一种复合荧光纳米探针及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种复合荧光纳米探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.mirna的异常表达与多种癌症的发生发展密切相关，可以通过调控靶基因影响肿瘤细胞凋亡、侵袭、转移等重要过程。不同的mirna在人体内可能发挥致癌或抑癌的不同作用。如mirna-21在包括胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌等多种癌症中作为致癌基因过表达，而let-7在这些癌症中作为抑癌基因低表达。开发实时原位检测细胞内mirna和细胞凋亡的方法，可视化监测mirna表达量的变化对细胞凋亡的影响，对评估mirna靶向治疗的可行性和实现癌症患者的精准个性化治疗具有重要的临床意义。
4.目前检测细胞内mirna的方法主要基于分子生物学，如northern印迹法、微列阵分析、聚合酶链式反应(qrt-pcr)等。检测细胞凋亡的方法主要有电镜形态学观察法、免疫组织化学分析、蛋白质印迹法(wb)等。但这些方法都需要对细胞进行固定、裂解，是在细胞匀浆、死细胞水平上进行的检测，不能准确反映活细胞中mirna表达量和细胞凋亡的实时变化，而且这些方法存在实验操作繁琐费时、需要大量细胞样品的缺点。
5.荧光纳米探针具有非侵入性、高选择性、实时动态化监测、分析速度快、可视化等优势，可实现细胞层面的高灵敏度、原位、无损分析，在检测mirna和细胞凋亡相关蛋白标志物方面备受青睐。但现有的荧光成像法只实现了活细胞水平对mirna或细胞凋亡的单一检测，均不能可视化监测mirna表达量的变化对细胞凋亡的影响。因此，有必要开发能实时原位检测细胞内mirna和细胞凋亡的荧光探针，这对研究mirna靶向治疗方法的可行性和实现癌症患者的精准个性化治疗具有重要的临床意义。


技术实现要素：

6.基于上述技术问题，本发明提供一种复合荧光纳米探针及其制备方法和应用，该复合荧光纳米探针可在活细胞中对mirna和细胞凋亡标志物进行同时检测，实时原位监测mirna表达量的变化对细胞凋亡的影响。
7.为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明的第一个方面，提供一种复合荧光纳米探针，其同时检测活细胞内mirna和细胞凋亡标志物，是以aunps为核、pda为壳的复合材料，在pda表面修饰标记有不同荧光染料的ssdna和肽链；其中，ssdna可以特异性的响应mirna，肽链可以被凋亡标志物特异性裂解。
9.金纳米颗粒(aunps)和聚多巴胺(pda)具有良好的荧光猝灭作用以及生物相容性，
将该探针设计为以aunps为核，pda为壳的复合材料，pda涂层可以保护金纳米粒子，使其更稳定，且pda表面丰富的儿茶苯酚和氨基基团更便于后续的修饰。
10.基于静电作用和π-π吸附，在pda表面修饰标记有不同荧光染料的ssdna和肽链。在没有靶标的情况下，aunps和pda能有效地猝灭ssdna和肽链上所修饰染料的荧光；在遇到相应靶标mirna和凋亡标志物时，ssdna会与靶链形成双链，肽链被切断，此时荧光团远离pda表面，荧光得到恢复。因而所设计的复合纳米探针可以对mirna和凋亡过程进行同时检测，进而在活细胞内实时监测mirna对细胞凋亡的调控。
11.本发明一个具体的实施方式中，荧光染料可选自hex、cy3、cy5、quasar 570、rox、fitc、cy5.5中的两种。
12.本发明一个具体的实施方式中，ssdna由cy5标记，序列为5
’‑
cy5-tcaacatcagtctgataagcta-3’，肽链由fitc标记，序列为fitc-gly-gly-asp-glu-val-asp-gly-gly-cys。
13.本发明的第二个方面，提供上述复合荧光纳米探针的制备方法，其包括如下步骤：
14.(1)将金纳米颗粒aunps加入至多巴胺溶液中搅拌，制备得到多巴胺包裹的金纳米颗粒au@pda；
15.(2)多巴胺包裹的金纳米颗粒au@pda重新分散于水形成au@pda nps溶液，将标记有不同荧光染料的ssdna和肽链分先后加入到au@pda nps溶液中并孵育，纯化后即得修饰有ssdna和肽链的复合纳米探针au@pda-ssdna-peptide。
