一种对温度耐受性强的裂解酶、制备方法及应用

1.本发明属于新的抗生素替代品技术领域，尤其涉及一种对温度耐受性强的裂解酶、制备方法及应用。


背景技术：

2.目前，抗生素耐药是目前世界上共同面临的难题，寻找新的抗生素替代物迫在眉睫。很多细菌能形成生物膜，生物膜是细菌及其代谢物形成的一种群体结构，有助于细菌的粘附、定植，生物膜使细菌对外部环境及抗菌药物的耐受增大数百倍。
3.肠球菌属是广泛存在于自然界、人及动物肠道中的一种革兰染色阳性球菌，肠球菌是常见的医院内感染菌，可以引起机体多器官系统感染。肠球菌耐药严重，治疗困难，耐万古霉素的肠球菌位列who2017年发布的亟待开发新抗菌药物的细菌名录中的第三位。肠球菌形成生物膜是其耐药性形成的重要原因之一。在肠球菌引起的医院内感染中，粪肠球菌(enterococcus faecalis)所占比例最高。而且在食品工业中，特别是发酵类奶制品生产中，大量肠球菌滋生除了可导致食品变质外，还可生大量生物胺，过量生物胺可以引起偏头痛等多种疾病和症状。
4.葡萄球菌属细菌也是常见的临床感染细菌，包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophyticus)、溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)及头葡萄球菌(staphylococcus capitis)等。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，mrsa)及耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant staphylococcus aureu，vrsa)更是被称为超级细菌，引起的感染更是很难治疗。
5.噬菌体是一种感染细菌的病毒，按照其感染细菌后的结果可分为裂解性噬菌体和溶原性噬菌体。裂解性噬菌体可以快速、特异性的裂解细菌，但由于噬菌体严格的宿主特异性，导致其具有种甚至型特异性，只对特定菌株有效，也导致噬菌体本身的应用受到了限制。
6.噬菌体裂解酶，是由噬菌体基因组编码的可裂解细菌细胞壁保守结构的一类酶。相对于噬菌体本身，裂解酶通常具有更宽的裂解谱；但是，具有跨种属裂解细菌活性的裂解酶不易获得，目前已报道的肠球菌裂解酶多为只裂解肠球菌属细菌的裂解酶。不断分离新的噬菌体，从中寻找具有更宽裂解谱宽的裂解酶，或设计、改变裂解酶基因及结构以寻找稳定性高、裂解效率高、裂解谱宽的裂解酶；并改善裂解酶表达及生产效率是应用裂解酶对抗耐药菌感染不可逾越的环节之一。
7.目前发现的大多数裂解酶对温度的耐受性普遍性不强；且通过工程菌表达的裂解酶如果为胞内蛋白，一般通过超声破碎表达细菌获得，而超声伴有大量的热产生，虽可以在冰上操作，可以散去一部分热量，但仍不能避免蛋白的损失。制备能分泌到表达细菌细胞外、相对对温度耐受性强的裂解酶既可以简化制备方法又可以提高制备效率。
8.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前发现的裂解酶多对温度的耐受性不强，且大多为胞内蛋白，通过超声破碎表达细菌获得裂解酶的方法中伴有大量的热产生，会导致蛋白的损失；另外可以跨种属裂解细菌的噬菌体裂解酶也不常见。


技术实现要素：

9.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对温度耐受性强的裂解酶、制备方法及应用，尤其涉及一种耐高温的可跨种属裂解粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌(staphylococcus hominis)、科氏葡萄球菌(staphylococcus cohnii)、克氏葡萄球菌(staphylococcus kloosii)及沃氏葡萄球菌(staphylococcus warneri)的裂解酶的制备及应用。
10.本发明是这样实现的，一种对温度耐受性强的裂解酶lys22，所述对温度耐受性强的裂解酶c端带有6个组氨酸标签，所述裂解酶的编码序列为seq id no：1。
