特异性抗烟草CMV病毒的dsRNA及其体外合成引物和抗病性的应用的制作方法

技术特征：
1.一种特异性抗烟草cmv病毒的dsrna，其特征在于，所述dsrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种用于体外合成权利要求1所述的特异性抗烟草cmv病毒的dsrna的引物对，其特征在于，正向引物cmp-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，反向引物cmp-r的核苷酸序列如seq id no.3所示。3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，分别在所述正向引物和所述反向引物的5'端添加了t7启动子序列；添加了t7启动子序列的正向引物cmp-t7f的核苷酸序列如seq id no.4所示，添加了t7启动子序列的反向引物cmp-t7r的核苷酸序列如seq id no.5所示。4.权利要求1所述的特异性抗烟草cmv病毒的dsrna的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、从感染cmv病毒的烟株叶片中提取烟草cmv病毒的总rna，以所述总rna为模板，反转录获得病毒样本的cdna；s2、以步骤s1所得cdna为模板进行pcr扩增，纯化回收目的片段；s3、将步骤s2纯化回收的目的片段连接至载体上，再将载体转入感受态细胞中，培养、扩增、诱导表达，挑取阳性克隆的mp蛋白进行测序，得到如seq id no.6所示的mp蛋白的核苷酸序列；s4、将如seq id no.6所示的mp蛋白的核苷酸序列与已有的cmv病毒的mp蛋白的核苷酸序列进行比对，选取保守性较高区域的核苷酸序列作为模板，设计如seq id no.2和seq id no.3所示的引物对，然后转录合成正义链ssrna和反义链ssrna，将所述正义链ssrna和反义链ssrna退火、纯化得到所述dsrna。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中pcr扩增的引物对为核苷酸序列如seq id no.7所示的正向引物cmv-mp-f和核苷酸序列如seq id no.8所示的反向引物cmv-mp-r。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中pcr扩增的反应体系为：5μl含mgcl2的10
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pcr buffer，1μl 10μmol/l dntps，1μl 10μmol/l正向引物，1μl10μmol/l反向引物，2μl cdna，4u taq dna聚合酶，加灭菌ddh2o补至总体积为50μl；pcr扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次后72℃延伸10min。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤s3的方法具体为：将步骤2中得到的目的片段连接至pmd-19t载体上，在16℃反应4h，将得到的重组载体转入dh5α感受态细胞中，冰上孵育30min后，在42℃下热激转化90s，加入液体lb培养液，置于37℃下200rpm的摇床中摇菌2h；吸取菌液至含有100mg/ml氨苄西林的lb固体培养基中，37℃培养过夜；挑取阳性克隆进行测序，得到如seq id no.6所示的mp蛋白的核苷酸序列。8.权利要求1所述的特异性抗烟草cmv病毒的dsrna的应用，其特征在于，将所述dsrna用于防治烟草cmv病毒。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，取所述特异性抗烟草cmv病毒的dsrna与用于cmv病毒接种的缓冲液混合配制成dsrna溶液，将所述dsrna溶液通过喷施或涂抹的方式接种到烟叶上。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述dsrna溶液的用法为按照每叶20μg dsrna的量将所述dsrna溶液喷施于烟叶上。

技术总结
本发明提供了一种特异性抗烟草CMV病毒的dsRNA及其体外合成引物和抗病性的应用，属于基因突变或遗传工程和烟草病虫害防治技术领域。本发明利用RNA沉默的原理，利用CMV病毒自身MP基因体外合成了一种能够特异性抗CMV病毒的dsRNA，该dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了该dsRNA在烟草CMV病毒防治时的应用方法，为烟草CMV病毒防治提供新思路，避免了化学用药的诸多弊端；该方法简单有效，不存在转基因安全风险，更容易进行大田推广应用。广应用。广应用。


技术研发人员：李锡宏 许汝冰 黎妍妍
受保护的技术使用者：湖北省烟草科学研究院
技术研发日：2022.03.31
技术公布日：2022/7/29