16.本发明一个具体的实施方式中，步骤(1)中，纳米金颗粒aunps采用柠檬酸钠还原法制备得到，具体为：
17.将haucl4水溶液边搅拌边加热至沸腾后，迅速加入柠檬酸钠水溶液并剧烈搅拌，反应一段时间后，停止加热，使反应液冷却至室温，即得纳米金颗粒aunps溶液；
18.其中，haucl4水溶液的浓度为0.01～0.5wt％，柠檬酸钠水溶液的浓度为0.5～5wt％，haucl4水溶液与柠檬酸钠水溶液的体积比为100：0.5～5；
19.优选的，haucl4水溶液的浓度为0.01wt％，柠檬酸钠水溶液的浓度为1wt％；haucl4水溶液与柠檬酸钠水溶液的体积比为100：2；
20.优选的，所述反应时间为10～60min，更有选为15min。
21.本发明一个具体的实施方式中，步骤(1)中，多巴胺溶液的制备方法为：将盐酸多巴胺溶解于10mmtris-hcl溶液中；多巴胺溶液的浓度为0.05～0.5mg/ml，优选为0.125mg/ml；
22.金纳米颗粒aunps溶液浓度为0.01～0.5nm，优选为0.125nm；
23.所述金纳米颗粒aunps溶液和多巴胺溶液体积比为2:1～1:2；
24.或，搅拌反应时间为0.5～2h，优选为1h；
25.或，分离纯化方法为离心分离纯化，离心条件为8000～15000rpm，5～15min；优选的，离心条件为13000rpm，10min。
26.本发明一个具体的实施方式中，步骤(2)中，先将ssdna溶液加入到au@pda溶液中进行孵育，再加入肽链溶液，继续孵育；优选的，au@pda溶液的制备方法为：将au@pda分散于10mm hepes溶液中，hepes溶液中含有5mm cacl2，ph7.4；
27.其中，au@pda溶液、ssdna溶液、肽链溶液的浓度比为：20nm：0.5～5μm：0.2～5μm，
体积比为2：0.5～2：0.5～2；
28.优选的，au@pda溶液、ssdna溶液、肽链溶液的浓度比为：20nm：1.2μm：2μm，体积比为2：1：1；
29.或，所述分离纯化方法为离心，离心条件为8000～15000rpm，5～15min；优选的，离心条件为13000rpm，10min。
30.本发明的第三个方面，提供上述复合荧光纳米探针在制备检测mirna和/或细胞凋亡标志物产品中的应用。
31.本发明一个具体的实施方式中，上述产品使用时，采用激发波长为648nm、发射波长为667nm，激发波长为480nm、发射波长为520nm，进行荧光强度的检测。
32.本发明一个具体的实施方式中，上述产品为试剂盒。
33.本发明的一个具体的实施方式中，上述产品的检测对象为活细胞，优选的，所述活细胞为肿瘤细胞，所述肿瘤细胞包括胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌细胞。
34.上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
35.(1)本发明设计合成了一种新型的复合纳米荧光探针，实现了活细胞内癌症标志物mirna-21和凋亡标志物caspase-3的监测与成像，所构建的荧光探针克服了传统分子生物学方法的局限性，能够在活细胞水平同时监测mirna-21和caspase-3表达量的变化且没有相互的干扰。
36.(2)荧光成像结果表明，探针能够通过双色成像可视化实时监测mirna表达量的变化对细胞凋亡的影响。该设计策略不仅提供了一种原位监测mirna调控癌细胞凋亡的新方法，同时也为研究mirna靶向治疗方法的可行性，研发以mirna为靶点的抗癌新药及制定精准个性化治疗方案提供极为重要的参考信息，具有重要的科学研究意义和临床应用价值。
附图说明
37.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
38.图1为实施例1制备得到的aunps(a)和au@pda nps(b)的tem图像；(c)aunps、au@pda和au@pda-dna-peptide的紫外可见吸收光谱图；(d)aunps和au@pda的动态光散射图；(e)zeta电位表征。
39.图2为au@pda nps对ssdna的猝灭曲线(a)，au@pda-ssdna nps对peptide的猝灭曲线(b)；
40.图3为复合纳米探针对靶链target-21的动力学实验结果；