11.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的对温度耐受性强的裂解酶lys22的制备方法，所述对温度耐受性强的裂解酶lys22的制备方法包括以下步骤：
12.步骤一，人工合成编码该发明中裂解酶lys22的编码序列，双限制性内切酶消化回收后插入原核表达载体pet-28a( )质粒中。
13.步骤二，通过热休克法将质粒转化入表达蛋白的工程细菌大肠杆菌bl21中，筛选阳性克隆，并将所述阳性克隆进行pcr扩增及测序验证序列的正确性。
14.步骤三，将阳性克隆菌株接种于含卡那霉素的lb液体中培养至对数期，加入iptg，诱导，将得到的培养液离心，得上清液。
15.步骤四，将所述上清液先经100kda超滤管过滤离心，收集滤液，以去除大分子量大于100kda的杂质。
16.步骤五，将得到的滤液于10kda的超滤管进行离心浓缩，洗脱存在于滤膜上层的蛋白，弃滤液。
17.步骤六，浓缩蛋白经镍柱纯化，纯化后的蛋白经过sdspage进行验证。
18.进一步，所述步骤二中的筛选阳性克隆包括：
19.利用含有50μg/ml卡那霉素的固体lb平板上筛选阳性克隆。
20.进一步，所述步骤三中的lb液体中含有50μg/ml的卡那霉素；所述培养条件为150r/min、37℃；所述诱导条件为20℃、诱导16h；所述离心条件为4℃、10000r/min离心30min。
21.进一步，所述步骤三中的对数期为od600＝0.5～0.6。
22.进一步，所述步骤三中，加入iptg，使得iptg的终浓度为1mm。
23.进一步，所述步骤四中，将得到的上清用0.22μm的膜过滤后，再用100kda超滤管于4℃、6000r/min、离心15min，收集滤液。
24.进一步，所述步骤五中，是对裂解酶lys22进行浓缩和纯化，具体做法是将步骤四中获得的滤液，用10kda超滤管于4℃、6000r/min、离心15min，弃滤液，用tris-hc缓冲液洗脱滤膜，得到的洗脱液用ni-nta对lys22进行纯化。
25.本发明的另一目的在于提供一种所述的裂解酶lys22在跨属裂解细菌中的应用。
26.进一步，所述细菌包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、
人葡萄球菌、科氏葡萄球菌、克氏葡萄球菌以及沃氏葡萄球菌。
27.本发明的另一目的在于提供一种可耐受75℃温度的裂解酶lys22，将等量裂解酶lys22分别置于不同温度中处置，之后以肠球菌为宿主菌检测其裂解活性变化。发现，该裂解酶经过55℃、65℃和75℃处理30min后，对肠球菌的裂解活性相较于37℃可保持在94％，43％，26％；这可能是因为在该裂解酶的三维结构中存在锌离子结合结构域，该结构域由两个组氨酸和一个天冬氨酸组成，金属离子的结合既是发挥该裂解酶裂解细菌活性的需要，也可以提高该裂解酶的热稳定性。
28.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
29.第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
30.(1)应用iptg诱导是提高蛋白原核表达量的常规方法，通常在使用iptg诱导时还要摸索iptg的作用浓度和作用时间。但本发明在实验中发现即使不使用iptg诱导，这个蛋白(裂解酶lys22)也可大量表达。
31.(2)通常这类蛋白在表达的工程菌的细胞内(bl21)，所以在制备时要收集工程菌，需要把工程菌破碎来提取蛋白，最常采用的是超声破碎，既费时又会因为产热而损失一部分蛋白，而且在破碎的产物中通常混有大量的细菌碎片和结构成分，包括内毒素；因为内毒素是工程菌细胞壁的成分，随着细菌的破碎会大量释放出来。而本发明这次发现在工程菌的培养上清中就含有大量的裂解酶lys22，可以直接收集上清进行裂解酶蛋白的提取，不用破碎工程菌细胞。
