合物3 tmv处理烟草叶片ppo活性在第6天达到峰值，高于对照植株。防御酶活性测定结果表明，化合物3可以通过诱导防御酶(pal、pod、ppo和sod)的形式提高烟草的抗病能力。