41.图4为复合纳米探针对不同浓度的靶链mirna-21的响应(a)以及靶链mirna-21浓度与荧光强度的关系图(b)(插图：当mirna-21浓度在0-75nm时，mirna-21浓度与荧光强度呈线性相关)；
42.图5为复合纳米探针对重组蛋白caspase-3的动力学实验结果；
43.图6为复合纳米探针对不同浓度的caspase-3的荧光响应；
44.图7为复合纳米探针的特异性实验结果；
45.图8为复合纳米探针在hela细胞中的细胞毒性实验结果；
46.图9为复合纳米探针在hela细胞中的clsm成像；
47.图10为复合纳米探针在hela细胞中的clsm成像。
具体实施方式
48.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
49.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
50.以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。以下各实施例中所用的原料都可通过商购获得，所用的设备均为现有设备。
51.实施例
52.1.多巴胺包裹的金纳米颗粒(au@pda)的制备
53.首先合成金纳米颗粒(aunps)作为纳米探针的核心，随后通过多巴胺的原位聚合，在aunps表面包裹一层聚多巴胺(pda)外壳。
54.根据以前文献报道的方法合成了金纳米颗粒(aunps)：100ml 0.01wt％的haucl4水溶液边搅拌边加热至沸腾后，迅速加入2ml 1wt％的柠檬酸钠水溶液并剧烈搅拌。15分钟后，停止加热，使反应溶液冷却至室温。将制备好的aunps在4℃下保存备用。
55.在制备好的aunps上包裹pda外壳：首先将1mg盐酸多巴胺溶解在8ml10mmtris-hcl(ph8.5)中，8ml 0.125nmaunps溶液与上述多巴胺溶液在室温下快速搅拌1小时。将制备好的au@pda重复离心纯化(13000rpm，10min)，纯化后的au@pda重新分散在超纯水中备用。
56.透射电子显微镜(tem)结果显示，金纳米颗粒的形貌、分散性良好，尺寸均匀，粒径为18
±
3nm(图1a)，包裹的pda外壳的厚度为10
±
2nm，复合纳米探针aunp@pda的尺寸约为32
±
3nm(图1b)。此外，紫外可见吸收光谱(uv-vis)分析结果表明，aunps包覆了pda外壳后，最大吸收峰值从530nm红移到540nm(图1c)，进一步说明pda成功的涂覆到aunps表面。动态光散射(dls)测量结果显示au@pda nps的直径为32.7
±
5nm(图1d)，与tem数据结果相近。通过zeta电位结果进一步证实了纳米探针的修饰过程，如图1e所示，au的电位-7.9mv，包裹pda后，电位下降到-13.2mv，当修饰上ssdna和peptide后，电位又增加至-5.1mv，这些结果进一步表明复合纳米探针已成功制备。
57.2.荧光猝灭实验
58.为了实现细胞内mirna和凋亡蛋白的同时检测和成像，设计了cy5修饰的ssdna和fitc修饰的肽链，分别可以特异性靶向检测mirna-21和caspase-3。因为pda表面含有丰富的儿茶苯酚和氨基基团，可以通过π-π吸附和静电作用将ssdna和肽链分步修饰在pda表面。aunps和pda均具有高的荧光猝灭作用，因而可以将修饰在纳米材料表面的ssdna和肽链上的染料荧光猝灭。
59.为了成功制备复合纳米探针，使荧光被有效猝灭，将cy5修饰的ssdna(150nm)加入
到不同浓度的au@pda nps溶液中(10mm hepes，5mm cacl2，ph7.4)。分别在648nm的激发波长下收集cy5在667nm处的荧光强度，以确定au@pda的最佳用量。如图2a所示，13
×
10-4
nmol的au@pdanps能够将150nmssdna的荧光完全猝灭。
60.将fitc修饰的肽链(250nm)加入到不同浓度的au@pda-ssdna nps溶液中(10mm hepes，5mmcacl2，ph7.4)。分别在480nm的激发波长下收集fitc在520nm处的荧光强度，以确定au@pda-ssdna nps的最佳用量。如2b图，当au@pda nps浓度为20
×
10-4
nmol时，肽链修饰的fitc荧光被完全猝灭，所以选择了最终量为20