32.(3)因为本发明的目标裂解酶lys22的分子量大约为45kda，在提取裂解酶lys22过程中，本发明采用了两步的分子筛超滤，第一步用孔径为100kda的超滤管过滤细菌培养上清，留取滤液，可以过滤掉包括内毒素在内的分子量大于100kda的分子；第二步，用孔径为10kda或20kda的超滤管过滤，收集洗脱滤膜上的蛋白，起到浓缩裂解酶lys22的作用；然后再用镍柱纯化，利用其c端的组氨酸标签来富集并进一步纯化裂解酶lys22；两步超滤会起到降低背景中也可能含有多组氨酸的其他蛋白质的干扰作用，而且在4℃条件下超滤浓缩可以有效保持蛋白活性。
33.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
34.本发明在实验中发现，裂解酶lys22是可以跨属裂解细菌的，它不仅扩大了对原来的宿主菌粪肠球菌的裂解能力，并且可以跨属裂解葡萄球菌，而且在葡萄球菌属内，居然可以裂解多个种的细菌，这个功能是非常少见的；而且它还可以裂解一些耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(mrsa)和/耐万古霉素(vrsa)的金黄色葡萄球菌(超级细菌)。
35.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
36.(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：a.临床治疗葡萄球菌属(多种)和粪肠球菌感染，包括皮肤外用的油膏、凝胶或喷雾类制剂；及膀胱、尿道、阴道及口腔等的灌洗液；b.未来在国家相关产业标准或安全性评估建立的情况下，也可以作为静脉滴注型药物使用来控制葡萄球菌和肠球菌感染；c.添加在养殖业相关的禽、畜饲料中或作
为禽畜类药物防控葡萄球菌和粪肠球菌感染；d.在食品生产中，添加在相应的食品中，可以防控或抑制葡萄球菌及粪肠球菌的污染。
37.(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：a.跨种属细菌裂解作用，特别是对葡萄球菌属包括超级细菌在内的多种细菌的裂解作用；b.对温度55℃、65℃、甚至75℃的温度有较强的耐受性，有利于增强未来可能生产的各种不同制剂或产品的稳定性，并延长保质期，以及扩展其应用的范围和领域。
38.(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：生产裂解谱广、裂解效率高及热稳定性强，生产工艺相对简单的裂解酶。
附图说明
39.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
40.图1是本发明实施例提供的对温度耐受性强的裂解酶lys22的制备方法流程图。
41.图2是本发明实施例提供的带标签的经过预测的裂解酶lys22的三维结构示意图。
42.图3a是本发明实施例提供的载体结构图。
43.图3b是本发明实施例提供的纯化后裂解酶lys22蛋白的sdspage验证结果示意图。
44.图4是对本发明实施例所用葡萄球菌的裂解效果及包括粪肠球菌在内的菌株证明材料。
45.图5是本发明实施例提供的裂解酶lys22热稳定性图(d)及其在edta(a)nacl(b)、及不同ph(c)中的稳定性。
46.图6是本发明实施例提供的裂解酶lys22在生物膜形成不同时段中对浮游细菌的抑制作用示意图。
47.图7是本发明实施例提供的裂解酶lys22在生物膜形成不同时段对生物膜的抑制作用示意图。
48.图8是本发明实施例提供的a裂解酶lys22对成熟生物膜的作用；b裂解酶lys22对成熟生物膜体系中浮游细菌的抑制；c裂解酶lys22对孔底部粪肠球菌成熟生物膜的影响(结晶紫染色图)。
49.图9是本发明实施例提供的利用人的牙本质切片作为载体或基质验证裂解酶lys22对于敏感细菌-粪肠球菌形成生物膜的抑制。
50.图10是本发明实施例提供的利用人的牙本质切片作为载体或基质验证裂解酶lys22对已经形成的粪肠球菌成熟生物膜的破坏作用。
具体实施方式
51.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