×
10-4
nmol的au@pda nps。
61.3.复合纳米探针的制备
62.根据上述荧光猝灭实验的结果，取50μl 1.2μm的ssdna21溶液加入到100μl20nm的aunp@pda溶液中在室温下孵育3小时后，再加入50μl 2μm的肽链在室温下继续孵育3小时，离心纯化后分散在10mm hepes缓冲溶液(5mm cacl2、ph7.4)中，即得到修饰有ssdna和肽链的复合纳米探针(au@pda-ssdna-peptide)。根据紫外可见吸收光谱显示(图1c)，复合纳米探针与au@pda nps相比在550nm附近出现了轻微红移，进一步说明ssdna和肽链已成功修饰在纳米探针表面。
63.4.复合纳米探针的荧光响应
64.为了检测探针上修饰的ssdna对dna靶链的荧光响应，将上述实验合成的复合纳米探针分别加入不同浓度的完全匹配的mirna-21靶链(0、10、20、30、40、50、75、125、250、750、1500nm)，在37℃下孵育1小时。分别在648nm的激发波长下收集cy5在667nm下的荧光强度。
65.为了检测复合探针上修饰的肽链对caspase-3蛋白的荧光响应，在hepes缓冲体系(10mm，ph7.4，50mm edta，100mm dtt)中，将合成的复合纳米探针分别加入0、1、2、3、4unit的重组蛋白caspase-3，37℃孵育4小时，分别在480nm的激发波长下收集fitc在520nm处的荧光强度。为保证实验结果可靠性，实验重复三次。
66.结果显示，随着完全匹配靶链target-21浓度(0-1500nm)的逐渐增加，ssdna上标记的cy5荧光信号也在逐渐增加(图4a)，且在target-21浓度为0-75nm时，荧光强度与靶链浓度呈线性相关(图4b)。同样的，随着caspase-3蛋白浓度(0-4unit)的逐渐增加肽链上标记的fitc的荧光强度也在逐渐增加(图6)，且荧光强度与caspase-3浓度呈线性相关。上述结果表明荧光信号的恢复是由于复合纳米探针与相应的dna靶链和caspase-3蛋白发生了反应。
67.5.复合纳米探针的动力学实验
68.在终浓度为5nm的复合纳米探针溶液中，分别加入终浓度为1000nm的完全匹配的mirna-21靶链，在37℃下分别孵育0、5、10、15、20、30、40、50、60分钟后，分别在激发波长648nm下收集cy5在667nm处的荧光强度。
69.在终浓度为5nm的复合纳米探针溶液中，分别加入4unit的重组蛋白caspase-3，37℃下分别孵育0、0.5、1、1.5、2、3、4小时后，分别在激发波长480nm处收集fitc在520nm处的荧光强度。重复实验三次。
70.结果表明，复合纳米探针对完全互补配对的mirna-21靶链在10min内就能产生快速响应，并在30min后逐渐趋于平衡(图3)；对caspase-3的荧光响应也随着时间的增加在逐渐增加，且在3h后基本达到平衡(图5)。结合荧光响应实验，说明所制备的复合纳米探针能够实现对mirna-21和caspase-3蛋白的同时检测。
71.6.复合纳米探针的特异性实验
72.在研究复合纳米探针上ssdna识别特异性实验中，分析了其他干扰物质对探针的影响。在探针溶液中分别加入500nm过量的与ssdna完全互补的mirna-21靶链、碱基错配的dna靶链、mirna-221、ki-67，37℃避光孵育1小时后，分别在激发波长648nm处收集cy5在667nm处的荧光强度；为了检测肽链的特异性，在探针溶液中分别加入3unit的重组蛋白caspase-3、4μg/ml的血红蛋白(hgb)、4μg/ml的牛血清蛋白(bsa)、1mm的谷胱甘肽(gsh)、20mm的葡萄糖(glu)、2mm的cacl2、100mm的nacl，37℃避光孵育4小时后，分别在激发波长480nm处收集fitc在520nm处的荧光强度。所有实验重复操作三次。
73.结果如图7。图7a中，与对照相比，错配靶链、target-221、target-67都显示出较小的荧光变化，而与ssdna完全互补的靶链target-21有明显的荧光响应；复合纳米探针对caspase-3蛋白检测的特异性实验，结果表明(图7b)，血红蛋白(hgb)、牛血清蛋白(bsa)、谷胱甘肽(gsh)、葡萄糖(glu)、cacl2、nacl等干扰物质与对照相比没有明显的荧光变化，而caspase-3有很强的荧光响应。特异性实验结果表明本发明所设计的复合纳米探针能够同时选择性的检测mirna-21和caspase-3蛋白，具有良好的特异性。