52.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对温度耐受性强的裂解酶、制备方
法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
53.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
54.如图1所示，本发明实施例提供的对温度耐受性强的裂解酶的制备方法包括：
55.s101，设计、编辑及预测带标签裂解酶的序列，利用人工合成方法获得氨基酸的编码序列，并将其用双限制性内切酶消化回收后插入原核表达载体pet-28a( )质粒中；
56.s102，通过热休克法将质粒转化入表达蛋白的工程细菌大肠杆菌bl21中，筛选阳性克隆，并将所述阳性克隆进行pcr扩增及测序验证序列的正确性；
57.s103，将阳性克隆菌株接种于卡那霉素的lb液体中培养至对数期，加入iptg，诱导，将得到的培养液离心，得上清液；也可不用iptg诱导，获得的上清液中也含有裂解酶；
58.s104，将所述上清液过滤、离心，收集滤液，将得到的滤液依次经100kda和10kda的超滤管进行过滤和浓缩；之后经镍柱纯化，纯化后的蛋白经过sds-page进行了验证。
59.本发明提供了一种对温度耐受性强的裂解酶、制备方法及应用，尤其涉及一种耐高温的可裂解粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(staphylococcus hominis)、科氏葡萄球菌(staphylococcus cohnii)、克氏葡萄球菌(staphylococcus kloosii)及沃氏葡萄球菌(staphylococcus warneri)的裂解酶的制备及应用。
60.1.本发明带有6个组氨酸标签的裂解酶编码序列seq id no：1为：
61.met lys leu lys gly ile leu phe glyala leuala thr ile gly leu
62.aspala gly met glythralaasnalatyr gluvalasnasn glu phe
63.asn leu serpro trp glu gly ser glyalavalalaval proasn lys
64.ile ile leu his gluthralaasn gluargalathr glyargasn glu
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66.val glyasp gly gly ile val tyr lys ileala pro glu glyasn ile
67.sertrp glyala glyasnalaasnpro tyralapro ile gln ile glu
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69.tyr ileasp tyrthrargasp met gly lys lys phe gly ile pro met
70.thr leuasp gln gly ser serval trp glu lys glyval ile ser his
71.lys trp val serasp tyrval trp glyasp his thrasp pro tyr gly
72.tyr leuala glu met gly ile ser lys ala gln leuala lysasp leu
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74.lys pro thr glnpro lys proala glnpro serlys pro serasp lys
75.lysarg pheasn tyrargvalasp gly leu glutyrvalasn gly met
76.trp gln ile tyrasn glu his leu gly lys ileasp pheasn trp thr
77.aspasn gly ile pro val gluval valasp lys valasn proala thr
78.gly glnpro thr lysasp glnval leu lys val glyasp tyrpheasn
79.phe gln gluasn serthr glyvalval gln glu gln thrpro tyrasn
80.glytyrthr leu serhis val gln leu pro glu glu phe ile trp leu
81.phe thrasp ser lys glnala leumet tyr gln his his his his his
82.his
83.本发明实施例通过在线的swiss-model server预测了加了标签的蛋白的结构，仍然保有与原来的蛋白类似的结构，特别是构成锌离子结合结构域的氨基酸的空间构型也相对稳定。而且加入组氨酸标签可以使后续的获得蛋白的程序更为简单。而且经过功能验证之后发现带标签的裂解酶的活性仍然很好。图2是带标签的经过预测的裂解酶的三维结构，锌离子结合结构域的三个重要氨基酸已经被标示出来。
84.2.本发明提供的表达方法如下：
85.步骤一：将上述氨基酸的编码序列通过人工合成方法获得，之后经双限制性内切酶消化回收后插入原核表达载体pet-28a( )质粒中(图3a，载体结构图)，通过常规的热休克法将质粒转化入表达蛋白的工程细菌大肠杆菌bl21中，用含有50μg/ml卡那霉素的固体lb平板上筛选阳性克隆，筛选得到的阳性克隆进行pcr扩增及测序来验证序列的正确性。
86.步骤二：将阳性克隆菌株接种于含有50μg/ml卡那霉素的lb液体中，150r/min、37℃培养至对数期(od＝0.5-0.6)，向其中加入iptg，使得iptg的终浓度为1mm，20℃、诱导16h，得到的培养液于4℃、10000r/min离心30min，得到的上清用0.22μm的膜过滤，用100kda超滤管于4℃、6000r/min、离心15min，收集滤液，将得到的滤液于10kda的超滤管进行浓缩，即4℃、6000r/min、离心15min，用tris-hc缓冲液进行洗脱，0.22μm的膜过滤，得到的洗脱液用ni-nta对裂解酶进行纯化，纯化后的蛋白经过sds-page进行了验证(见图3b)。
87.(1)应用iptg诱导是提高蛋白原核表达量的常规方法，通常在使用iptg诱导时还要摸索iptg的作用浓度和作用时间。但本发明在实验中发现即使不使用iptg诱导，这个蛋白(裂解酶)也可大量表达。(2)通常这类蛋白在表达的工程菌的细胞内(bl21)，所以在制备时要收集工程菌，把工程菌破碎来提取蛋白，最常采用的是超声破碎，既费时又会因为产热而损失一部分蛋白，而且在破碎的产物中通常混有大量的细菌碎片和结构成分，包括内毒素；因为内毒素是工程菌细胞壁的成分，随着细菌的破碎不可避免地会大量释放出来。而本发明这次发现在细胞外的上清中就含有大量的裂解酶，可以直接收集上清进行裂解酶蛋白的提取，不用破碎工程菌细胞。(3)因为本发明的目标裂解酶的分子量是约45kda，在提取裂解酶过程中，本发明采用了两步的分子筛超滤，第一步用孔径为100kda的超滤管低温(4℃)离心过滤细菌培养上清，留取滤液，可以过滤掉包括内毒素在内的分子量大于100kda的分子；第二步，用孔径为10kda或20kda的超滤管低温(4℃)离心过滤，收集洗脱滤膜上的蛋白，起到浓缩的作用。然后再用镍柱纯化，利用其组氨酸标签的作用来富集纯化蛋白。两步超滤会起到降低背景中也可能含有多组氨酸的其他蛋白质干扰的作用。
88.3.关于裂解酶的功能及应用
89.虽然裂解酶可能会比来源噬菌体的裂解谱(敏感细菌)要宽一些，但通常跨种、跨属来裂解细菌并不容易，在目前能检索到的文献中，具有如此宽的跨种属裂解功能的裂解酶并不多见。但本发明在实验中发现，这个裂解酶是可以跨属裂解细菌的，它不仅扩大了对原来的宿主菌粪肠球菌的裂解能力，并且可以跨属裂解葡萄球菌，而且在葡萄球菌属内，居然可以裂解多个种的细菌，这个功能是非常少见的。而且对该裂解酶敏感的葡萄球菌包括一些耐甲氧西林和/万古霉素的金黄色葡萄球菌(超级细菌)。