74.7.细胞培养
75.本实验用到的所有细胞均在高糖型dmem培养液(含1％、100u/ml的青霉素/链霉素，10％的胎牛血清)，37℃，5％co2的细胞培养箱中进行培养。
76.8.mtt实验
77.为了评估复合纳米探针在生物体系应用的可行性，利用mtt方法检测探针在hela细胞中的生物毒性情况。细胞经胰酶消化后，在96孔板上每孔接种200μl的细胞悬液(细胞密度约1
×
106个细胞/孔)培养24h，使细胞充分贴壁后弃去旧的培养基，分别加入不同浓度的au@pda和au@pda-ssdna-peptide(0.2、0.5、1、1.5、2nm)溶液孵育，24h后，每孔加入10μl mtt溶液(5mg/ml)，4h后，除去含有mtt的培养液，在每孔加入150μl dmso溶解甲瓒晶体，并用酶标仪测量溶液在490nm波长处的吸光度。结果显示(图8)，将不同浓度的复合纳米探针(0.2nm、0.5nm、1nm、1.5nm、2nm)分别与细胞孵育24小时后，细胞存活率都高于95％，表明该复合纳米探针细胞毒性较小，具有良好的生物相容性，可以用于活细胞的检测和成像。
78.9.荧光共聚焦成像实验
79.9.1药物处理
80.为了研究复合纳米探针对活细胞中mirna-21和caspase-3蛋白同时检测的可行性，考察复合纳米探针对癌症标志物mirna-21和凋亡标志物caspase-3蛋白同时检测的情况。
81.mirna-21作为癌症标志物在癌细胞中的表达水平较高，而caspase-3蛋白作为凋亡标志物在癌细胞凋亡过程中表达较高。分别用脂多糖(lps)和十字孢碱(sts)处理两种癌细胞，脂多糖能促进细胞引起炎症反应，而十字孢碱能促进细胞凋亡。
82.将hela接种在共聚焦皿中，孵育培养24h。分别加入终浓度为10μg/ml的脂多糖(lps)和0.1μm的十字孢碱(sts)处理12h后，加入终浓度为20nm的复合纳米探针继续孵育培养4h。用pbs缓冲液洗涤三次后进行clsm成像，分别在480nm波长和647nm波长处收集500-600nm和660-700nm处的荧光强度。观察细胞中用于检测mirna-21的cy5的红色荧光信号和用于检测caspase-3蛋白的fitc的绿色荧光信号(如图9)，结果表明，用lps处理后的hela细
胞，红色荧光信号与对照组相比明显增强，经sts处理后的细胞绿色荧光信号与对照组相比明显增强，而红色荧光信号有所减弱。以上结果表明，所制备的复合纳米探针可用于细胞中mirna-21和caspase-3蛋白的同时检测。
83.9.2转染试剂处理
84.为了进一步考察复合纳米探针实时监测活细胞内mirna对细胞凋亡调控的可行性，选用hela细胞，通过向癌细胞转染mirna-21模拟物和抑制物来改变mirna-21的表达量，并进一步研究对caspase-3表达量变化的影响。
85.转染前一天，将细胞接种在共聚焦皿中，使转染时细胞密度达到30％-50％。每皿加入用opti-mem无血清培养基稀释的100pmol100μlmirna模拟物或500pmol100μlmirna抑制物，100μl opti-mem稀释2μl转染试剂lipofectamine 2000在室温孵育5min，与稀释好的mirna模拟物或抑制物混合，室温下孵育20min后加入到细胞中孵育48h，加入终浓度为20nm的复合纳米探针继续孵育培养4h。用pbs缓冲液洗涤三次后进行clsm成像，分别在480nm波长和647nm波长处收集500-600nm和660-700nm处的荧光强度。如图10所示，在hela细胞中，转染mirna-21模拟物的细胞与对照组相比，修饰在ssdna上的cy5红色荧光信号明显增强，而转染mirna-21抑制物的细胞与对照组相比，cy5的红色荧光信号减弱，且修饰在肽链上的fitc绿色荧光信号有增强。这些结果均表明在hela细胞中，降低mirna-21的表达量可以引起癌细胞的凋亡，我们所制备的复合纳米荧光探针完全可以在活细胞水平，可视化监测mirna表达量的变化对细胞凋亡的影响。
86.最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。