90.本发明实验中使用的细菌都是通过常规方法鉴定过的在实验室保存的细菌，每个
所用细菌都测定过16srdna序列，并被登录到genbank中，可通过检索获得细菌对应的该序列的唯一登录号(见图4)。所有细菌都可由发明实验室提供，并应用进化保守的16srdna序列进行鉴定。
91.图4是裂解酶lys22可以裂解的葡萄球菌的实验结果，每个细菌名称下括号里标注的内容即是细菌保守结构16srdna在genbank里的序列号，如ok642790。其中ok642790和ok642791是耐甲氧西林的mrsa菌株，ok642793和ok642796是既耐甲氧西林又耐万古霉素的mrsa和vrsa菌株、除了图4中涉及的葡萄球菌外，本发明中各实施例中所用的粪肠球菌的16srdna在genbank中登录序列号是mh236318。本发明实验室同时也保存有能被裂解酶lys22裂解的其他粪肠球菌菌株，其16srdna序列在genbank中登录号分别是mh236308、mh236312、mh236314、mh236328、mh362705、mh236319、mh236320、mh591461、mh236341、mh236325和mh236318。
92.除了图4中的应用，本发明还用人的牙本质切片作为载体或基质验证了这个裂解酶对于敏感粪肠球菌的形成生物膜形的抑制作用，和破坏成熟生物膜的功能(见图9，10)。
93.4.关于其耐高热的性质，图5中的d是对温度的稳定性，abc是对其他化学物质及ph值改变的稳定性。
94.本发明的裂解酶在55～56摄氏度(30分钟)的情况下杀菌活性没有明显的降低，在75摄氏度作用30分钟的情况下，仍可保持约25％左右的杀菌活性。。
95.二、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
96.实施例1裂解酶lys22对粪肠球菌生物膜形成及成熟生物膜的影响
97.1.裂解酶lys22对肠球菌对生物膜形成的影响
98.实施方法
99.(1)将粪肠球菌18(mh236318)培养物(od600＝0.5～0.6)与裂解酶lys22混合，使得裂解酶lys22的浓度为50μg/ml。
100.(2)按照100μl/孔的量向96孔板中加入混合液，分别培养至6h、12h、24h。
101.(3)分别取出菌液，用酶标仪测量菌液在600nm的吸光度，用于标定不同时段浮游细菌的浓度。
102.(4)用100μl的0.1％的pbs清洗三次培养孔，室温晾干。
103.(5)按照100μl/孔的量加入0.1％的结晶紫染色液，染色10min，吸出染色液。
104.(6)用0.1％的pbs缓冲液清洗三次，去除多余染料，室温风干，加入等体积的95％的乙醇脱色10min。
105.(7)用酶标仪检测570nm，每孔的吸光度，用于标定孔底生物膜的厚度。
106.结果
107.(1)裂解酶lys22对肠球菌生物膜形成过程中浮游细菌的抑制作用
108.如图6所示，与无裂解酶应用的对照组相比裂解酶lys22可以有效抑制浮游细菌的数量，使其od600显著低于无裂解酶对照组。
109.(2)裂解酶lys22在肠球菌生物膜形成不同时段对基底部生物膜的抑制作用
110.如图7所示，与无裂解酶lys22应用的对照组相比，在肠球菌生物膜形成的不同阶
段均可使生物膜在570nm的吸光度减低，证明基底部生物膜中存活的粪肠球菌数量降低，生物膜的形成受到了裂解酶lys22的抑制。
111.2.裂解酶lys22对粪肠球菌成熟生物膜的抑制作用
112.实施方法
113.(1)将实验菌株粪肠球菌18从零下80℃冰箱取出，细菌培养操作与上述方法一致，37℃振荡培养至菌落数为107cfu/ml(od600＝0.5～0.6)左右。
114.(2)将细菌培养液按照1ml/孔的量加入到24孔板中，于37℃培养至6h。(3)吸出菌悬液，用等体积的0.1m的pbs清洗三次，向其中加入裂解酶lys22，使得裂解酶的浓度为50μg/ml，对照组加入等体积的pbs，于37℃静置2h。
115.(4)取出处理液，用酶标仪测量处理液od600，以表示裂解酶对生物膜中浮游细菌的影响。
116.(5)用0.1m的pbs缓冲液清洗三次，室温晾干，按照1ml/孔量加入0.1％的结晶紫染色液，染色10min。
117.(6)吸出染色液，用0.1％的pbs缓冲液清洗三次，室温风干，加入等体积的95％的乙醇脱色10min。
118.(7)用酶标仪测量od570，以此计量孔底部生物膜的量，重复三次。
119.实施结果
120.如图8所示，经过裂解酶lys22处理的生物膜量明显少于对照组，裂解酶lys22添加组用od600明显低于对照组，说明裂解酶lys22可以抑制浮游细菌的生长(图8b)；对于孔底部生物膜的检测发现，裂解酶lys22添加组孔底的od570显著低于对照组，说明裂解酶lys22也能同时能破坏已形成的粪肠球菌成熟生物膜，并杀灭成熟生物膜中的细菌(图8a、c)。
121.实施例2裂解酶对粪肠球菌在牙本质上形成生物膜的抑制作用
122.1.裂解酶对粪肠球菌在牙本质上生物膜形成过程的影响
123.实施方法
124.(1)从口腔医院获得因正畸拔除的发育完全的牙齿，用金刚针去除牙冠。
125.(2)将牙本质用病理切片机制成5mm
×
5mm
×
1mm的切片。
126.(3)将得到的牙本质切片在121℃高压蒸汽灭菌20min。
127.(4)收集正常人口腔唾液，5000rpm离心10min，获取上清，并用0.22微米的滤膜过滤除菌。
128.(5)将高压蒸汽灭菌后的牙本质片浸泡于经滤过除菌的唾液中2h平衡表面离子环境。
129.(6)将牙本质片放置于24孔板底部；在24孔板中加入粪肠球菌培养液(od600＝0.5-0.6)与裂解酶lys22，使得裂解酶lys22的浓度为50μg/ml，使孔内液体总体积为1ml。
130.(7)将24孔板置于37℃培养箱中培养24小时，pbs清洗三次，晾干，2.5％的戊二醛固定30min。
131.(8)取出牙本质片进行乙醇梯度脱水，于扫描电子显微镜下观察。
132.实施结果
133.当添加裂解酶lys22与粪肠球菌共培养时，添加裂解酶lys22组粪肠球菌基本不能形成连续的成熟生物膜，能够存活的粪肠球菌较少，而且存活的粪肠球菌也失去了典型的
球菌形态和排列方式(图9)。这一结果说明裂解酶lys22能有效抑制粪肠球菌在牙本质上的粘附和生长，并抑制粪肠球菌形成生物膜。
134.2.裂解酶对牙本质上已形成的粪肠球菌成熟生物膜的影响
135.实施方法
136.牙本质标本片的制备方法同上
137.(1)将粪肠球菌，37℃振荡培养至对数期(od600＝0.5-0.6)。
138.(2)将细菌培养液按照1ml/孔的量加入到含有牙本质片的24孔板中，于37℃培养至6h。
139.(3)吸出菌悬液，用等体积的0.1m的pbs清洗三次，向其中加入裂解酶lys22，使得裂解酶的浓度为50μg/ml，对照组加入等体积的pbs，于37℃静置2h。
140.(4)取出处理，按照1ml/孔的量用pbs清洗三次，于室温晾干。
141.(5)向孔中加入1ml的2.5％的戊二醛，室温放置30min。
142.(6)将戊二醛固定液吸出，用pbs清洗三次，室温晾干。
143.(7)按照1ml/孔的量向其中依次加入70％、80％、90％、95％和100％的乙醇，分别处理15min，对牙本质片进行脱水处理。
144.(8)将牙本质片进行喷金处理，于描电子显微镜下观察并拍照。
145.实施结果
146.在培养6h已经形成成熟生物膜的粪肠球菌中添加裂解酶lys22，作用2h后，粪肠球菌生物膜基本被破坏，生物膜内的细菌被裂解杀灭；少量存活细菌失去了典型的粪肠球菌的形态和排列方式(图10)，说明裂解酶lys22能有效的穿透粪肠球菌的成熟生物膜，破坏生物膜结构，并裂解生物膜中的粪肠球菌。
147.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。